CN116004781A

CN116004781A - 一种基于宏基因组数据挖掘解析微生物群体功能并构建功能微生物组的方法

Info

Publication number: CN116004781A
Application number: CN202211593369.9A
Authority: CN
Inventors: 庄伟�; 王石垒; 陈进孟; 应汉杰; 王志; 蔡亚凡; 刘金乐; 饶远; 欧阳平凯
Original assignee: Zhengzhou University; Nanjing Tech University
Current assignee: Zhengzhou University; Nanjing Tech University
Priority date: 2022-12-13
Filing date: 2022-12-13
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明提供了一种基于宏基因组数据挖掘解析微生物群体功能并构建功能微生物组的方法，(1)以自然环境菌群为样本进行总基因组的提取；(2)利用高通量测序技术解析所提取自然环境菌群中的全部物种组成，通过CBS‑KNAW及EzBioCloud可培养数据库，确定细菌和真菌的种属；(3)通过FAPROTAX数据库和FUNGuild数据库对所确定细菌和真菌进行功能预测，得到全部功能；(4)在所确定的全部功能中，细菌和真菌菌群分别选择与木质纤维素降解相关的6种以上的功能和2种以上的功能，通过功能丰度大小确定具有促进木质纤维素降解功能的菌株。该方法为秸秆的高效降解以及功能微生物的构建提供一种新的思路和方法。

Description

一种基于宏基因组数据挖掘解析微生物群体功能并构建功能微生物组的方法

技术领域

本发明涉及生物信息学领域，具体涉及一种基于宏基因组数据挖掘快速解析微生物群体对木质纤维素的降解功能，准确地构建以高效降解木质纤维素为功能的合成微生物组方法。

背景技术

进入21世纪以来随着经济的快速发展，能源和环境问题日益突出，生物质资源的开发和利用逐渐被全世界所重视。现阶段，生物资源主要包括农作物秸秆和林业废弃物。我国有丰富的农林生物质资源，仅农作物秸秆就占世界秸秆总量的30％。然而我国的农作物秸秆的有效利用率只有约27.5％，其余大部分则以还田、丢弃以及焚烧的方式倾入环境中，对环境造成了大量的污染。对于秸秆的降解，微生物群落起着至关重要的作用。环境中存在大量可降解植物秸秆的微生物，相关研究者已分离获得200余种具有秸秆降解活性的真菌、细菌和放线菌，但依然有大量能够降解秸秆的微生物有待于发现，因此从自然界筛选能降解木质纤维素的微生物仍然是人们研究的重要工作。微生物自身产生木质纤维素降解酶系通过发酵与降解环境相互作用形成具有特定功能的菌群，利用各自的功能和特性实现降解，且其种类、数量、分布对木质纤维素降解具有重要的影响。因此，对秸秆降解中功能微生物菌群及降解效果的研究显得尤为必要。

随着合成微生物组学的快速发展，越来越多的科学家不再局限于将多个基因模块进行组装从而实现特定的生物功能，进而开始对行使不同功能的微生物菌株进行整合，人工创建可以满足特定需求的微生物群落。但是传统人工合成微生物组学会面临诸多弊端，比如合成后微生物组的功能无法准确得知、功能菌株无法确定、菌株间相互作用无法解析等，从而导致合成效率低下。目前，在构建合成微生物组方面，缺少一种高效、全面、准确的构建方法来实现秸秆木质纤维素的降解。因此，本专利先利用宏基因组学解析微生物种类和群体功能，然后进行功能菌株的定向筛选，最后依据相互作用、空间协调、菌群稳定和生物遏制等原则，构建高效、全面、准确的合成微生物组。在农业生产中，秸秆难降解的问题会进一步影响作物出苗，导致作物病虫害的发生等诸多问题，然而原位的木质纤维素分解菌在生产上有很多问题，如生产周期长，产品质量不稳定，易污染，纤维素酶活较低等，暂不能满足大规模生产需要，所以合成微生物组的应用可以加快秸秆腐解过程，改善土壤质量，提升作物产量。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对功能菌株快速筛选技术的不足，提供一种基于宏基因组数据挖掘解析微生物群体功能并筛选促进木质纤维素降解菌株的方法。

