CN115927068A - 贝莱斯芽孢杆菌ncbio-em008及其在降解餐厨垃圾中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株用于餐厨垃圾降解的贝莱斯芽孢杆菌NCBIO‑EM008，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.:23176。该菌株对餐厨垃圾中的脂肪、淀粉、蛋白质和纤维素都有一定的降解效果，其中对脂肪、蛋白质和淀粉的降解能力较为突出；通过优化发酵培养工艺，使补料批培养发酵放罐时的OD值达到50.6，是批培养最终菌浓的1.95倍，而且通过这种培养方式，可以将培养基中的氮源全部利用，95％以上的菌体全部转化为芽孢形态，便于后续将发酵液制成菌剂。

Description

贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008及其在降解餐厨垃圾中的应用

技术领域

本发明涉及一种用于餐厨垃圾降解的贝莱斯芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

餐厨垃圾是指食物在加工和用餐过程中产生的废料和残余。餐厨垃圾的含水率高，营养物质丰富，储存及运输过程中极易腐烂酸臭，影响城市的环境卫生，同时餐厨垃圾腐烂后会孳生蚊蝇及病菌，也可能产生出大量毒素，如何合理高效的处理餐厨垃圾直接影响城市的发展与生活质量。筛选并添加一些降解能力强的微生物，进行好氧堆肥，可以高效地降解餐厨垃圾中的有机质，并且可以变废为宝，将餐厨垃圾转化为有机肥已有报道，但是微生物菌剂降解餐厨垃圾的能力有待进一步提高。

发明内容

本发明提供一株用于餐厨垃圾降解的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

通过对垃圾厢房中的土壤进行稀释分离出的贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008；对菌株进行PCR特异性扩增，引物分别为27F和1492R。

正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

反向引物1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR反应体系如表所示：

PCR循环条件：

根据上海生工生物的测序序列，在NCBI上进行Blast，利用相似的16S rDNA序列构建系统进化树。如图2所示：

通过系统发育树可知，本申请提供的菌株和贝莱斯芽孢杆菌表现的亲缘关系最近，可信度为100％。基于菌株的16S rDNA系统发育分析，确定筛选得到的菌株为(Bacillusvelezensis)，并将其命名为贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008，其16S rDNA的序列如下：

AGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGA

将该贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23176，保藏时间为:2021年8月23日。

建议的分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏时间为：2021年8月23日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.:23176，进行发酵过程工艺优化，增强菌粉降解餐厨垃圾的能力。

贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008的发酵培养液对四种大分子营养物质都有一定的降解效果，其中对脂肪、蛋白质和纤维素降解的能力较为突出。通过优化发酵培养工艺，使补料批培养发酵放罐时的OD值达到50.6，是批培养最终菌浓的1.95倍，而且通过这种培养方式，可以将培养基中的氮源全部利用，95％以上的菌体全部转化为芽孢形态，便于后续将发酵液制成菌剂。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是菌株NCBIO-EM008发酵过程参数曲线；

图2为菌株NCBIO-EM008的系统发育树。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

培养基

种子培养基：

葡萄糖5g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，NaCl 10g/L，去离子水配制，用4mol/L NaOH调节pH至7.0，121℃度灭菌25min。葡萄糖分开灭，115℃，20min。

