CN114317330B

CN114317330B - 一株降解纤维素菌的筛选及应用

Info

Publication number: CN114317330B
Application number: CN202111497753.4A
Authority: CN
Inventors: 印霞棐; 单旋; 梁国斌; 林伟; 徐曹文; 吴晶晶; 蒋志雯; 张杭玉; 陈玥瑶; 雷雨琴; 汤皓婷; 陈云燕; 邵世隆; 邵维; 谢鋆韬; 金军
Original assignee: Jiangsu University of Technology
Current assignee: Jiangsu University of Technology
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2041-12-09
Also published as: CN114317330A

Abstract

本发明公开了一株降解纤维素菌的筛选及应用，属于微生物法处理废弃物领域。本发明从常州市特种竹繁育中心竹林土壤中分离出一株凝结芽孢杆菌，该菌株对环境的耐受能力强，能够在25～65℃下很好地生长，在pH7.5～13.5的环境中也能有较好的繁殖能力，并且能够耐受1％～5％的油脂含量以及0～4％的油脂含量；同时其还能很好地降解纤维素，使农林废弃物中纤维素含量降低30～45％，使废水中纤维素含量降低40～60％，能够在多种场景中降解纤维素。

Description

一株降解纤维素菌的筛选及应用

技术领域

本发明涉及一株降解纤维素菌的筛选及应用，属于微生物法处理废弃物领域。

背景技术

纤维素资源是地球上最大的可再生资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×10¹²～2.0×10¹²t(90％以上为木质纤维素类物质)，我国每年农作物秸秆的产量达5.7×10⁸t。虽然纤维素资源极为丰富，但大部分主要用作燃料或填埋，不仅增加处理成本，浪费土地资源，污染环境，还造成其中丰富生物质的损失。若将其用于堆肥，秸秆中大量纤维素不易被微生物分解，限制了堆肥的腐熟度进程，延长了堆肥周期，降低堆肥效率。此外一些农作物如棉花等可以加工成多种规格的织物，在加工生产中会产生大量含纤维素的废水，用传统的活性污泥法较难降解，一般采用絮凝法处理，但絮凝剂的投加增加了处理成本。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明提供了一株降解纤维素菌，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，已于2021年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 22551，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明提供了含有所述的凝结芽孢杆菌的产品。

在一种实施方式中，所述产品包括污水处理剂、微生物菌剂或酶制剂。

在一种实施方式中，所述产品中凝结芽孢杆菌的量不少于10⁶cfu/mL或10⁶cfu/g。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂或污水处理剂中含有其他能够降解纤维素的菌株，所述其他能够降解纤维素的菌株包括但不限于嗜麦芽寡养单胞菌、水氏黄杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或大肠埃希氏菌。

本发明提供了一种降解纤维素的方法，所述方法是将所述凝结芽孢杆菌，或将所述的产品加入含有纤维素的体系中反应；所述含有纤维素的体系包括固体废弃物和/或液体废弃物。

在一种实施方式中，当所述体系为固体废弃物时，将所述凝结芽孢杆菌培养至OD₆₀₀＝1.0±0.2，或将含有凝结芽孢杆菌的产品调节为凝结芽孢杆菌的OD₆₀₀＝1.0±0.2的菌液，将菌液按照10～50mL/g的量添加至含有木质素的固态体系中，在30～65℃、100～150rpm下进行反应。

优选地，将菌液按照10mL/g的量添加至含有木质素的固态体系中，在30℃、140rpm下进行反应。

在一种实施方式中，所述固体废弃物中含有竹叶、竹枝、甘蔗渣、木头、树叶、树枝、烟草或其他含有纤维素的物质。

在一种实施方式中，当所述体系为液体废弃物时，将所述凝结芽孢杆菌培养至OD₆₀₀＝1.0±0.2，或将含有凝结芽孢杆菌的产品调节为凝结芽孢杆菌的OD₆₀₀＝1.0±0.2的菌液，将得到的菌液按照体系体积的10％～70％加入含有木质素的液态体系中，在30～50℃、100～150rpm下进行反应。

