CN103114057A - 一株高效降解纤维素的门多萨假单孢菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高效降解纤维素的门多萨假单孢菌，是借助生物技术的手段，从东北地区的树林中杂草地土样以及腐殖的树叶、腐烂秸秆、放牛场中腐败的牛粪、天然堆沤肥料采集样品，经过菌种富集、分离纯化得到的；经鉴定为门多萨假单孢杆菌；将门多萨假单孢杆菌接入含有200mgCMC的培养基中，在120rpm、30℃的条件下摇床培养7d，酶活性达97IU；本发明门多萨假单孢杆菌产生的纤维素酶对纤维素具有很强的降解作用。与现有的纤维素降解菌株相比，门多萨假单孢杆菌是从东北地区的自然环境中筛选获得的，属于环境中的土著菌，对外界环境的耐受性更强，且不会污染环境。在农作物秸秆堆肥中具有较高的实用价值。

Description

一株高效降解纤维素的门多萨假单孢菌

技术领域

本发明属微生物技术领域, 涉及一株高效降解纤维素的门多萨假单孢菌。 

背景技术

农作物秸秆废弃物一直是我国长期存在的资源环境问题，东北地区的秸秆资源密度远远高于我国总秸秆资源密度值，传统农业中，东北地区的秸秆主要用于烧火做饭取暖、秸秆养畜积肥，但随着传统农业向现代化农业的转变、农村能源和饲料结构化的调整以及社会经济的突飞发展，农业废弃秸秆呈了污染空气、水源和土壤板结的污染源，各国的研究学者为秸秆的利用开辟了新途径和新方法，使传统秸秆的利用途径发生了历史性的变化。目前剩余秸秆的处理方法主要包括化学法、物理法和生物法，相比较而言，微生物处理法具有化学法和物理法不可取代的优势，其处理费用低、操作简单、环境污染小，更容易被广大农民接受。 

微生物能根据不同的底物污染物产生不同的酶，参与底物的降解反应，从而达到处理废弃污染物的目的。 

发明内容

本发明的目的是提供一株高效降解纤维素的门多萨假单孢菌(Pesudomonas mendocina)菌株。 

门多萨假单孢菌(Pesudomonas mendocina)菌株，保藏编号为CGMCC No.6711 

它的16SrDNA的基因序列，如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明的另一个目的是提供一种生产纤维素酶的方法，将上述的门多萨假单孢菌(Pesudomonas mendocina)菌株，在CMC+可溶性淀粉 0.3%、蛋白胨+酵母粉1%、NaCl 0.5%、pH 7.4～7.8的培养基中，温度30℃，培养，按常规方法提取纤维素酶。 

本发明借助生物技术的手段，从东北地区的树林中杂草地土样以及腐殖的树叶、腐烂秸秆、放牛场中腐败的牛粪、天然堆沤肥料采集样品，经过菌种富集、分离纯化得到了一株高效降解纤维素的细菌；经鉴定为门多萨假单孢菌；将门多萨假单孢菌接入含有200mgCMC的培养基中，在120rpm、30℃的条件下摇床培养7d，酶活性达97IU；本发明门多萨假单孢菌产生的纤维素酶对纤维素具有很强的降解作用。与现有的纤维素降解菌株相比，门多萨假单孢菌是从东北地区的自然环境中筛选获得的，属于环境中的土著菌，对外界环境的耐受性更强，且不会污染环境。在农作物秸秆堆肥中具有较高的实用价值。 

附图说明

图1为本发明门多萨假单孢菌的单菌落图片； 

图2为门多萨假单孢菌的革兰氏染色显微镜图片；

图3为通过门多萨假单孢菌和相近菌株16SrDNA的基因序列进行同源性Blast比对时构建的系统发育树图片。

具体实施方式

实施例1  纤维素降解菌株筛选 

(1) 从东北地区的树林中杂草地土样以及腐殖的树叶、腐烂秸秆、放牛场中腐败的牛粪、天然堆沤肥料采集样品；将新鲜样品用生理盐水富集；

(2) 将富集后的混合菌液静置0.5h，取上清作10^-1-10^-7的稀释度，每个梯度在选择性培养基(选择性培养基为：羧甲基纤维素( CMC)10g/ L, ( NH₄) ₂SO₄ 4g/ L, KH₂PO₄ 2g/ L, MgSO₄.7H₂O 0. 5 g/ L, 蛋白胨1 g/ L, 琼脂18 g/ L, pH 6.5~7.0中涂布，30℃下恒温培养72h，刚果红染色筛选出透明圈较大的单一菌落，编号，再多次划线培养，多次纯化以得到纯种菌株，将分离后的菌种接到斜面上，4℃保存进行后续实验。

获得了多株纤维素降解菌，其中在放牛场的腐败牛粪中采集的，编号为N”-1株，于2012年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.6711，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。对N”-1菌株进行革兰氏染色和显微镜观察。观察菌株的菌落形态，菌落呈白色，表面呈现半湿润状态，菌落大而扁平、呈花形形状、边缘呈锯齿状，生长迅速，革兰氏染色后用显微镜观察发现，菌株为杆菌，呈阴性，见图1、2。 

实施例2   N”-1菌株的生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌系统鉴定手册》对门多萨假单孢菌N”-1株进行生理生化鉴定，其鉴定结果见表1，菌株的接触酶、V-P、M.R、反硝化等反应呈阴性，能使淀粉水解、使明胶液化、精氨酸双水解，能利用丙二酸、柠檬酸，属于葡萄糖发酵型菌株、最高耐盐性为7%。

