CN112251377B - 一种短芽孢杆菌、菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种短芽孢杆菌、菌剂及其应用，短芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M20191098。本发明提供的短芽孢杆菌可以在40‑70℃下良好生长。在苯胺蓝脱色试验中，恒温培养24h内可产生直径4cm以上的脱色圈。将其应用于降解木质素中，具有短时间内快速降解木质素、木质素降解率高、耐高温、生长周期短等优点，尤其可以用于高温秸秆堆肥的菌种资源进行使用。

Description

一种短芽孢杆菌、菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种短芽孢杆菌、菌剂及其应用。

背景技术

木质素是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源，是构成植物细胞壁的主要成分之一，占15％-35％。木质素的分解对于地球的碳循环有着至关重要的影响，但因其复杂的化学结构和异质性，一直被作为废物，没有得到很好的利用，同时也使其分解和增值成为一项巨大的挑战。木质素是木质纤维素的一部分，在高等植物细胞壁的维管组织中，木质素与半纤维素和纤维素的纤丝通过共价键与非共价键紧密缠绕相互嵌合，形成木质纤维素。木质素是一种三维网状酚类的、非结晶性的高分子聚合物，松柏醇(愈创木基型)、芥子醇(丁香基型)和聚甲基丙烯醇(对羟基苯基型)，通过各种醚和C-C键连接在一起。在木质素中发现的最常见的化学键是β-芳基醚键，分别占软木和硬木中的45-50％和60％。

木质素这一资源的资源量仅在自然界中的产量每年都可以高达5.36×10⁸吨，在资源愈发紧缺的当代受到了极大的关注。而在身为农业类大国的我国，农作物秸秆年产量约9.3亿t，其中玉米秸秆37％，稻草秸秆28％，小麦秸秆15％，工业纤维残渣也有上亿吨，这本具有巨大的经济潜力，但因为木质素分解难等问题，使得这些利益在一次次焚烧中消失，得到的是越来越严重的雾霾和其他环境问题，这惨痛的事实印证着木质素分解研究的重要性和紧迫性。在近些年来对于木质素分解的研究中，细菌凭借相较于物化方法的低能耗、低污染，相较于真菌的高适应能力、短培养时间等优势成为了木质素分解研究领域的新方向。但是，目前采用细菌分解木质素，培养10-15天分解效率一般在10-30％左右，存在处理时间长、分解效率较低等问题。

在对木质素分解细菌的研究中，人们逐渐扩大了木质素的经济性，木质素应用方式也越来越多，在造纸、制作生物燃料方面的应用自不必多讲，已经存在许多年且技术已经日渐成熟，逐渐投入生产。近年来，人们还发现，木质素等芳香族化合物在分解过程中可以产生芳香醛等物质，通过对其分解过程的调控可以生产香兰素作为食品添加剂，Kaur等人研究发现了一种高效的使用木质素的生物堆肥方式；Lee S C等人则首次将木质素作为天然的防晒成分使用。这表明，通过对木质素分解细菌的研究，木质素的应用开始变得广泛而多样化，人们不再局限于任何一种使用方法，开始开发各种新颖的木质素利用方式。

现在筛选得到的木质素降解真菌和部分细菌，属于低温木质素降解菌，这些菌株普遍存在发酵周期长，在高温条件下不易存活等特点，但在秸秆发酵处理和秸秆堆肥中，通常会需要较高的温度，例如Kaur等人研发的木质素堆肥过程中，堆温从25℃升高到70℃。而低温木质素降解菌在此特殊环境中对木质素的降解率非常低，甚至不降解木质素，因此筛选高温、产酶活性强、发酵周期短的木质素分解菌具有重要意义。