本发明还要解决的技术问题是提供上述方法在筛选促进木质纤维素降解菌株中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供一种微生物组在降解木质纤维素中的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种基于宏基因组数据挖掘解析微生物群体功能并筛选促进木质纤维素高效降解菌株的方法，包括以下步骤：

(1)以自然环境菌群为样本进行总基因组的提取；

(2)利用高通量测序技术解析步骤(1)所提取自然环境菌群中全部物种组成，通过CBS-KNAW及EzBioCloud可培养数据库，确定微生物中细菌和真菌的种属；

(3)分别通过FAPROTAX数据库和FUNGuild数据库对步骤(2)所确定细菌和真菌进行功能预测，得到样本微生物对应全部功能；

(4)在步骤(3)所确定的全部功能中，细菌和真菌分别选择与木质纤维素降解相关的6种以上的功能和2种以上的功能，通过功能丰度大小确定具有促进木质纤维素高效降解功能的菌株。

步骤(1)中，所述自然环境菌群包括但不限于玉米、小麦、土壤、森林腐殖质、湖泊、海洋等。

步骤(2)中，通过与数据库进行比对，确定微生物的具体界、门、纲、目、科、属、种。

步骤(3)中，细菌通过FAPROTAX数据库得到与木质纤维素降解有关的13种功能，真菌通过FUNGuild数据库得到与木质纤维素降解有关的5种功能，确定相关菌株为具有高效降解木质纤维素功能的菌株。

其中，所述13种功能分别是硝化作用、脱氮、纤维素分解、发酵、需氧化学异养、芳香烃降解、芳香族化合物降解、烃降解、硝酸盐呼吸、硝酸盐还原、氮呼吸、尿素溶解、化学异养；所述5种功能分别是共生营养型、腐生生物、腐生-共生、病理-腐生、病理-腐生-共生。

本发明所提供的该方法能够快速判定出不同生境中微生物的种类和功能分类，准确地解析出样本中所含微生物的组成比例和微生物所对应的功能分类。并通过定向筛选技术，筛选出目标功能菌株，构建具有高效降解木质纤维素功能的微生物组。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述第一个技术问题中所述方法在筛选促进木质纤维素降解菌株中的应用。

其中，所述促进木质纤维素降解菌株为真菌和/或细菌类群，或由所述真菌和/或细菌制备得到的合成微生物组。

其中，所述真菌为绿色木霉(Trichoderma viride)、黑曲霉(Aspergillusniger)、芽枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)和紧密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)中的任意一种或几种组合。

其中，所述细菌为悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中的任意一种或几种组合。

其中，所述绿色木霉(Trichoderma viride)的ITS在Genbank的登陆号为OP564920；

所述黑曲霉(Aspergillus niger)的ITS在Genbank的登陆号为OP580494；

所述芽枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)的ITS在Genbank的登陆号为OP564919；

所述紧密帚枝霉(Sarocladium strictum)的ITS在Genbank的登陆号为OP564921；

所述悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)的16SrDNA在Genbank的登陆号为OP503381；

所述约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)的16SrDNA在Genbank的登陆号为OP503372；

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的16SrDNA在Genbank的登陆号为OP503383；

所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的16SrDNA在Genbank的登陆号为OP503382。

其中，所述微生物组的制备方法包括如下步骤：

S1：将所述真菌分别接种于PDA液体培养基中，培养，得到各真菌的菌丝球悬液，将各菌丝球悬液混合后得到第一菌群；

S2：将所述细菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基和MRS液体培养基的混合培养基中，培养，得到各细菌的菌体悬液，将各菌体悬液混合后得到第二菌群；

S3：将第一菌群和第二菌群混合后，即得所述合成微生物组。

步骤S1中，所述各菌丝球悬液按照0.1～1:0.1～1的体积比混合；优选地，所述真菌为绿色木霉(Trichoderma viride)、黑曲霉(Aspergillus niger)、芽枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)和紧密帚枝霉(Sarocladium strictum)的组合，四种菌的菌丝球悬液按照0.1～1:0.1～1:0.1～1:0.1～1的体积比混合，优选为按照1:1:1:1的体积比混合。

