CN110331109B - 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。本发明涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05，于2019年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17807。本发明还涉及枯草芽孢杆菌ASD05的培养方法与应用。本发明首次发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05具有富集降解秸秆作用的微生物粘附于秸秆表面的作用，同时具有高产木聚糖酶及果胶酶能力，纤维素酶活低，无漆酶活性。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
秸秆是重要的生物质资源，我国秸秆资源总量巨大，数据显示，截至2018年我国各类秸秆资源年产量已超过10亿吨。秸秆的资源化利用不但有着巨大的经济价值，而且具有重要的环保意义。目前，秸秆的资源化利用方式主要有还田、饲用、堆肥、沼气化、生物化工等方式。“绿水青山才是金山银山”，不论采取何种处理方式，在激发秸秆资源利用潜力的同时，必须降低和消除环境污染因素，特别是避免次生污染。
秸秆主要为植物的维管束和细胞壁等结构单元，包含纤维素、半纤维素、木质素(此三部分合称木质纤维素)、果胶、蛋白质等成分，这些有机分子彼此交联、包裹，组成复杂的大分子立体网状结构。作为植物的主要“骨架”和“外墙”结构，秸秆一般十分坚韧、耐腐蚀、不易被微生物分解，这种情况往往随着植物的后熟而更加突出。从秸秆的天然结构特点出发，加以适当改造，生产秸秆改性材料是一种重要的秸秆利用方式。秸秆改性材料具有秸秆的多数基本特性，同时又根据生产目的不同，由加工过程赋予了“亲水性或亲油性、增大比表面积、专一性吸附”等若干新的特征，可在污染物消除、农田修复、微生物发酵等领域发挥重要用途，具有重要的经济价值。
如何全面或部分的打破秸秆的复杂而坚韧的交联结构，使之具备进一步加工的条件，是秸秆材料加工中不可避免的重要问题，目前主要的秸秆处理方式有物理法、化学法、生物法等。其中蒸汽爆破、高温碳化、酸碱消解、有机溶剂处理等物理、化学处理方式对技术工艺要求较高且高耗能、易带来次生污染，而处理手段更加温和的生物法日益成为人们的首选。
秸秆的生物法处理主要是利用具有较强木质纤维素降解能力的微生物或生物酶对秸秆进行生物降解，常用的有白腐菌、褐腐菌和假单胞菌等菌株和纤维素酶、漆酶、木聚糖酶等酶类。这些微生物和生物酶制品通过分解纤维素、木质素、半纤维素等成分，能够在一段时间内破坏木质纤维素结构，产生大量可供微生物发酵的还原糖，在以秸秆为原料的乙醇发酵、生物柴油、沼气发酵等领域发挥了重要作用。然而在秸秆材料加工方面，并不以产生大量可供发酵的还原糖为目的，不需对秸秆的结构进行严重的破坏。在保留秸秆固有结构的基础之上，进行适当改造并赋予新的特性是更为有用的。
中国专利文献CN 106629652 A(申请号：201611243135.6)公开了一种“高比表面积生物质基炭材料及其免活化制备方法和应用”，通过采用氟化物对生物质材料中SiO2、碳酸盐等组分在碳化步骤中一步去除，可直接获得高比表面积生物基碳材料；中国专利文献CN 101654660A(申请号：200910054782.6)公开了一种“具有苎麻脱胶活性的枯草芽孢杆菌菌株、其制备和应用”，该体系菌株具有繁殖速度快、果胶酶和木聚糖酶产率高、生产周期短等特点，利用该体系进行苎麻脱胶时，具有脱胶时间短、苎麻纤维分散度和脱胶率高等优势。
上述专利文献分别涉及通过物理、化学及生物的方法对生物质材料进行改性加工，达到提高生物质材料的比表面积或去除非纤维胶质成分的目的。目前关于多孔类秸秆改性材料的生产，仍然以高温高压处理、化学试剂处理等物理、化学的方式为主，这些方法虽然效率较高，但是往往耗能较大、易造成次生污染；采用微生物的方法进行秸秆改性虽然环境更为友好，但是菌株降解的选择性往往较差，易造成秸秆原有结构的严重破坏；同时由于秸秆表面为疏水性的胶质层，菌株与秸秆材料往往不能充分接触，而菌株生理作用的发挥更多是细胞整体起作用而并非仅仅依靠胞外酶，导致有益作用不能充分释放，出现处理效率低、处理周期过长等问题仍需要克服。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌ASD05具有优良的秸秆粘附性能，同时该菌能富集有降解秸秆作用的微生物高效粘附在秸秆表面，该菌为高产木聚糖酶及果胶酶活性菌株，纤维素酶活性很低，不具有漆酶活性；该菌在秸秆改性材料加工具有广阔的市场前景。
本发明的技术方案如下：
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05，于2019年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17807。
本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05筛选自山东省某蚯蚓养殖场新鲜蚯蚓粪。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05在37℃条件下，营养琼脂培养基平板上培养24h后，形成白色、圆形菌落，菌落直径5～15mm，厚度0.5～1mm，菌落表面粗糙且有不规则形褶皱，边缘有毛刺；革兰氏染色为阳性，显微镜下观察菌体形态呈短杆状，大小为0.8～1.2μm×2～4μm，具有内生芽孢且不膨大，孢子位于细胞中部，菌体可以运动，该菌株的菌落及细胞形态见图1及图2。
