CN113215008B - 芽生葡萄孢酵母tn29及其在污水处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及微生物污水处理技术领域。本发明公开了一株芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)TN29，其保藏编号为CGMCC No.20966，该菌株已于2020年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为CGMCC No.20966。本发明公开菌株TN29是一株高效降解氨氮菌株，同时兼具协同去除COD的能力，该菌株对于COD、氨氮和总氮都有较好的降解作用。

Description

芽生葡萄孢酵母TN29及其在污水处理中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及微生物污水处理技术领域。
背景技术
污水中氨氮是水体中的营养素，可导致水富营养化现象产生，是水体中的主要耗氧污染物，对鱼类及某些水生生物有毒害，因此，针对污水高效脱氮的研究一直是污水处理领域的研究热点。
污水脱氮的生物处理特别是微生物处理法作为一种绿色高效且投入成本低的处理方法在近年来得到了广泛的研究与应用。该方法的核心问题是高效脱氮菌株的研发，通过功能菌株的生理代谢过程对污水中的氨氮进行高效的转化和降解，从而实现污水的脱氮。目前应用于污水脱氮处理的微生物资源主要是细菌，如假单胞菌、芽孢杆菌、产碱杆菌和副球菌等，而作为微生物另一重要组成部分的真菌，目前只挖掘出少数可用于脱氮处理的菌种资源，如葡萄有孢汉逊酵母、根瘤菌等。
与细菌相比，真菌脱氮在硝化反硝化速率、对抑制性化合物的抗性、提高脱氮工艺抗冲击负荷能力等方面往往表现更优秀(Guest et al.2002)，因此，挖掘更多高效生物脱氮的真菌菌种资源对促进传统生物脱氮工艺效率的提升及新型生物脱氮工艺的研究与应用具有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的是提供一株芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)TN29。
本发明的芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)TN29已于2020年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为CGMCC No.20966。
本发明提供的芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)TN29是一株高效脱氮真菌，第一次应用于污水微生物处理领域并且具有良好效果，其对氨氮有很好的降解作用，对COD和总氮也有明显的去除效果。
附图说明
图1为芽生葡萄孢酵母属真菌(Blastobotrys sp.)TN29形态图。
其中A是在PDA培养基上正面菌株形态图，B是体视显微镜20倍下菌丝形态图，C和D是光学显微镜10×40倍下孢子形态图。
图2为芽生葡萄孢酵母属真菌(Blastobotrys sp.)TN29基于26srDNA的LSU序列同源性构建的系统发育树。
图3为芽生葡萄孢酵母属真菌(Blastobotrys sp.)TN29对氨氮24h降解曲线。
图4为芽生葡萄孢酵母属真菌(Blastobotrys sp.)TN29对生活污水中COD降解效果图。
图5为芽生葡萄孢酵母属真菌(Blastobotrys sp.)TN29对生活污水中总氮降解效果图。
图6为芽生葡萄孢酵母属真菌(Blastobotrys sp.)TN29对生活污水中氨氮降解效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
高效氨氮降解菌株的选育、分离与鉴定：
将采集自北京大兴(采集人：余鹏举，采集时间：2019年)某养殖户的猪粪、牛粪、羊粪、鸡粪按照1:1:1:1比例混合的混合物取10g在100mL无菌水中30℃、200rpm摇床自然发酵12h后，取发酵液5mL接种于筛选驯化培养基A和B中，在30℃、200rpm摇床培养3d，每隔12h补充50mg/L硫酸铵，此外，每隔3d取5mL培养液接种于新的筛选驯化培养基中，如此反复培养10代。
筛选驯化培养基A：蔗糖30g，硫酸铵2g，氯化钠0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.5g，去离子水定容至1L，分装于250ml三角瓶中，每瓶100ml，115℃灭菌30min。
筛选驯化培养基B：葡糖糖5g，硫酸铵2g，氯化钠2.0g，七水硫酸亚铁0.04g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.5g，去离子水定容至1L，分装于250ml三角瓶中，每瓶100ml，115℃灭菌30min。
取筛选驯化10代后的培养液，按照10-3-10-7的不同比例梯度稀释，每个梯度取100μL稀释液涂布到纯化培养基上，30℃培养24-48h，观察菌落生长状况，选取生长快、数量多的菌落采取多次分区划线法纯化，将纯化后的单菌落冷冻保藏备用。
纯化培养基：葡糖糖10g，蛋白胨5g，七水硫酸亚铁0.05g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，琼脂15.0g，去离子水定容至1L，自然pH。经115℃灭菌30min后备用。临用时每100ml培养基中加1％孟加拉红水溶液和1％链霉素液。
经上述分离纯化过程得到一株具有高效氨氮降解效果的菌株，该菌在25-35℃下的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上菌落形态特征为初为乳白色菌落，后变浅咖色绒毛样，中心突起、褶皱，不易挑起，菌落紧致，圆形辐射向外生长；变形子囊酵母，产生节孢子，孢子圆形，出芽进行无性繁殖。观察结果如图1所示。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200g、葡萄糖16g、琼脂20g，去离子水定容至1L。经115℃灭菌30min后备用。
对所得菌株进行分子生物学鉴定，通过对真菌ITS序列和LSU序列PCR扩增后进行测序比对。
扩增引物：
ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'
NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'
反应体系为：10×Buffer 2μL，2.5mM dNTP 1.5μL，Primer1 1μL，Primer2 1μL，模板1μL，酶0.3μL，水13.2μL，总体积20μL；
ITS扩增PCR反应条件为：94℃预变性5min，30cycle的94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸40sec，72℃延伸10min，4℃forever保温。
LSU扩增PCR反应条件为：94℃预变性5min，30cycle的94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸50sec，72℃延伸10min，4℃forever保温。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，北京华大基因测序。