步骤S1中，所述PDA液体培养基的组成为200g马铃薯、20g葡萄糖、1000mL蒸馏水，115℃灭菌20min。

步骤S1中，所述培养的温度为20～40℃，优选为25～35℃，进一步优选为30℃。

步骤S1中，所述培养的时间为10h以上，优选为10～30h，进一步优选为20h。

步骤S2中，所述各菌体悬液按照0.1～1:0.1～1的体积比混合；优选地，所述细菌为悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的组合，四种菌体悬液按照0.1～1:0.1～1:0.1～1:0.1～1的体积比混合，优选为按照1:1:1:1的体积比混合。

步骤S2中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成为3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠、1000mL蒸馏水、121℃灭菌20min。

步骤S2中，所述MRS液体培养基的组成为10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、1000mL蒸馏水、115℃灭菌20min。

步骤S2中，所述培养的温度为35～45℃，优选为37℃。

步骤S1中，所述培养的时间为2～14h以上，优选为8h。

步骤S3中，所述第一菌群和第二菌群按照1:0.1～1的体积比混合，优选为按照1:1的体积比混合。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了一种微生物组在木质纤维素降解中的应用，所述微生物组由真菌和/或细菌制备得到。

其中，所述微生物组的制备方法包括如下步骤：

步骤S2中，所述培养的温度为35～45℃，优选为37℃。

步骤S1中，所述培养的时间为2～14h以上，优选为8h。

其中，将所述微生物组按照1％～20％的质量比接种到木质纤维素底物中，发酵，即能高效降解木质纤维素。

其中，所述发酵的温度为20～40℃，优选为25～35℃，进一步优选为30℃。

其中，所述发酵的时间为5天以上，优选为5～45天，进一步优选为15～35天，更进一步优选为20～30天。

其中，在发酵后，纤维素的降解率为35％以上，半纤维素的降解率为45％以上；优选地，在发酵后，纤维素的降解率为40％以上，半纤维素的降解率为50％以上。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

本发明首先进行多生态环境DNA基因组的提取，并结合高通量测序技术解析出样本微生物物种组成，筛选出相应微生物物种，并利可培养数据库来确定筛选菌株的功能作用，然后通过定向菌株筛选技术来筛选具有高效降解木质纤维素功能的目标菌株，最后利用自上而下的方法合成微生物组。本发明所提供的方法能够快速、准确地解析出样本中微生物的种类，为秸秆的高效降解以及功能微生物的构建提供一种新的思路和方法。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为本发明的工艺流程图。

图2为样本细菌(A)与真菌(B)在纲水平下的物种组成图；C1：堆呕玉米秸秆；C3：玉米秸秆还田土壤；C5：农田土壤，每组3个平行样。

图3为样本种细菌(A)与真菌(B)功能丰度柱状图；C1：堆呕玉米秸秆；C3：玉米秸秆还田土壤；C5：农田土壤，每组3个平行样。

图4为使用合成微生物组发酵前后玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的含量变化。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：采样

以河南省周口市秸秆、土壤为研究对象，通过提取样本基因组DNA，结合高通量测序技术解析样本中微生物的种类与含量，为后续合成高效降解微生物组提供一种新的思路和方法。

试验选取了3个不同的土壤采样点，每个采样点三个重复，如表1所示。

表1

实施例2：样本宏基因组DNA的提取

分别称取7.00g实施例1采集的样品于50mL离心管中，用15mL灭菌后的0.1mol·L^- ¹PBS缓冲液悬浮，加入3颗玻璃珠，漩涡振荡5min；300g离心5min，取上清(5mL)，然后离心管中加5mL PBS缓冲液重复震荡5min，300g离心后收集上清重复3次(共计20mL上清)；全部上清9,000g离心3min，弃上清，收集细胞沉淀；沉淀再用5mL PBS洗3次，每次9,000g离心3min收集沉淀。