上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的培养方法，步骤如下：
(1)取活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05，接种于种子培养基，在35～38℃、200～240rpm摇床培养22～25h，制得液体种子；
(2)取步骤(1)制得的液体种子，按体积百分比0.5％的比例接种于扩大培养基，在35～38℃、200～240rpm摇床培养34～38h，制得菌液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05为将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05接种至活化培养基，在35～38℃活化培养22～25h；活化培养基为LB固体培养基。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中种子培养基，组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖5g/L，余量水；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中扩大培养基组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，土豆100g/L，葡萄糖5g/L，余量水。
上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05在秸秆改性材料加工中的应用。
上述应用，步骤如下：
(a)取上述菌液，按体积百分比0.5％的比例接种于诱导发酵培养基，在35～38℃、200～240rpm摇床培养36～38h，制得菌体发酵液；
(b)取干燥、粉碎的玉米秸秆，按照玉米秸秆：无菌水：菌体发酵液＝100：(10～50)：(0.3～0.8)的重量比混合均匀，在35～45℃孵育36～60h，制得预处理玉米秸秆；
(c)将步骤(b)制得的预处理玉米秸秆在70～105℃条件下烘干24～48h，制得多孔改性秸秆材料。
根据本发明优选的，所述步骤(a)中诱导发酵培养基，组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，土豆100g/L，木聚糖5g/L，果胶5g/L，余量水。
根据本发明优选的，所述步骤(b)中菌体发酵液的活菌密度为5.0×109～1.0×1010CFU/mL；进一步优选的，所述步骤(b)中菌体发酵液的活菌密度为8.0×109CFU/mL；
根据本发明优选的，所述步骤(c)中干燥条件为在75～85℃条件下干燥至恒重；进一步优选的，所述干燥条件为80℃。
根据本发明优选的，所述步骤(b)中粉碎为粉碎至粒径0.1～0.3cm；进一步优选的，所述粉碎为粉碎至粒径0.2cm；
根据本发明优选的，所述步骤(b)中玉米秸秆：无菌水：菌体发酵液＝200:40:1；
根据本发明优选的，所述步骤(b)中孵育温度为40℃，孵育时间为48h。
根据本发明优选的，所述步骤(c)中，烘干温度为80℃条件下，烘干至恒重。
有益效果：
1、本发明首次发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05具有富集降解秸秆作用的微生物粘附于秸秆表面的作用，同时具有高产木聚糖酶及果胶酶能力，纤维素酶活低，无漆酶活性；该菌株在实际应用过程中，能够在保留秸秆基本骨架的同时，通过自身分泌的胞外酶实现对秸秆表层中丰富的半纤维素和果胶质的有效分解；该菌株和富集的微生物实现对秸秆的高效分解；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05菌株处理玉米秸秆48h后，秸秆表面物理结构发生显著变化，秸秆比表面积、孔容明显增大；经电子扫描显微镜观察发现秸秆表面形成特殊的多孔结构，表明枯草芽孢杆菌ASD05在秸秆改性材料加工中具有很好的效果。
2、本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05在改性秸秆时，相对于化学和物理处理手段，该菌处理秸秆为生物分解过程，不仅处理效率高、效果好，而且处理作用温和，环境友好，不会造成二次污染和对操作人员产生潜在危害。该菌株及其富集菌能够粘附在秸秆表面，利用秸秆的养分维持存活和生长，并不断产生活性酶，相对于采用酶制剂的处理过程，处理效果持续性强，且为一次投菌，过程中不必补加，减少了处理环节。
3.本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05抗逆性强、易培养、对营养要求不高，该菌株在六碳糖、五碳糖为碳源的培养基中都可生长，可利用土豆、大豆粉等多种自然培养基进行培养；生长温度范围为25～55℃，生长pH范围为4.5～9；能产生可耐受更加严酷环境条件的芽孢，在合适的条件下进行萌发，可在常温条件下保存2年，存活性达85％以上。
4.本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05适用性广，处理效果持续性强，该菌株不但适用于玉米、小麦等作物秸秆，也适用甘蔗、马铃薯、黄瓜等经济和蔬菜作物的秸秆。并且根据不同应用环境会富集不同的菌株，从而实现秸秆表面的快速改性。
附图说明
图1.枯草芽孢杆菌ASD05营养琼脂平板菌落照片；
图2.枯草芽孢杆菌ASD05革兰氏染色显微镜照片；
图3.枯草芽孢杆菌ASD05生物处理前的玉米秸秆扫描电子显微镜照片；