将测序后的ITS序列(SEQ ID NO.1)和LSU序列(SEQ ID NO.2)于NCBI数据库进行Blast比对，ITS序列比对结果显示，与酵母(Blastobotrys proliferans)NR_077193.2同源性最高，达95.77％，进一步LSU序列比对结果显示，与酵母(Blastobotrys proliferans)NG_066350.1同源性最高，达98.62％，根据LSU比对结果选取同源性最高的前15个序列建立系统发育树(如图2)，再结合形态鉴定，，现将菌株分类命名为Blastobotrys sp.，对应的中文名称为芽生葡萄孢酵母，故菌株的名称为芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)TN29，在本申请中简称菌株TN29。
Blastobotrys sp.该菌株已于2020年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20966。
实施例2
实验室模拟条件下，菌株TN29对氨氮的24h降解曲线：
氨氮检测方法：水杨酸分光光度法(具体检测方法见国家标准HJ 536—2009)。
挑取PDA平板单菌菌丝和孢子接种到含5mL PDB液体试管中，30℃、200rpm摇床培养，活化24h，在无菌条件下，向含有硫酸铵的PDB培养基中按照2％的体积分数接入活化24h的TN29种子液，设置培养条件为30℃、200rpm，每隔3h取样检测氨氮含量，实验设置3个重复。
马铃薯葡萄糖(PDB)培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g，去离子水定容至1L。115℃下灭菌30min后备用。初始浓度100mg/L硫酸铵过滤除菌加入。
实验结果(表1)显示，初始氨氮浓度约180mg/L，接入菌株24h后氨氮去除率达94％以上。
表1
Figure BDA0002992838710000061
Figure BDA0002992838710000071
根据以上实验结果显示，该菌株具备显著的氨氮去除能力，在污水脱氨的微生物处理过程中具有较大的应用潜能。
实施例3
实际应用中，菌株TN29对生活污水的降解效果：
从某市政污水处理厂采集生活污水，添加葡萄糖调碳氮比为20，经高温高压灭菌后用于该菌株的降解实验。挑取平板单菌菌丝和孢子接种到5mL PDB液体试管中，30℃、200rpm摇培，活化24h，在无菌条件下，向生活污水中按照1％的体积分数接入活化24h的TN29种子液，设置培养条件为30℃、200rpm，每隔12h后取样检测生活污水中的COD、氨氮和总氮含量，实验设置3个重复。
氨氮检测方法：水杨酸分光光度法(具体检测方法见标准HJ 536—2009)。
COD检测方法：重铬酸钾氧化法(具体检测方法见标准HJ 828—2017)。
总氮检测方法：碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(具体检测方法见标准GB/T11894-1989)。
实验结果(表2)显示，生活污水初始COD、氨氮和总氮含量均值分别为1577.2mg/L、70mg/L、67.3mg/L，经菌株TN29好氧处理24h后，该过程生活污水COD降解率为97.1％，氨氮降解率为100％，总氮去除率为57.2％。
表2
Figure BDA0002992838710000081
根据以上实验结果显示，该菌株在污水中具备良好的氨氮以及COD去除能力，此外对于总氮也有不错的去除效果，因此在污水的微生物处理过程中具有较大的应用潜能。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 芽生葡萄孢酵母TN29及其在污水处理中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 490
<212> DNA
<213> 芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)
<400> 1
agtaggcagg aggacgcagt atttttgtga actttttgtt tatttgcttt aggcattctt 60
cggagtgcca aaagaaaaac tttataacca tttgtctaaa actaaaagat tttaatatat 120
taaaactttc agcaacggat ctcttggttc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 180
atacgtaatg tgaattgcag aattttgtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcacc 240
ttttggtatt ccagaaggta tgcctgtttg agcgtcattt ctctctcact aacgtggttt 300
tgttgtatct ctctttggag agtgcaatga aaggaaatgg cagtgctcat gagtaggtac 360
tcggtgtttt taggttttac caactagcac agaccctctc aatacgagtc ggcttgataa 420
ctctttcaat gttgacctca aatcaggtaa gactacccgc tgaacttaag catatcaaaa 480
agcggaggaa 490
<210> 2
<211> 588
<212> DNA
<213> 芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)
<400> 2
ggaaaaggaa accaacaggg attgcctcag taacggcgag cgaagcggca aaagctcaaa 60
tttgaaatct ggctctttca gagtccgagt tgtaatttga agaaggcatc tttggtagtg 120
gctcttgcat atgttccttg gaataggacg tcatagaggg tgagaacccc gtatatggtg 180
agatgctcca ctgctatgta aagggctttc taagagtcga gttgtttggg aatgcagctc 240
taagtgggtg gtaaattcca tctaaggcta aatataggcg agagaccgat agcgaacaag 300
tacagtgatg gaaagatgaa aagaactttg aaaagagagt gaaaaagtac gtgaaattgc 360
tgaaagggaa gggcttgaca tcagactcgg tttgtaatga tcagctgtct cttgggactg 420
tgcactcgtt acttactggg ccaacatcag ttttggcggt aggataattg cagttgaatg 480
tgactttgct tcggtgaagt gttatagctt ctgtagatac taccagctgg gactgaggac 540
cgcgctttat gctaggatgt tggcgtaatg atgttaagcc acccgtct 588

Claims (4)

1.一株芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)TN29，其保藏编号是CGMCC No.20966。
2.微生物制剂，其活性成分为权利要求1所述的芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)TN29。
3.权利要求1所述的芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys sp.)TN29在污水中去除氨氮、总氮或/和COD的应用。
4.依据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述污水为氨氮或/和COD超标的污水。
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