发酵罐培养基配方见表下表：

菌株NCBIO-EM008 5L发酵罐培养基配方

摇瓶种子工艺控制：

装量：100ml/500ml；

温度：35℃±0.5℃；

摇床转速：220rpm；

培养时间：12-24h；

摇瓶种子质量标准：OD₆₀₀＞8。

菌株发酵罐工艺控制：

(1)接种量：3.3％(100mL种子液→3L培养基)；

(2)罐温：35℃±0.5℃；

(3)罐压：0.05MPa±0.005MPa；

(4)空气流量和搅拌转速控制：通气量：2-3L/min；搅拌转速：200-700rpm控制DO在20-30％以上。

(5)中间补料：

(a)补加葡萄糖溶液(50％)：发酵过程中当溶氧降至最低开始回升时，开始流加葡萄糖溶液(50％)，控制OUR维持稳定。

(b)补加消泡剂(20％)：发酵过程中当泡沫接近视镜玻璃上端时开始少量多次补加消泡剂，控制泡沫不超过视镜玻璃上端。

(6)pH值控制：发酵过程中当pH值下降至7.0时，通过pH自控自动补加氨水将pH值控制在7±0.05。

(7)发酵周期：24h。

补料分批发酵工艺

接种量为3.3％，初始发酵液中的葡萄糖浓度为13.6g/L，pH值控制在7.0。在此工艺条件下，接种后0-3h为菌体生长的延滞期。之后，OUR、CER曲线开始快速上升，耗氧量逐渐增加，耗糖速率逐渐加快，发酵液中残留的葡萄糖浓度始终低于1g/L。发酵进行到12h时，菌浓已经生长到OD₆₀₀为54.4，此时OUR和CER曲线依旧保持着较好的升高趋势，耗糖速率有所减慢。15.5h左右，OUR和CER迅速下降，OUR从192.00mmol/l/h跌至48.30mmol/l/h。DO也开始有上升的趋势，耗糖速率减慢。20h，取样进行镜检，95％的菌体转为芽孢，此时放罐，最终菌浓为50.6。图1为菌株NCBIO-EM008发酵过程参数曲线。

菌株对大分子营养物质降解能力的测定

由于餐厨垃圾中的待降解大分子营养物质主要为脂肪、淀粉、蛋白质、纤维素。在待测定营养琼脂平板表面等距离摆放牛津杯，每个营养琼脂平板表面摆放3个牛津杯，每株菌做6个平行，取生长至OD₆₀₀＝5-8的菌液200μl加入牛津杯中，牛津杯中的菌液扩散渗透，通过2-4天的培养菌落分解营养底物，从而在琼脂平板表面产生透明圈。通过透明圈直径与菌落直径的比值大小或菌落直径的大小判断菌株对餐厨垃圾中大分子营养物质表观降解能力的大小。

培养基成分为：

脂肪培养基：(NH₄)SO₄ 2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，橄榄油乳化液(橄榄油：聚乙烯醇PVA＝1：3(v/v))12ml/L，0.04％溴甲酚紫25ml/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃，25min。

蛋白质培养基：KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，脱脂奶粉50g/L，可溶性淀粉10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃，25min。

淀粉培养基：蛋白胨10g/L，可溶性淀粉2g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃，25min。

纤维素培养基：K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.25g/L，CMC 1.88g/L，刚果红0.2g/L，琼脂16g/L，明胶2g/L，pH自然，121℃，25min。

NCBIO-EM008对大分子营养物质的降解能力测定

由上表可见，菌株NCBIO-EM008的发酵培养液对四种大分子营养物质都有一定的降解效果，尤其是对脂肪、蛋白质和淀粉这三种营养物质的降解能力效果突出。在复配的菌剂中可适当增加贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008的含量，用于改善对餐厨垃圾中脂肪、蛋白质和淀粉的降解效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008，分类命名为：Bacillus velezensis；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23176。

2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008，其特征在于，该菌株的种子培养基为葡萄糖5-10g/L，酵母提取物5-15g/L，蛋白胨10-20g/L和NaCl 5-10g/L，装量：100ml/500mL。

3.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008，其特征在于，该菌株的发酵培养基为酵母提取物10-30g/L，硫酸铵2-5g/L，硫酸镁2-5g/L，蛋白胨20-40g/L和磷酸二氢钾2-10g/L，自来水配制，pH值调节至6.5。

4.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008，其特征在于，发酵工艺为：接种量：3.3％；罐温：35℃±0.5℃；罐压：0.05MPa±0.005MPa；空气流量和搅拌转速控制：通气量：2-3L/min；搅拌转速：200-700rpm控制溶解氧浓度在20％以上；pH用氨水控制在6.5-7.2。

5.权利要求1-4任一项所述的贝莱斯芽孢杆菌NCBIO-EM008在餐厨垃圾降解中的应用。

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