图4.枯草芽孢杆菌ASD05生物处理后的玉米秸秆扫描电子显微镜照片；
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
本发明中若无特殊说明，实施例中的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05，于2019年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17807。
实施例1：
本发明中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的筛选过程如下：
(1)初筛
①采集山东省某蚯蚓养殖场的新鲜蚯蚓粪，装入无菌袋中，冰袋保存运回实验室。
②为尽量消除蚯蚓粪中大肠杆菌、粪肠球菌等无用杂菌的干扰，将样品在70℃培养箱中处理2h，取出。
③无菌条件下碾碎蚯蚓粪样品，以无菌蒸馏水进行梯度稀释，选取10-5～10-8梯度稀释液分别涂布于筛选培养基1的平板上，并于37℃培养24～48h至形成完整清晰的菌落；
筛选培养基1，组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，木聚糖5g/L，琼脂粉15g/L，余量水，灭菌冷却至40～50℃后，向上述培养基中加入事先经过滤除菌的1％刚果红溶液5mL/L，混匀。
④以无菌牙签挑取若干步骤③形成的较大透明圈的单菌落，投入液体培养基中，37℃、220rpm条件下培养24～48h至液体培养基变浑浊；
液体培养基，组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，余量水。
⑤取步骤④中的变浑浊的液体培养基，以无菌蒸馏水进行梯度稀释，选取10-7～10-9梯度稀释液分别涂布于筛选培养基2的平板上，并于37℃培养24～48h至形成完整清晰的菌落；
筛选培养基2，组份如下：
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，果胶5g/L，琼脂粉15g/L，余量水。
⑥以无菌牙签挑取若干步骤⑤形成的较大透明圈的单菌落，投入液体培养基，37℃、220rpm条件下培养24～48h至液体培养基变混浊，备用，液体培养基组分同步骤④。
⑦初筛共得到12株菌株，分别命名为菌株01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12。
(2)复筛
①待测菌株木聚糖酶活性的测定，按照国家标准GB/T 23874-2009所述方法测定初筛得到的若干菌株的木聚糖酶活性。该方法的原理是：木聚糖可被木聚糖酶分解为寡糖和单糖，而还原性的寡糖、单糖可与DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)发生显色反应，反应液在540nm处的吸光值与反应产生的还原糖的量成正比，还原糖的产量与木聚糖酶活性成正比，因此，测定540nm处的吸光值可以表示木聚糖酶的活性。酶活(U)定义为：1g或1ml酶液，1min水解木聚糖溶液生成1μmol木糖所需的酶量，为1个酶活单位。
②待测菌株果胶酶活性的测定，参照国家标准GB 1886.174-2016所述方法测定初筛得到的若干菌株的果胶酶活性。该方法的原理是：果胶能被果胶酶水解，生成具有还原性糖醛基的半乳糖醛酸，可用次亚碘酸法定量测定,以此来表示果胶酶的活性。酶活(U)定义为：1g或1ml酶液，1h水解果胶溶液生成1mg半乳糖醛酸所需的酶量，为1个酶活单位。
③待测菌株纤维素酶活性的测定，参照国家标准GB/T 23881-2009所述方法测定初筛得到的若干菌株的纤维素酶活性。该方法的原理是：纤维素酶水解滤纸产生纤维二糖、葡萄糖等还原性糖，在碱性条件下与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，540nm处吸光值与还原糖浓度呈正比。酶活定义为：在37℃、pH5.5条件下，每分钟分解滤纸产生1μmol葡萄糖所需的酶量，定义为1个滤纸纤维素酶活性单位。
④待测菌株漆酶活性的测定，参照ABTS法(林俊芳,刘志明,陈晓阳,郭丽琼,王杰.真菌漆酶的酶活测定方法评价[J].《生物加工过程》,2009,7(04):1-8.)所述方法测定初筛得到的若干菌株的漆酶活性。该方法的原理是：ABTS(2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)经漆酶作用后形成ABTS自由基，在420nm处的吸光值与ABTS自由基的浓度成正比。酶活定义为：在反应条件下，每分钟生成1μmolABTS自由基所需的酶量，定义为1个漆酶活性单位。
⑤通过以上过程，对初筛得到的12株备选菌株——菌株01，02，03，04，05，06，07，08，09，10，11，12的木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶及漆酶活性分别进行了测定，结果如表1所示，可见菌株05木聚糖酶和果胶酶活性分别为2200U/mL和520U/mL，在初筛菌中均为最高，为高产木聚糖酶和果胶酶菌株，同时纤维素酶活性很低，漆酶活性为0，该菌株命名为ASD05。
表1菌株木聚糖酶和果胶酶活性
Figure BDA0002141335380000061
实施例2：
实施例1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的鉴定