取细胞沉淀，重新悬浮于1mL 0.1mol·L^-1PBS缓冲液(转移至2mL离心管)；混匀后，转移到加有0.3g玻璃珠(直径0.1mm)的螺帽管(或2mL EP管)中，加入150μL苯酚，beadbeater细胞破碎仪以最大速度(3000g)击打4min；击打后加入110μL 10％SDS，轻轻颠倒混匀后，冰浴10min，每5min轻轻颠倒摇匀；加入150μL氯仿：异戊醇(24:1v/v)溶液，轻轻混匀，于12,000r·min^-1离心10min，吸取上清(约800μL)，加入1/10体积(约80μL)的3mol·L^-1NaAc；用等体积(约800μL)的酚抽提一次，于12,000r·min^-1离心10min，吸取上清700μL；用等体积(约700μL)的酚：氯仿混合液抽提一次，于12,000r·min^-1离心10min，吸取上清600μL；用等体积(约600μL)的氯仿抽提一次，于12,000r·min^-1离心10min，吸取上清500μL；加入2倍体积(约1000μL)的冰无水乙醇，于-20℃沉淀2h以上。

沉淀结束后于12,000r·min^-1离心15min，弃上清；沉淀于真空冷冻干燥后溶于40μLTE buffer中；加入20mg·mL^-1RNase A 3μL，37℃保温15min；测定DNA浓度(260/280＝1.6-2.0；浓度＞500ng/μL)，-20℃保存。

实施例3：宏基因组高通量测序

取30μL实施例2所提取的样本宏基因组DNA送至上海派森诺生物科技股份有限公司，选择细菌引物338F(5’-actcctacgggaggcagca-3’)和806R(5’-ggactachvgggtwtctaat-3’)，真菌引物ITS3(5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’)和ITS4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)，在Illumina Miseq平台上测序以97％的阈值对序列进行聚类分析，解析样本微生物菌群的物种组成。通过CBS-KNAW及EzBioCloud可培养数据库，确定微生物的种属；土壤细菌、真菌属水平下的物种组成如图2所示，功能丰度如图3所示。

实施例4：具有与木质纤维素高效降解功能相关的菌株确定和分离

将实施例3高通量测序所得微生物的物种，通过FAPROTAX数据库和FUNGuild数据库得到其对应功能，确定对秸秆具有高效降解功能菌株。

细菌选择与木质纤维素降解具有密切相关的13种功能，分别是硝化作用(Nitrification)、脱氮(Denitrification)、纤维素分解(Cellulolysis)、发酵(Fermentation)、需氧化学异养(Aerobic chemoheterotrophy)、芳香烃降解(Aromatichydrocarbon degradation)、芳香族化合物降解(Aromatic compound degradation)、烃降解(Hydrocarbon degradation)、硝酸盐呼吸(Nitrate respiration)、硝酸盐还原(Nitrate reduction)、氮呼吸(Nitrogen respiration)、尿素溶解(Ureolysis)、化学异养(Chemoheterotrophy)。

真菌选择与木质纤维素降解具有密切相关的5种功能，分别是共生营养型(Symbiotroph)、腐生生物(Saprotroph)、腐生-共生(Saprotroph-symbiotroph)、病理-腐生(Pathotroph-saprotroph)、病理-腐生-共生(Pathotroph-saprotroph-symbiotroph)。

通过FAPROTAX数据库和FUNGuild数据库，获得以上每种功能所对应的ASV，删除病原菌、有害菌和丰度在1％以下的ASV。然后选择每种功能所对应丰度最高的ASV作为此种功能所对应的功能菌株。会出现同种菌株具有不同功能的情况。

所得细菌为：悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)，登陆号OP503381、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)，登陆号OP503372、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，登陆号OP503383、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，登陆号OP503382四种；所得真菌为：绿色木霉(Trichoderma viride)，登陆号OP564920、黑曲霉(Aspergillus niger)，登陆号OP580494、芽枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)，登陆号OP564919、紧密帚枝霉(Sarocladium strictum)，登陆号OP564921四种。