表1 N’’-1 的生理生化测定结果 

鉴定项目	鉴定结果	鉴定项目	鉴定结果
				G染色	-	葡萄糖发酵	+
细胞形状	杆状	最高耐盐性	7%
				接触酶	-	反硝化	-
淀粉水解	+	丙二酸利用	+
				V﹣P	-	明胶液化	+
M.R	-	精氨酸双水解	+
				厌氧生长	+	柠檬酸利用	+
氧化酶	+

实施例3  N”-1菌株分子鉴定

(1)对筛选得到的门多萨假单孢菌N”-1进行分子鉴定，按照以下步骤进行：挑取筛选菌株的单菌落接种于液体LB培养基中，30℃、120r/min摇床振荡培养，在第7d取出培养液，5000r/min离心10min取菌体，采用CTAB法提取菌株基因组DNA。通用引物Primer1和Primer1对提取的细菌DNA进行PCR扩增。Primer1序列为：5’-GCCTAACACATGCAAGTCGA-3’；Primer1序列为：5’-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3’引物由北京华大生物工程技术有限公司合成；将PCR产物送至北京华大生物工程有限公司进行序列测序，测序结果在NCBI数据库中BLAST进行序列分析，并进行同源性比较。

(2) 门多萨假单孢菌株N”-1的16SrDNA基因序列长度为925bp，将基因序列提交到Genbank上，获得登陆号为Id154227，进行同源性比较，然后采用MEGA软件绘制系统发育树，见图3，从而确定菌株的种属。结果表明该序列与假单孢菌属的16SrDNA基因序列相似度高达98%，通过菌落的形态特征、生理生化特征确定门多萨假单孢菌属于假单孢杆菌，为门多萨假单孢菌(Pesudomonas mendocina)菌株。 

实施例3   门多萨假单孢菌株N”-1的发酵

将N”-1接种到牛肉膏蛋白胨培养基，测定其生长曲线，从测定结果可以看出，0_~9h为延迟期、9_~14h为对数生长期、14_~24h为稳定期、>24h为衰亡期。对数期的菌株的生长迅速、活力强，因此选用12小时的发酵液为种子液。

利用不同的碳源，CMC、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、可溶性淀粉、可溶性淀粉+CMC 7种对N”-1菌株的发酵条件进行优化时，结果发现可溶性淀粉和CMC混合使用时的生物量最高；确定了最佳碳源以后，在最佳碳源的基础上利用不同氮源，硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、蛋白胨、酵母粉、尿素和蛋白胨+酵母粉 7种进行优化，测定结果为蛋白胨+酵母粉的生物量最高；在确定最佳的氮源和碳源之后，分别调不同的pH值，6、6.2、6.6、7、7.4、7.8对菌株进行发酵培养，当在初始pH值为7.4～7.8时，菌株的生长状况最适宜，更进一步表明了该菌株在一定的pH值范围内具有调节自身生长代谢的能力；温度是产酶量的一个重要的指标，设置20℃、24℃、28℃、30℃、32℃、35℃、40℃，7个温度进行酶活测定，结果表明菌株的最适生长温度为30℃，最终将N”-1的发酵条件确定为碳源为CMC+可溶性淀粉，氮源为蛋白胨+酵母粉，最适发酵温度为30℃，最适产酶pH值为7.4～7.8。对接种量1%、2%、3%，碳源0.3%、0.6%、0.9%，氮源0.5%、1%、1.5%，NaCl 0.3%、0.5%、0.7%进行正交实验，结果表明接种量为3%、CMC+可溶性淀粉 0.3%、蛋白胨+酵母粉1%、NaCl 0.5%、pH 7.4～7.8、温度30℃。 

实施例4   门多萨假单孢菌株N”-1纤维素的测定 

将N”-1菌接入含有发酵培养基(CMC+可溶性淀粉 0.3%、蛋白胨+酵母粉1%、NaCl 0.5%、pH 7.4～7.8)中培养，将培养物4000r/min离心10min，取上清即为粗酶液，分别测定CMC酶活和滤纸酶活。

CMC酶活测定：取25mL 的刻度试管，加入经适当稀释的酶液0. 5mL 和1mL质量分数为1% 的CMC-Na 缓冲溶液，50 ℃保温30 m in。 

滤纸酶活（简称FPA）：取25 mL 的刻度试管，加入经稀释的0. 5 mL 酶液和1 mL柠檬酸缓冲溶液(pH 5.4)，并加入一条1 cm ×6 cm 的滤纸，50 ℃保温1 h。 

用DNS法来测定所形成的还原糖量，以葡萄糖为标准来表示，并扣去空白. 其酶活力用每min产生1μmo l还原糖的量来计算，单位用国际单位IU来表示。 

测定结果为，N”-1的纤维素酶活性为92IU，滤纸酶活性为97IU。 

<110> 吉林农业大学

 

<120>一株高效降解纤维素的门多萨假单孢杆菌

 

<160>  1   

 

<210>  1

<211>  925

<212>  dna

<213>  pesudomonas mendocina  n”-1

<400>  1

 

aaaactgctc ttgatgatcg ccggacgggt gagtaatgcc tatgaatctg ccgggtgttg   60

ggggataacg tccggaaacg ggcgctaata ccgcatacgt cctacgggaa acagcagggg  120

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atgtgttagg cacatgtgtt aggca                                        925

Claims (3)

1.一株高效降解纤维素的门多萨假单孢菌菌株，它的保藏编号为CGMCC No.6711。

2.权利要求1所述的一株高效降解纤维素的门多萨假单孢菌菌株，它的16SrDNA的基因序列，如序列表SEQ ID No.1所示。

3.一种生产纤维素酶的方法，它包括：将权利要求1所述的一株高效降解纤维素的门多萨假单孢菌菌株，在CMC+可溶性淀粉 0.3%、蛋白胨+酵母粉1%、NaCl 0.5%、pH 7.4～7.8的培养基中，温度30℃，培养，按常规方法提取纤维素酶。

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