(1)菌株形态及生理生化鉴定：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05在37℃条件下，营养琼脂培养基平板上培养24h后，形成白色、圆形菌落，菌落直径5～15mm，厚度0.5～1mm，菌落表面粗糙且有不规则形褶皱，边缘有毛刺；革兰氏染色为阳性，显微镜下观察菌体形态呈短杆状，大小为0.8～1.2μm×2～4μm，具有内生芽孢且，芽孢形成后菌体不膨大，芽孢位于细胞中部，菌体可运动，该菌株的菌落及细胞形态见图1及图2。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的主要生理生化特性，检测结果为：接触酶实验、葡萄糖产酸实验、V.P实验、淀粉水解实验、酪素水解实验、柠檬酸盐利用实验、明胶液化实验、亚硝酸盐还原实验都为阳性，可利用D-木糖、D-阿拉伯糖及D-甘露醇产酸，可在质量百分百比7％NaCl条件下生长，可在55℃条件下生长，在好氧条件下生长良好，在厌氧条件下生长不良，葡萄糖产气实验、马尿酸盐水解实验都为阴性，不分解酪氨酸。
(2)菌株分子生物学鉴定：
以细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的染色体DNA，使用16S rDNA测序通用引物(27F，5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R，5'-GGYTACCTTGTTACGACT)进行PCR扩增。
扩增体系为；
PCR反应体系如下：
Figure BDA0002141335380000071
PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增得到的产物经凝胶电泳回收纯化以后送NDA测序单位测序，菌株16S rDNA测序结果详见SEQ ID NO.1。将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的16S rDNA序列通过BLAST在线软件进行相似性比对，结果表明该菌株与芽孢杆菌(Bacillus)序列相似度为99％，同源性最高。同时结合菌株的生理生化实验结果，判定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.17807，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2019年5月15日。
实施例3：
实施例1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的培养方法
(1)取经活化后的枯草芽孢杆菌ASD05，接种于装有种子培养基的摇瓶，37℃、220rpm摇床培养24h，制得液体种子；
所述种子培养基组分如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖5g/L，余量水；
所述活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05为将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05接种至活化培养基，在37℃活化培养24h；活化培养基为LB固体培养基。
(2)取步骤(1)制得的液体种子，按体积百分比0.5％的比例接种于装有扩大培养基的摇瓶，37℃、220rpm摇床培养36h，即得菌液；
所述扩大培养基组分如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，土豆100g/L，葡萄糖5g/L，余量水。
(3)4℃条件下，将步骤(2)制备的菌液在8000rpm条件下离心5min，收集菌液，得粗酶液，按照国家标准GB/T 23874-2009、国家标准GB 1886.174-2016、国家标准GB/T 23881-2009及ABTS法所述办法，测得粗酶液的木聚糖酶活为2200U/mL，果胶酶活为520U/mL，纤维素酶活为1.5U/mL，无漆酶活性。
实施例4：
实施例1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的诱导发酵培养方法
(1)取经活化后的枯草芽孢杆菌ASD05，接种于装有种子培养基的摇瓶，37℃、220rpm摇床培养24h，制得液体种子；
所述种子培养基组分如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖5g/L，余量水；
所述活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05为将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05接种至活化培养基，在37℃活化培养24h；活化培养基为LB固体培养基。
(2)取步骤(1)制得的液体种子，按体积百分比0.5％的比例接种于装有扩大培养基的摇瓶，37℃、220rpm摇床培养36h，即得菌液；
所述扩大培养基组分如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，土豆100g/L，葡萄糖5g/L，余量水。
(3)取步骤(2)制得的菌液，按体积百分比0.5％的比例接种于装有诱导发酵培养基的摇瓶，37℃、220rpm摇床培养36h，即得菌体发酵液；
所述诱导发酵培养基组分如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，土豆100g/L，木聚糖5g/L，果胶5g/L，余量水；