在锥形瓶中装入5粒玻璃珠及99mL无菌水，然后取1g原料样品(实施例1中取样的秸秆和土壤C1、C3、C5)加入锥形瓶中，恒温振荡器上振荡2h，使样品中的菌体、芽孢或孢子能够均匀分散，从而制成了10^-2稀释度的样品稀释液。然后按10倍稀释法进行系列梯度稀释，分别得到10^-3，10^-4样品稀释液。吸取0.12mL 10^-3，10^-4样品稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨、PDA和MRS固体培养基平板上；接种后，将平板倒置于对应培养基温度的培养箱培养(30℃，10h)。待菌株长出后，挑取已长出的菌株单点置于1mL无菌水中稀释，在相应的培养基上划线培养，对菌种进行纯化。

待菌株生长完成，挑选菌株单点进行菌落PCR，细菌引物采用27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACCTTGTTACGACTT-3’)、真菌引物采用NL1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)和NL4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)，然后在上海生工进行测序，测序结果通过CBS-KNAW及EzBioCloud可培养数据库，确定微生物的种属。

实施例5：构建具有木质纤维素高效降解功能的合成微生物组

(1)制备玉米秸秆高效降解的合成微生物组

将悬钩子农杆菌OP503381(Agrobacterium rubi)、约氏不动杆菌OP503372(Acinetobacter johnsonii)、枯草芽孢杆菌OP503383(Bacillus subtilis)、干酪乳杆菌OP503382(Lactobacillus casei)的种子液(各20μL)分别接种于3mL牛肉膏蛋白胨液体培养基和3mL MRS液体培养基的混合培养基中，在37℃摇床培养8h，得到4类菌体悬液，将四类菌体悬液按照体积比1:1:1:1混合，得到4mL菌群A。

将绿色木霉OP564920(Trichoderma viride)、黑曲霉OP580494(Aspergillusniger)、芽枝状枝孢菌OP564919(Cladosporium cladosporioides)、紧密帚枝霉OP564921(Sarocladium strictum)的种子液(各20μL)分别接种于PDA液体培养基(3mL)中，在30℃摇床培养20h得到四类菌丝球悬液，将四类菌丝球悬液按照体积比1:1:1:1混合，得到4mL菌群B。

将菌群A和菌群B按体积比1:1进行复配，得到4mL合成微生物组。

(2)固态发酵实验

取20.00g秸秆粉，调整秸秆粉含水率为55％，121℃灭菌20min，冷却至50-60℃，拿出备用；将合成微生物组按照秸秆干重10％(w/w)添加到处理好的秸秆粉末中，混匀，30℃发酵23d；采用NREL(国家可再生能源实验室)法测定木质纤维素成分，测定发酵前和发酵后秸秆粉的纤维素、半纤维素和木质素含量。

纤维素降解率为42.06％、半纤维素的降解率为50.49％、木质素的降解率为25.67％。发酵前后木质纤维素含量如图4。

对比例1：堆呕玉米秸秆样本中筛选黑曲霉与实验室保存黑曲霉对比

首先对堆呕玉米秸秆样本中筛选黑曲霉OP580494与实验室中黑曲霉Aspergillusniger-SWJ进行活化培养，挑选两种黑曲霉单菌落接种于装有3mL羧甲基纤维素钠液体培养基的15mL的无菌管中，置入30℃、180r·min^-1条件下的振荡培养箱中培养2d。然后将活化后的黑曲霉充分振荡后用移液枪吸取菌液2μL，点接法接种于刚果红羧甲基纤维素钠琼脂培养基中。将平板放入30℃的恒温培养箱中培养，每12h观察一次，并记录菌落的直径(d)、透明圈的直径(D)，计算D/d值。

所述羧甲基纤维素钠液体培养基组成为KH₂PO₄ 0.5g、(NH₄)₂SO₄ 2.0g、羧甲基纤维素钠1.88g、MgSO₄·7H₂O 0.25g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

所述刚果红羧甲基纤维素钠琼脂培养基组成为KH₂PO₄ 0.5g、(NH₄)₂SO₄ 2.0g、羧甲基纤维素钠1.88g、MgSO₄·7H₂O 0.25g、刚果红0.2g、琼脂20g、蒸馏水水1000mL，121℃灭菌20min。

在第72h堆呕玉米秸秆样本中筛选黑曲霉透明圈直径、菌落直径、D/d分别为2.55cm、2.2cm和1.136，实验室黑曲霉透明圈直径、菌落直径、D/d分别为2.26cm、2.05cn和1.08；所以环境中筛选黑区对纤维素的利用程度远远大于实验室本土黑曲霉。