优选地，菌液按照体系体积的20％，在30℃、140rpm下反应。

在一种实施方式中，所述液体废弃物包括精制棉生产废水及其他含有纤维素的液体废弃物。

在一种实施方式中，在pH为3～13下反应0～96h。

在一种实施方式中，将所述凝结芽孢杆菌在以淀粉、玉米粉、糊精、葡萄糖或甘蔗中的一种或多种为碳源，并以硝酸钠、硫酸铵、磷酸铵、蛋白胨或酵母粉中的一种或多种为氮源的体系中培养，获得菌液。

优选地，所述碳源为淀粉、玉米粉或糊精。

优选地，所述氮源为硝酸铵、蛋白胨或酵母粉。

在一种实施方式中，凝结芽孢杆菌的培养体系中还可以含有体积分数为1％～5％的油脂，和/或含有体积分数为0～4％的NaCl。

本发明提供了所述凝结芽孢杆菌或所述含有所述的凝结芽孢杆菌的产品在降解纤维素或含有纤维素的物质中的应用。

在一种实施方式中，所述含有纤维素的物质包括竹叶、竹枝、甘蔗渣、木头、树叶、树枝、烟草和/或精制棉生产废水。

有益效果：本发明从常州市特种竹繁育中心竹林土壤中分离出一株凝结芽孢杆菌，该菌株对环境的耐受能力强，能够在25～65℃下很好地生长，在pH7.5～13.5的环境中也能有较好的繁殖能力，并且能够耐受1％～5％的油脂含量以及0～4％的油脂含量；同时其还能很好地降解纤维素，使农林废弃物中纤维素含量降低30～45％，使废水中纤维素含量降低40～60％，能够在多种场景中降解纤维素。

附图说明

图1为本发明的凝结芽孢杆菌菌落形态及细胞形态图。

图2为本发明的凝结芽孢杆菌株rDNA电泳图。

生物材料保藏

本发明中所述提供的凝结芽孢杆菌，分类学命名为凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans，已于2021年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22551，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。

所述富集培养指的是使孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”，并且使培养液中菌体浓度达到较高水平。

在一种实施方式中，用于菌株筛选的土样取自常州市特种竹繁育中心竹林土壤富含枯枝落叶深度15cm的土样。

在一种实施方式中，展示菌株降解效果的纤维素富集培养基含有5g/L纤维素，5g/L蛋白胨，2g/L碳酸钙，5g/L氯化钠，0.5g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁；配制方法为将5g纤维素，5g蛋白胨，2g碳酸钙，5g氯化钠，0.5g磷酸氢二钾，0.5g硫酸镁，加入1000mL蒸馏水，121℃灭菌20min。

在一种实施方式中，筛选菌株所用的纤维素筛选鉴定培养基含有5g/L羧甲基纤维素(CMC)，2g/L酵母粉，0.5g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，20g/L琼脂；配制方法为将5g羧甲基纤维素(CMC)，2g酵母粉，0.5g磷酸二氢钾，0.5g硫酸镁，20g琼脂，1000mL蒸馏水，121℃灭菌20min。

在一种实施方式中，菌株活化、培养、富集所用的培养基为马铃薯葡萄糖培养基，马铃薯葡萄糖培养基中包含：200g/L马铃薯，20g/L葡萄糖，1.5g/L硫酸镁，3g/L磷酸二氢钾，0.05g/L维生素B1；将200g马铃薯，20g葡萄糖，1.5g硫酸镁，3g磷酸二氢钾，0.05g维生素B1，1000mL蒸馏水，121℃灭菌20min。