(4)4℃条件下，将步骤(3)制备的菌体发酵液8000rpm离心5min收集菌液，得粗酶液，按照国家标准GB/T 23874-2009、国家标准GB 1886.174-2016、国家标准GB/T 23881-2009及ABTS法所述办法，测得粗酶液的木聚糖酶活为2450U/mL，果胶酶活为580U/mL，纤维酶活为纤维素酶活为1.5U/mL，无漆酶活性。
相对于实施例3中的菌液，实施例4中的菌体发酵液中，木聚糖酶活性提高11.36％，果胶酶活性提高11.54％，纤维素酶及漆酶活性无变化。
实验例1
实施例1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的秸秆粘附性能
(1)80℃条件下，将玉米秸秆烘干至恒重，粉碎至0.2cm粒径的颗粒，冷却至室温备用；
(2)分别取枯草芽孢杆菌ASD05菌体发酵液、毕赤酵母ATCC 28485菌体发酵液、短小乳杆菌ATCC 367菌体发酵液及枯草芽孢杆菌ATCC 15134菌体发酵液，以无菌蒸馏水调节活菌密度均为a(单位为CFU/ml)；
(3)按照玉米秸秆：无菌水：菌体发酵液(重量比)＝200：40：1的比例，向玉米秸秆中加入无菌水和菌体发酵液并混合均匀，置于敞开口的容器中，制得玉米秸秆处理混合物(固态)；
(4)将所得玉米秸秆处理混合物置于4℃冰箱孵育72h，以去除细胞增殖和死亡对于实验结果的影响；
(5)实验开始后，每隔12h分别取10g上述玉米秸秆处理混合物，反复以40mL的0.9％NaCl溶液缓慢冲洗该混合物2遍，得洗脱液；
(6)分别取冲洗后的洗脱液，以平板计数的方法计算溶液活菌密度(记为b，单位为CFU/ml)：进行平板计数时，以LB固体培养基，37℃培养48h，统计芽孢杆菌活菌数；以含氯霉素的YPD培养基(氯霉素终浓度为10mg/L)，30℃培养48h，统计毕赤酵母活菌数(此条件下枯草芽孢杆菌不生长)；以MRS培养基，30℃并置于厌氧手套箱中培养48h，统计短小芽孢杆菌活菌数(此条件下枯草芽孢杆菌不能形成菌落)；
(7)通过比较洗脱液中的活菌数与玉米秸秆处理混合物初始活菌数，可得秸秆菌株粘附率c(％)。具体计算方法为：
Figure BDA0002141335380000101
式中：
c:秸秆菌株粘附率，即未被洗脱液洗脱的微生物细胞比率
a:菌体发酵液的活菌浓度，单位为CFU/g(相当于CFU/ml)
a/241:实验开始时，玉米秸秆处理混合物中的活菌浓度：实验所述玉米秸秆处理混合物相当于将菌体发酵液稀释241倍，故a/241为实验启动时玉米秸秆处理混合物中的活菌浓度，单位为CFU/g(相当于CFU/ml)
b:洗脱液中的活菌浓度，单位为CFU/g(相当于CFU/ml)
b×4:取样时，玉米秸秆处理混合物洗脱下的活菌浓度，单位为CFU/g(相当于CFU/ml)：因洗脱过程相当于将混合物中的菌浓度稀释4倍(10g玉米秸秆处理混合物用40ml洗脱)；
a/241－b×4：与玉米秸秆粘附的活菌浓度，单位为CFU/g(相当于CFU/ml)。
所述条件下秸秆菌株粘附率结果见表2：
表2菌株秸秆粘附率
Figure BDA0002141335380000102
Figure BDA0002141335380000111
结果表明：实验周期内，枯草芽孢杆菌ASD05菌株能够很好的粘附在玉米秸秆表面，随时间推移粘附率下降幅度较低，说明枯草芽孢杆菌ASD05菌株对秸秆粘附性较强；而毕赤酵母ATCC 28485、短小乳杆菌ATCC367及枯草芽孢杆菌ATCC 15134菌株对秸秆粘附率较低，不能很好的粘附在玉米秸秆表面，且随着时间推移粘附率明显下降，说明这些菌株对秸秆粘附作用较弱且不持久，同时可能有部分细胞进入秸秆的孔洞、缝隙中，后期被洗脱液冲出；
实验例2：
实施例1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05富集、提高其它微生物与秸秆的粘附率实验
以毕赤酵母ATCC 28485和短小乳杆菌ATCC 367分别为例，同时以枯草芽孢杆菌ATCC 15134为实验对照。
(1)80℃条件下，将玉米秸秆烘干至恒重，粉碎至0.2cm粒径的颗粒，冷却至室温备用；
(2)分别取枯草芽孢杆菌ASD05菌体发酵液、毕赤酵母ATCC 28485菌体发酵液、短小乳杆菌ATCC 367菌体发酵液及枯草芽孢杆菌ATCC 15134菌体发酵液，以无菌蒸馏水调节活菌密度均为a(单位为CFU/ml)；
(3)将枯草芽孢杆菌ASD05菌体发酵液、毕赤酵母ATCC 28485菌体发酵液按照体积比1:1比例混合，记为A组；将枯草芽孢杆菌ASD05菌体发酵液、短小乳杆菌ATCC 367菌体发酵液按照体积比1:1比例混合，记为B组；枯草芽孢杆菌ATCC 15134菌体发酵液、毕赤酵母ATCC 28485菌体发酵液按照体积比1:1比例混合，记为C组；将枯草芽孢杆菌ATCC 15134菌体发酵液、短小乳杆菌ATCC 367菌体发酵液按照体积比1:1比例混合，记为D组；
(4)按照玉米秸秆：无菌水：菌体发酵液(重量比)＝200：40：1的比例，向玉米秸秆中分别加入无菌水和A、B、C、D四组菌体发酵液并混合均匀，置于敞开口的容器中，制得玉米秸秆处理混合物；
(5)将所得玉米秸秆处理混合物置于4℃冰箱孵育72h，以去除细胞增殖和死亡对于实验结果的影响；
(6)实验开始后，每隔12h分别取10g上述玉米秸秆处理混合物，反复以40mL的0.9％NaCl溶液缓慢冲洗该混合物2遍，得洗脱液；
(7)分别取冲洗后的洗脱液，以平板计数的方法计算溶液活菌密度，记为b(单位为CFU/ml))：进行平板计数时，以含氯霉素的YPD培养基(氯霉素终浓度为10mg/L)，30℃培养48h，统计毕赤酵母ATCC 28485活菌数(此条件下枯草芽孢杆菌不生长)；以MRS培养基，30℃并置于厌氧手套箱中培养48h，统计短小芽孢杆菌ATCC 367活菌数(此条件下枯草芽孢杆菌不能形成菌落)；