木质素等可再生物质的应用是大势所趋，而细菌在木质素分解及应用方面的优势使其势必会成为焦点，研究木质素分解菌，研究其分离方法，获得新的木质素分解菌株，可为以后对木质素分解细菌、酶、分解通路以及木质素分解细菌的应用提供有力支持和帮助。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种短芽孢杆菌、菌剂及其应用。本发明提供的短芽孢杆菌可以在40-70℃下良好生长。在苯胺蓝脱色试验中，24h内可产生直径4cm的脱色圈。将其应用于降解木质素中，具有短时间内快速降解木质素、木质素降解率高、耐高温、生长周期短等优点，尤其可以用于高温秸秆堆肥的菌种资源进行使用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种短芽孢杆菌，属于波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)，在保藏时将其命名为波茨坦短芽孢杆菌H-b1(Brevibacillusborstelensis H-b1)，在本发明实施例中将其简称为LDH-b1，于2019年12月24日送入中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并于2020年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M20191098。该菌株为高温木质素降解细菌，在高温环境下，该菌株在生长繁殖过程中分解秸秆等具有木质素的材料，具有短时间内快速降解木质素、木质素降解率高、耐高温等优点。

显微镜下菌体形态呈杆状。所述短芽孢杆菌外观为圆形，淡黄色，边缘整齐，较湿润，革兰氏染色反应呈阳性。所述短芽孢杆菌的16SrDNA序列包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，16SrDNA序列系统进化树显示菌株与Brevibacillus borstelensis同源。该菌株可以在40-70℃条件下良好生长，优选地，该菌株可以在40-65℃条件下良好生长，进一步，该菌株在40-60℃条件下良好生长。所述短芽孢杆菌苯胺蓝脱色反应为阳性，在苯胺蓝脱色试验中，24h内可产生直径4cm的脱色圈，为可用于高温秸秆堆肥的菌种资源。

本发明提供一种菌剂，包括上述短芽孢杆菌和/或上述短芽孢杆菌的发酵液。本发明提供的菌剂中，可以只含有上述短芽孢杆菌和/或上述短芽孢杆菌的发酵液，也可以除了上述短芽孢杆菌和/或上述短芽孢杆菌的发酵液外还包括其他成分，例如：为满足工艺、储存等等需要添加的辅料等，在不降低本发明菌株作用前提下添加其他菌株等。

本发明还提供一种上述短芽孢杆菌发酵培养方法，包括以下步骤：将短芽孢杆菌接种到培养基，40℃-70℃发酵培养。采用上述方法有利于菌株的生长，耐高温、生长周期短等优点。

本发明还提供上述短芽孢杆菌在木质素降解中的应用。尤其适用于各种生物质，例如：分解水稻秸秆、玉米秸秆等农作物秸秆。该菌株具有短时间内快速降解木质素的优点，在本发明实施例中，菌株在未经优化的培养条件下，于50℃下经过24h对碱木质素的降解率为13％，远远高于现有技术中处理10天的碱木质素的降解率。

本发明还提供上述菌剂在木质素降解中的应用。

本发明还提供一种利用上述短芽孢杆菌降解木质素的方法，包括以下步骤：将上述短芽孢杆菌接种到含有木质素的培养基，发酵培养。采用上述方法具有具有短时间内快速降解木质素的优点，木质素降解率高等优点。

本发明还提供一种利用上述菌剂降解木质素的方法，包括以下步骤：将上述菌剂接种到含有木质素的培养基，发酵培养。采用上述方法具有具有短时间内快速降解木质素的优点，木质素降解率高，耐高温、生长周期短等优点。

附图说明

图1为菌株LDH-b1的显微镜观察图。

图2为菌株LDH-b1的苯胺蓝脱色图。

图3为菌株LDH-b1的基于16SrDNA序列的系统进化树。

图4为碱木质素标准曲线。

图5为菌株LDH-b1在不同温度培养24h的碱木质素率。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供的短芽孢杆菌，菌株名称为波茨坦短芽孢杆菌H-b1(Brevibacillusborstelensis H-b1)，保藏号为CCTCC NO:M20191098。在本申请实施例中将该菌株命名为LDH-b1。LDH-b1筛选自50℃富集条件下，具有降解天然木质素的能力，且苯胺蓝脱色效率高。