下述实施例中对纤维素的含量测定：采用范氏法测定纤维素测定方法。

下述实施例中所涉及纤维素降解率计算方法：纤维素降解率＝反应后纤维素含量/原始物料中纤维素含量。

下述实施例中涉及的酶活测定方法(测定纤维素酶酶活)：1.0％羧甲基纤维素钠溶液1.8mL，50℃预热5min，准确加入稀释100～200倍菌液200μL，在50℃水浴中准确反应30min，立即分别加入DNS试剂3mL，空白管中加入灭活菌液200μL，立即沸水浴10min，终止反应。冷却后定容至25mL，于540nm波长下测定样品管中OD值，通过DNS法测定还原糖含量。在50℃反应条件下，每分钟从浓度为1％的羧甲基纤维素钠溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位(U)。

实施例

本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1：菌株的筛选及鉴定

1、菌株的筛选

称取4g土样置于含有100mL富集培养基的三角瓶中，并放入玻璃珠充分打散混匀，于37℃、150r/min的恒温振荡培养箱中培养3d。

将培养后的菌液用无菌水进行梯度稀释，取各稀释度为10^-5，10^-6，10^-7的菌液100μL涂布于筛选鉴定培养基上，每个稀释度做3个平行，倒置放于37℃恒温培养箱中培养3d，直至有明显菌落长出。挑取菌落特征存在明显差异的单菌落，划线于筛选培养基上，置于37℃恒温培养箱中继续培养，重复该步骤直至得到纯菌。

2、菌株的鉴定

分离出的本发明的菌株在纤维素筛选鉴定培养基上菌落乳白色，湿润，表面平滑，边缘不规则，利用光学显微镜观察菌株的形态特征，细胞呈杆状，分布密集(如图1所示)。

由生工生物工程(上海)股份有限公司经16s RNA鉴定菌株的菌属，使用SK9255试剂盒提取基因组DNA，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将扩增得到的条带进行电泳检测，电泳图如图2所示。

(1)所用引物：

7F：CAGAGTTTGATCCTGGCT，SEQ ID NO.1；

1540R：AGGAGGTGATCCAGCCGCA，SEQ ID NO.2。

(2)PCR扩增反应体系：

(3)PCR反应条件：

(4)凝胶电泳：

1％琼脂糖电泳，150V、100mA、20min电泳观察。

实施例2：凝结芽孢杆菌耐热性

(1)将筛选获得的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)以体积比2％的接种量接种至100mL马铃薯葡萄糖培养基中30℃、140rpm下进行活化，将活化后的凝结芽孢杆菌以体积比0.2％的接种量接种至新鲜的纤维素富集培养基中，并使其在培养基中的OD₆₀₀为0.1；

(2)分别在不同温度25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃静置培养24h；

(3)计算活菌数。

结果如表1所示：在40～55℃时，菌株具有较高的活性，活菌数能达到(5.1～5.74)×10⁹CFU/mL。

表1凝结芽孢杆菌在不同温度下的活菌数(×10⁹CFU/mL)

实施例3：凝结芽孢杆菌耐碱性

(2)配制新鲜的纤维素富集培养基并调节其pH分别为7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5，取步骤(1)中的菌液以体积比0.2％的接种量接种至100mL已调节好pH的纤维素富集培养基中，在30℃、150r/min下培养24h；

(3)测定不同pH下培养基中的OD₆₀₀。

结果如表2所示：在pH为7.5～9.5时，凝结芽孢杆菌的OD₆₀₀值较高。在碱性条件下，凝结芽孢杆菌也能生存。

表2凝结芽孢杆菌在不同pH下的OD₆₀₀值

实施例4：凝结芽孢杆菌耐盐性

(2)配制新鲜的纤维素富集培养基中分别加入氯化钠，并调节其盐度(NaCl)分别为0.5％、1％、2％、3％、4％，取步骤(1)中的菌液以体积比0.2％的接种量接种至100mL已调节好盐度的纤维素富集培养基中，在30℃、150r/min下培养24h；