对比例2：堆呕玉米秸秆样本中筛选干酪乳杆菌与实验室本土干酪乳杆菌产酸性能对比

首先对堆呕玉米秸秆样本中筛选干酪乳杆菌OP503382与实验室本土干酪乳杆菌Lactobacillus casei-SWJ进行活化培养，挑选两种干酪乳杆菌单菌落接种于装有3mL MRS液体培养基的15mL的无菌管中，置入30℃、180r·min^-1条件下的振荡培养箱中培养12h。将已活化的2株干酪乳杆菌菌液将其OD值稀释至0.03左右，然后按照3％的接种量，往80mLMRS液体培养基中接入待测菌株，30℃震荡培养。每隔2h测定两种干酪乳杆菌菌液的pH值，三组平行。

所述MRS液体培养基的组成为10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、1000mL蒸馏水、115℃灭菌20min。

在培养48h后堆呕玉米秸秆样本中筛选干酪乳杆菌使MRS液体培养基pH从6.11降低为5.95，实验室干酪乳杆菌使MRS液体培养基pH从6.11降低为6.05，所以堆呕玉米秸秆样本中筛选干酪乳杆菌产酸性能大小与pH降低幅度远远大于实验室干酪乳杆菌。

对比例3

分别用对比例1和对比例2中实验室黑曲霉和实验室干酪乳杆菌替换实施例5中的黑曲霉和干酪乳杆菌，纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为31.25％、39.88％、18.76％。

以上分析结果表明，本发明所描述的方法对于解析玉米秸秆、玉米秸秆还田土壤以及农田土壤中微生物的种类和功能是可行的，此方法和思路也可应用于分析不同生态环境中微生物的种类和功能。因此，本发明为构建微生物组中物种的组成和种类提供了一种准确、快捷的方法，为探究微生物在秸秆还田系统中的生态功能提供了依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种基于宏基因组数据挖掘解析微生物群体功能并筛选促进木质纤维素降解菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以自然环境菌群为样本进行总基因组的提取；

(2)利用高通量测序技术解析步骤(1)所提取自然环境菌群中的全部物种组成，通过CBS-KNAW及EzBioCloud可培养数据库，确定细菌和真菌的种属；

(3)分别通过FAPROTAX数据库和FUNGuild数据库对步骤(2)所确定细菌和真菌进行功能预测，得到全部功能；

(4)在步骤(3)所确定的全部功能中，细菌和真菌菌群分别选择与木质纤维素降解相关的6种以上的功能和2种以上的功能，通过功能丰度大小确定具有促进木质纤维素降解功能的菌株。

2.权利要求1所述方法在筛选促进木质纤维素降解菌株中应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述促进木质纤维素降解菌株为真菌和/或细菌，或由所述真菌和/或细菌制备得到的微生物组。

4.一种微生物组在降解木质纤维素中的应用，其特征在于，所述微生物组由真菌和/或细菌制备得到。

5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述真菌为绿色木霉(Trichodermaviride)、黑曲霉(Aspergillus niger)、芽枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)和紧密帚枝霉(Sarocladium strictum)中的任意一种或几种组合；所述细菌为悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中的任意一种或几种组合。

6.根据权力要求5所述的应用，其特征在于，

所述绿色木霉(Trichoderma viride)的ITS在Genbank的登陆号为OP564920；

所述黑曲霉(Aspergillus niger)的ITS在Genbank的登陆号为OP580494；

7.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述微生物组的制备方法包括如下步骤：

S3：将第一菌群和第二菌群混合后，即得所述微生物组。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，步骤S1中，所述各菌丝球悬液按照0.1～1:0.1～1的体积比混合；步骤S2中，所述各菌体悬液按照0.1～1:0.1～1的体积比混合；步骤S3中，所述第一菌群和第二菌群按照1:0.1～1的体积比混合。

9.根据权利要求4所述应用，其特征在于，将所述微生物组按照1％～20％的质量比接种到木质纤维素底物中，发酵，即能降解木质纤维素。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述发酵的温度为20～40℃，所述发酵的时间为5～25天。