本发明的木质素分解细菌LDH-b1为在50℃的MSM培养基(含有碱木质素)中培养的革兰氏阳性细菌。MSM培养基(含有碱木质素)包括以下成分：NaNO₃ 2.5g；KH₂PO₄ 1.0g；NaCl0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；CaCl₂ 0.1g；微量元素混合液1mL。微量元素混合液(g·L^-1)：FeCl₃·6H₂O 0.16g；ZnSO₄·7H₂O 1.5g；CoCl₂·6H₂O 0.16g；CuSO₄·5H₂O 0.15g；MnSO₄·H₂O 1.5g；H₃BO₃ 0.3g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.1g；碱木质素3g，蒸馏水1000mL，pH为8.3。

LDH-b1菌株显微镜观察图如图1所示，从图1中可以看出LDH-b1为芽孢杆菌。

其鉴定的生理生化特征：在50℃下培养24h，LDH-b1菌株在外观特征显示在表1中。

表1

菌种	边缘	形状	表面	颜色
					LDH-b1	整齐	圆球状	较湿润	淡黄色

菌株LDH-b1的分子生物学鉴定结果：通过16SrDNA序列比对，与Brevibacillusborstelensis strain UTM105同源性为99％以上，菌株LDH-b1的16SrDNA序列系统进化树显示菌株LDH-b1和Brevibacillus borstelensis同源。

本发明提供的菌株LDH-b1，可在40-70℃条件下培养。

菌株LDH-b1在高温及未经优化的培养条件下可以有效降解碱木质素，24h降解率可达10％以上。例如，菌株LDH-b1在未经优化的培养条件下，于50℃下经过24h对碱木质素的降解率为13.1％。

本发明的木质素分解细菌的分离培养方法首先是对土壤样品进行富集，再用限制性培养基对土壤中的木质素分解菌进行再富集然后将其稀释涂布在LB培养基上培养，筛选能够以木质素为唯一碳源的菌株，最后分析该菌株的木质素分解能力。

实施例1：土壤微生物LDH-b1的分离培养

1、样品采集：在2018年6月份前往黑龙江省伊春市，于森林腐木20cm内取土样，分别在表层、5cm和10cm深度取土样，用密封袋收集土壤，采集结束后于实验室内将三种土样进行混合，混匀后的土样分成三份，作为三个重复，液氮速冻后放到-80℃冰箱保藏备用。

2、土壤富集与分离

分别准确称取混匀的土样1g，放入装有100ml双蒸水的250ml锥形瓶中，放入摇床，以120rpm/min，震荡30分钟，30℃或者常温，静置1小时，取上清液按照体积比1:10的比例分别接种于以愈创木酚(1ml/L)为唯一碳源的MSM培养基内进行液体培养7d，取显色菌液按照10％的接菌量进行传代培养，待菌系稳定(持续稳定显色)后，取培养好的菌液进行梯度稀释至10^-7倍，稀释后均匀涂布于LB培养基上，倒置50℃恒温培养，每个梯度设三个平行。

培养24小时，观察培养基上细菌的生长情况，挑取大小形态颜色不同的菌落，划线到LB培养基上连续培养，每个菌落纯化三次以上，获得具有苯胺蓝脱色能力的菌株，将其转接到液体LB培养基内培养，甘油法保藏备用。

3、菌种筛选

采用苯胺蓝脱色法筛选木质素分解细菌。配置苯胺蓝固体培养基(酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，苯胺蓝0.1g/L，琼脂20g/L，蒸馏水1L)，之前筛得的菌株，用接菌环挑取单菌落点在苯胺蓝脱色培养基平板中心，恒温培养24小时，观察脱色与否和脱色圈的大小，产生脱色圈表示过氧化物酶(木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶)活性为阳性，每个菌株三个重复，以保证试验准确性。

利用苯胺蓝脱色法鉴定过氧化物酶活，是一种信服度较高的过氧化物酶活测定方法。

平板培养方法：取苯胺蓝脱色能力较高的菌株，进行液体培养，稀释(分别稀释为10^-1到10^-7倍)，涂布于碱木质素限制性培养基(MSM培养基的基础上添加碱木质素3g/L)，无菌水涂布的培养基作为空白对照。将平板倒置于50℃恒温培养箱内静置培养，注意观察培养基上的菌落生长情况。判断菌株是否能以碱木质素为唯一碳源进行生长。