(8)通过比较洗脱液中的活菌数与玉米秸秆处理混合物初始活菌数，可得秸秆菌株粘附率c(％)，具体计算方法参考实验例1中步骤的(7)。
(9)所述条件下上述菌株对秸秆粘附率结果见表3：
表3菌株秸秆粘附率
Figure BDA0002141335380000121
Figure BDA0002141335380000131
结果表明，枯草芽孢杆菌ASD05与毕赤酵母ATCC 28485或短小乳杆菌ATCC 367分别混合后，能够大大提高后二者的秸秆粘附率。即枯草芽孢杆菌ASD05不但自身具有较强的秸秆粘附性，而且能够显著提高其它菌株的秸秆粘附性，而对照枯草芽孢杆菌ATCC 15134并不具备此功能。基于此特性，枯草芽孢杆菌ASD05可在秸秆生物处理中提高其它微生物与秸秆的粘附特性，增强秸秆-菌株直接接触，进而提高菌株对秸秆的降解效率。
实施例5：
实施例1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05在玉米秸秆改性材料加工中的应用
(1)取实施例4获得的枯草芽孢杆菌ASD05菌体发酵液，活菌密度为8×109CFU/mL；
(2)在80℃条件下，将玉米秸秆烘干至恒重，粉碎至0.2cm粒径；
(3)按照玉米秸秆：无菌水：菌体发酵液(重量比)＝200:40:1的比例，向玉米秸秆中加入无菌水和菌体发酵液并混合均匀，置于敞开口的容器中，40℃孵育48h；
(4)孵育处理完毕后，80℃条件下，将步骤(3)中剩余秸秆烘干36h至恒重，即得以玉米秸秆为原料的多孔性秸秆改性材料；以高效液相色谱法(HPLC)测定实验前后处理液中的葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸含量；测定处理后秸秆材料的比表面积、孔容；以扫描电子显微镜对处理前、后的秸秆样品进行观察。
应用结果如下：
(a)木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖分别为木聚糖、果胶和纤维素生物降解的主要产物之一，以高效液相色谱法(HPLC)测定实验前、后处理液中的木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖含量，以分别表征木聚糖、果胶和纤维素降解情况；结果表明，处理后反应液中的木糖含量为1.8％，半乳糖醛酸含量为0.12％，葡萄糖含量为0，表明枯草芽孢杆菌ASD05的菌体发酵液具有高木聚糖酶和果胶酶活性，能够高效降解玉米秸秆中的木聚糖和果胶，同时不破坏纤维素；
(b)以氮气吸附法测定处理后秸秆的比表面积和孔容数据，经测定，处理后秸秆材料的比表面积可达755m2/g，孔容可达0.65cm3/g，表明经枯草芽孢杆菌ASD05处理后，秸秆比表面积、孔容显著增加，成为一种良好的多孔性材料；
(c)用扫描电子显微镜对处理前、后的秸秆样品进行了观察，观察的结果照片见图3和图4；相对于图3中处理前的秸秆，图4中枯草芽孢杆菌ASD05菌体发酵液处理后的秸秆微观结构发生显著改变，在秸秆完整性骨架得以保留的前提下，表面出现大量孔洞，说明实验条件下枯草芽孢杆菌ASD05对玉米秸秆有很好的降解效果。
实施例6：
实施例1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05在小麦秸秆改性材料加工中的应用
(1)取实施例4获得的枯草芽孢杆菌ASD05菌体发酵液，活菌密度为8×109CFU/mL；
(2)80℃条件下，将小麦秸秆烘干至恒重，粉碎至0.2cm粒径；
(3)按照小麦秸秆：无菌水：菌体发酵液(重量比)＝100：20：0.6的比例，向小麦秸秆中加入无菌水和菌体发酵液并混合均匀，置于敞开口的容器中，37℃孵育48h；
(4)孵育处理完毕后，85℃条件下，将剩余秸秆烘干30h至恒重，即得以小麦秸秆为原料的多孔性秸秆改性材料；以高效液相色谱法(HPLC)测定实验前后处理液中的葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸含量；测定处理后秸秆材料的比表面积、孔容。
应用结果如下：
(a)用HPLC测定实验前、后处理液中的木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖含量，以分别表征木聚糖、果胶和纤维素降解情况，结果表明，处理后反应液中的木糖含量为1.5％，半乳糖醛酸含量为0.10％，葡萄糖含量为0，表明枯草芽孢杆菌ASD05的菌体发酵液具有高木聚糖酶和果胶酶活性，能够高效降解小麦秸秆中的木聚糖和果胶，同时不破坏纤维素；
(b)以氮气吸附法测定处理后秸秆的比表面积和孔容数据，经测定，处理后秸秆材料的比表面积可达715m2/g，孔容可达0.63cm3/g，表明经枯草芽孢杆菌ASD05处理后，秸秆比表面积、孔容显著增加，成为一种良好的多孔性材料。
实施例7：
实施例1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05在马铃薯秸秆改性材料加工中的应用
(1)取实施例4获得的枯草芽孢杆菌ASD05菌体发酵液，活菌密度为8×109CFU/mL；
(2)80℃条件下，将马铃薯秸秆烘干至恒重，粉碎至0.2cm粒径；
(3)按照马铃薯秸秆：无菌水：菌体发酵液(重量比)＝200:40:1的比例，向马铃薯秸秆中加入无菌水和菌体发酵液并混合均匀，置于敞开口的容器中，37℃孵育60h；