(3)测定不同盐度下培养基中的OD₆₀₀。

结果如表3所示：在盐度为0.5～2％时，凝结芽孢杆菌的OD₆₀₀值较高。

表3凝结芽孢杆菌在不同盐度下的OD₆₀₀值

实施例5：凝结芽孢杆菌耐油性

(2)配制新鲜的纤维素富集培养基中分别加入食用油1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，取步骤(1)中的菌液以体积比0.2％的接种量接种至100mL含油的纤维素富集培养基中，在30℃、150r/min下培养24h；

(3)测定不同含油量下培养基中的OD₆₀₀。

结果如表4所示：在食用油体积为1～5mL时，凝结芽孢杆菌的OD₆₀₀值均较高。

表4凝结芽孢杆菌在不同含油量下的OD₆₀₀值

实施例6：凝结芽孢杆菌在不同碳源下培养

(1)配制不同碳源的培养基，如表5所示；

表5不同碳源的培养基

(2)将活化后获得的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)分别以体积比0.2％的接种量分别接种至表5中的培养基中，30℃、140r/min下培养24h；

(3)测量各培养基的OD₆₀₀值。

如表6所示，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)在培养基2中的OD₆₀₀值最高，因此玉米粉是最佳碳源。

表6凝结芽孢杆菌在不同碳源下的OD₆₀₀值

实施例7：凝结芽孢杆菌在不同氮源下培养

(1)配制不同氮源的培养基，如表7所示；

表7不同氮源的培养基

(1)将活化后获得的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)分别以体积比0.2％的接种量分别接种至表7中的培养基中，30℃、140r/min下培养24h；

(2)测量各培养基的OD₆₀₀值，以及粗酶液的酶活。

如表8所示，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)在培养基4中的OD₆₀₀值最高，因此蛋白胨是最佳氮源。

表8凝结芽孢杆菌在不同氮源下的OD₆₀₀值

实施例8：凝结芽孢杆菌对精制棉生产废水中纤维素的降解效果

将活化后的凝结芽孢杆菌以体积比2％的接种量接种至100mL新鲜的纤维素富集培养基中，置于30℃、140rpm摇床中培养至OD₆₀₀达到1.0。然后将菌液以体积比5％的接种量接种至30℃精制棉生产废水(该废水来自南通瑶华纤维有限公司，pH为10～12，初始纤维素含量为45.3％)中，在30℃、140rpm下反应12h，纤维素含量为23.7％，较未处理时降低了47.6％。

实施例9：凝结芽孢杆菌对废竹叶中纤维素的降解效果

将活化后的凝结芽孢杆菌以体积比2％的接种量接种至100mL新鲜的纤维素富集培养基中，置于30℃、140rpm摇床中培养至OD₆₀₀达到1.0。然后将10mL菌液与1g竹叶粉末混合，在30℃、140rpm下反应12h，纤维素含量为13.5％，较未处理时降低31.5％。

实施例10：凝结芽孢杆菌在处理含有纤维素的物质中的应用

将凝结芽孢杆菌菌液加入含有纤维素的体系中，所述体系pH7.5～13.5、含油量0～5％、含盐量0～3％、25～65℃、处理0～108h。

实施例11：含有凝结芽孢杆菌的微生物菌剂的制备

(1)单菌菌剂的制备

取400μL的凝结芽孢杆菌菌液接种于20mL马铃薯葡萄糖培养基中，30℃下活化2至3代，待瓜类鞘氨醇单胞菌达到10⁸cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冻干保护剂，待细胞浓度不低于10⁶cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

(2)复合微生物菌剂的制备

将所述凝结芽孢杆菌与其他能够降解木质素的菌株混合后培养得到混合菌液，或是将菌株分别培养后再混合得到混合菌液，将混合菌液经冷冻干燥过后得到微生物制剂。

所述能够降解纤维素的菌株包含嗜麦芽寡养单胞菌、水氏黄杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌以及其他能够降解木质素的菌株。