通过苯胺蓝脱色和碱木质素限制性培养方法筛选出木质素分解菌LDH-b1，由于菌能够在两种环境下生长(即可以在苯胺蓝脱色培养基和碱木质素限制性培养基生长)，分析其为木质素分解菌株。LDH-b1在24h内可产生直径4cm的脱色圈。图2为菌株LDH-b1的苯胺蓝脱色图，左侧为LDH-b1接菌后苯胺蓝脱色图；右侧为滴加等量培养基的空白对照；从图2中可以看出左侧LDH-b1脱色范围内显示为浅黄色，且整体蓝色较浅，而右侧对照组显示深蓝色，说明LDH-b1苯胺蓝脱色效果良好，LDH-b1具有良好的过氧化物酶酶活性。

实施例2LDH-b1的16SrDNA序列分析

将菌株LDH-b1送往上海派森诺生物科技股份有限公司进行16SrDNA测序分析，从而进行菌种鉴定。

菌种鉴定结果：将测序得到的菌株序列在NCBI上进行Blast序列比对，比对结果显示，菌株LDH-b1的序列与Brevibacillus borstelensis序列相似度为99.86％，据此可以确定菌株LDH-b1在分子系统发育分类学上属于Brevibacillus borstelensis。

菌株LDH-b1的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。图3为菌株LDH-b1的基于16SrDNA序列的系统进化树。从图3可以看出与LDH-b1亲缘关系最近的菌株为Brevibacillusborstelensis UTM105，说明LDH-b1在分子系统发育分类学上属于Brevibacillusborstelensis。

实施例3木质素分解菌LDH-b1的碱木质素分解能力。

将液体培养的木质素分解菌LDH-b1按10％的接种量接种于以碱木质素为唯一碳源的液体培养基(MSM培养基的基础上添加碱木质素3g/L)培养，做三个重复，以接种等量无菌水的培养基为空白，分别在40℃、50、60、70℃恒温培养箱内恒温培养。

碱木质素标准曲线绘制：称取碱性木质素，配制成不同的浓度梯度的碱木质素溶液，离心取上清，在280nm处测定不同浓度碱木质素的吸光度值。以碱木质素浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，得到碱木质素标准曲线(如图4所示)。

将碱木质素降解培养基在12000rpm下离心5min，取上清液测定其在280nm处的吸光值，根据碱木质素标准曲线计算得到菌株LDH-b1的碱木质素降解率(图5)。从图5中可以看出接菌后24h，相较于空白对照的1.5％的降解率(接种无菌水后碱木质素溶液被稀释)，菌株LDH-b1在40、50、60、70℃下恒温培养分别可以降解12.7％、13.1％、13％、11.6％的碱木质素，说明菌株LDH-b1具有较好的木质素降解能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江苏进化树生物科技有限公司

<120> 一种短芽孢杆菌、菌剂及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1418

<212> DNA

<213> 短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)

<400> 1

ctatacatgc agtcgagcga gtcccttcgg gggctagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60

aggcaacctg cccgtaagct cgggataaca tggggaaact catgctaata ccggataggg 120

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Claims (7)

1.一种波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)H-b1，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:M20191098。

2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述波茨坦短芽孢杆菌H-b1和/或权利要求1所述所述波茨坦短芽孢杆菌H-b1的发酵液。

3.权利要求1所述波茨坦短芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将波茨坦短芽孢杆菌H-b1接种到培养基，40℃-70℃发酵培养。

4.权利要求1所述波茨坦短芽孢杆菌H-b1在木质素降解中的应用。

5.权利要求2所述菌剂在木质素降解中的应用。

6.一种利用权利要求1所述波茨坦短芽孢杆菌H-b1降解木质素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述波茨坦短芽孢杆菌H-b1接种到含有木质素的培养基，发酵培养。

7.一种利用权利要求2所述菌剂降解木质素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2所述菌剂接种到含有木质素的培养基，发酵培养。

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