(4)孵育处理完毕后，90℃条件下，将剩余秸秆烘干36h至恒重，即得以马铃薯秸秆为原料的多孔性秸秆改性材料；以高效液相色谱法(HPLC)测定实验前后处理液中的葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸含量；测定处理后秸秆材料的比表面积、孔容。
应用结果如下：
(a)用HPLC测定实验前、后处理液中的木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖含量，以分别表征木聚糖、果胶和纤维素降解情况，结果表明，处理后反应液中的木糖含量为1.4％，半乳糖醛酸含量为0.10％，葡萄糖含量为0，表明枯草芽孢杆菌ASD05的液体发酵培养液具有高木聚糖酶和果胶酶活性，能够高效降解马铃薯秸秆中的木聚糖和果胶，同时不破坏纤维素；
(b)以氮气吸附法测定处理后秸秆的比表面积和孔容数据，经测定，处理后秸秆材料的比表面积可达685m2/g，孔容可达0.62cm3/g，表明经枯草芽孢杆菌ASD05处理后，秸秆比表面积、孔容显著增加，成为一种良好的多孔性材料。
为进一步验证枯草芽孢杆菌ASD05在秸秆改性材料加工中有益效果，换用若干其它菌株进行了对比试验。
对比例1：
毕赤酵母ATCC 28485在玉米秸秆生物处理中的应用效果
如实施例5所述，不同之处在于，将枯草芽孢杆菌ASD05换为毕赤酵母ATCC 28485(Pichia pastoris ATCC 28485)。
应用结果如下：
(1)用HPLC测定实验前、后处理液中的木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖含量，结果表明，处理后反应液中的木糖含量为0.35％，半乳糖醛酸含量为0，葡萄糖含量为0.55％，表明毕赤酵母ATCC 2848的木聚糖酶和果胶酶活性显著低于枯草芽孢杆菌ASD05，降解秸秆中的木聚糖和果胶效果较差，同时对纤维素有一定降解作用；
(2)以氮气吸附法测定处理后秸秆的比表面积和孔容数据。经测定，处理后秸秆材料的比表面积为22m2/g，孔容为0.03cm3/g，表明经毕赤酵母ATCC 28485处理后，秸秆比表面积、孔容无明显变化。
对比例2：
短小乳杆菌ATCC367在玉米秸秆生物处理中的应用效果
如实施例5所述，不同之处在于，将枯草芽孢杆菌ASD05换为短小乳杆菌ATCC 367(Lactobacillus brevis ATCC 367)。
应用结果如下：
(1)用HPLC测定实验前、后处理液中的木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖含量，结果表明，处理后反应液中的木糖含量为0.45％，半乳糖醛酸含量为0，葡萄糖含量为0.25％，表明短小乳杆菌ATCC367的木聚糖酶和果胶酶活性显著低于枯草芽孢杆菌ASD05，降解秸秆中的木聚糖和果胶效果较差，同时对纤维素有一定降解作用；
(2)以氮气吸附法测定处理后秸秆的比表面积和孔容数据。经测定，处理后秸秆材料的比表面积为20m2/g，孔容为0.02cm3/g，表明经短小乳杆菌ATCC367处理后，秸秆比表面积、孔容无明显变化。
对比例3：枯草芽孢杆菌ATCC 15134在玉米秸秆生物处理中的应用效果
如实施例5所述，不同之处在于，将枯草芽孢杆菌ASD05换为枯草芽孢杆菌ATCC15134。
应用结果如下：
(1)用HPLC测定实验前、后处理液中的木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖含量，结果表明，处理后反应液中的木糖含量为0.52％，半乳糖醛酸含量为0.02％，葡萄糖含量为0.05％，表明枯草芽孢杆菌ATCC 15134的木聚糖酶和果胶酶活性显著低于枯草芽孢杆菌ASD05，降解秸秆中的木聚糖和果胶效果较差，同时对纤维素有一定降解作用；
(2)以氮气吸附法测定处理后秸秆的比表面积和孔容数据。经测定，处理后秸秆材料的比表面积为20m2/g，孔容为0.02cm3/g，表明经枯草芽孢杆菌168处理后，秸秆比表面积、孔容无明显变化。
序列表
<110> 山东省农业科学院农业资源与环境研究所
<120> 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1439
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
cttcggcggc tggctcctaa aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60
gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120
attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca 180
gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca 240
cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300
tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420
cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720
agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780
ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840
cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtaccg ccctattcga acggtacttg 1020
ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080
ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140
ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt 1200
ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc 1260
gaagccacct tttatgtttg aaccatgcgg ttcaaacaac catccggtat tagccccggt 1320
ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380
ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactt gcatgtatag cacgcgcca 1439

Claims (15)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05，于2019年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17807。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05，接种于种子培养基，在35～38℃、200～240rpm摇床培养22～25h，制得液体种子；
(2)取步骤(1)制得的液体种子，按体积百分比0.5％的比例接种于扩大培养基，在35～38℃、200～240rpm摇床培养34～38h，制得菌液。
3.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05为将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05接种至活化培养基，在35～38℃活化培养22～25h；活化培养基为LB固体培养基。
4.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中种子培养基组分如下：
蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；Nacl 10g/L；葡萄糖5g/L；余量水。
5.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中扩大培养基组分如下：
蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；Nacl 10g/L；土豆100g/L；葡萄糖5g/L；余量水。
6.权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASD05在增加秸秆改性材料比表面积和/或孔容中的应用。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，步骤如下：
(a)取权利要求2所述菌液，按体积百分比0.5％的比例接种于诱导发酵培养基，在35～38℃、200～240rpm摇床培养36～38h，制得菌体发酵液；
(b)取干燥、粉碎的玉米秸秆，按照玉米秸秆：无菌水：菌体发酵液＝100：(10～50)：(0.3～0.8) 的重量比混合均匀，在35～45℃孵育36～60h，制得预处理玉米秸秆；
(c)将步骤(b)制得的预处理玉米秸秆在70～105℃条件下烘干24～48h，制得多孔改性秸秆材料。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤(a)中，诱导发酵培养基组分如下：
蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，土豆100g/L，木聚糖5g/L，果胶5g/L，余量水。
9.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤(b)中菌体发酵液的活菌密度为5.0×109～1.0×1010CFU/mL。
10.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤(b)中菌体发酵液的活菌密度为8.0×109CFU/mL。
11.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤(b)中干燥条件为在75～85℃条件下干燥至恒重。
12.如权利要求11所述应用，其特征在于，所述干燥条件为80℃。
13.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤(b)中，玉米秸秆：无菌水：菌体发酵液重量比＝200:40:1。
14.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤(b)中，孵育温度为40℃，孵育时间为48h。
15.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述步骤(c)中，烘干温度为80℃条件下，烘干至恒重。
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