实施例12：含有凝结芽孢杆菌的产品的制备

将实施例11得到的固体菌剂加入能够降解木质素的产品中，制备得到含有凝结芽孢杆菌的产品；所述产品包括污水处理剂、酶类制剂及其他能够与微生物混合的制剂。

实施例13：微生物菌剂或含有凝结芽孢杆菌的产品在处理精制棉生产废水中的应用

取含有凝结芽孢杆菌的微生物菌剂或含有凝结芽孢杆菌的产品，将其添加至马铃薯葡萄糖培养基中活化，活化后以体积比2％的接种量接种至100mL新鲜的木质素富集培养基中；将菌液接种至人精制棉生产废水(pH为5～6)中，在25～65℃、140r/min下反应0～108h。

实施例14：微生物菌剂或含有凝结芽孢杆菌的产品在处理废竹叶中的应用

取含有凝结芽孢杆菌的微生物菌剂或含有凝结芽孢杆菌的产品，将其添加至马铃薯葡萄糖培养基中活化，活化后以体积比2％的接种量接种至100mL新鲜的木质素富集培养基中；将菌液接种至废竹叶中，在25～65℃、140r/min下反应0～108h。

实施例15：含有凝结芽孢杆菌的产品在处理含有纤维素的物质中的应用

将含有瓜类鞘氨醇单胞菌的产品加入含有木质素的体系中，所述体系pH7.5～13.5、含油量0～5％、含盐量0～3％、25～65℃、处理0～108h。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏理工学院

<120> 一株降解纤维素菌的筛选及应用

<130> GBAA211588A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagagtttga tcctggct 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggaggtgat ccagccgca 19

Claims

1. 一株凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），已于2021年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 22551。

2.含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的产品。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品包括污水处理剂、微生物菌剂或酶制剂。

4. 根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述微生物菌剂或污水处理剂中含有其他能够降解纤维素的菌株，所述其他能够降解纤维素的菌株包括但不限于嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、水氏黄杆菌（Flavobacterium mizutaii）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和/或大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。

5.一种降解纤维素的方法，其特征在于，将权利要求1所述凝结芽孢杆菌，或将权利要求2或3所述的产品加入含有纤维素的体系中反应；所述含有纤维素的体系包括固体废弃物和/或液体废弃物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述体系为固体废弃物时，将所述凝结芽孢杆菌培养至OD₆₀₀=1.0±0.2，或将含有凝结芽孢杆菌的产品调节为凝结芽孢杆菌的OD₆₀₀=1.0±0.2的菌液，将菌液按照10~50mL/g的量添加至含有纤维素的固态体系中，在30~65℃、100~150rpm下进行反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述固体废弃物中含有竹叶、竹枝、甘蔗渣、木头、树叶、树枝、烟草或其他含有纤维素的物质。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述体系为液体废弃物时，将所述凝结芽孢杆菌培养至OD₆₀₀=1.0±0.2，或将含有凝结芽孢杆菌的产品调节为凝结芽孢杆菌的OD₆₀₀=1.0±0.2的菌液，将得到的菌液按照体系体积的10%~70%加入含有纤维素的液态体系中，在30~50℃、100~150rpm下进行反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液体废弃物包括精制棉生产废水及其他含有纤维素的液体废弃物。

10.根据权利要求5~9任一所述的方法，其特征在于，将所述凝结芽孢杆菌在以淀粉、玉米粉、糊精、葡萄糖或甘蔗为碳源，并以硝酸钠、硫酸铵、磷酸铵、蛋白胨或酵母粉为氮源的体系中培养，获得菌液。

11.权利要求1所述凝结芽孢杆菌或权利要求2~4任一所述产品在降解纤维素或含有纤维素的物质中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述含有纤维素的物质包括竹叶、竹枝、甘蔗渣、木头、树叶、树枝、烟草和/或精制棉生产废水。