CN102168052A - 一株高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株 - Google Patents

一株高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株 Download PDF

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一株高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株，它涉及一株门多萨假单胞菌菌株。本发明提供了一株门多萨假单胞菌菌株，可高效降解氟磺胺草醚，为二苯醚类除草剂的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基础。本发明高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株为门多萨假单胞菌FB8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为CGMCC No.4409。本发明门多萨假单胞菌FB8能够高效降解氟磺胺草醚，对含有氟磺胺草醚残留的土壤具有修复作用。

Description

一株高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株
技术领域
本发明涉及一株门多萨假单胞菌菌株。
背景技术
氟磺胺草醚(通用名称：fomesafen，商品名称：虎威)，是由英国捷利康公司开发的二苯醚类触杀除草剂，用于大豆、果树、橡胶园等作物地阔叶杂草的防除，由于其良好的除草效果而得到广泛应用。氟磺胺草醚在全国使用量及使用面积较大，其在大豆苗前、苗后使用可很快使杂草被叶部吸收，破坏其的光合作用，致杂草迅速枯萎而死。但这种除草剂在土壤中会持续作用很长一段时间，残存于土壤中的药物因其较大的植物毒性会对轮作产生破坏作用。
微生物降解方法是土壤中二苯醚类除草剂的主要分解方式。目前氟磺胺草醚的降解也有所研究，GST(谷胱甘肽转移酶)介导的巯基共轭对氟磺胺草醚的去毒作用在黄豆的应用中已非常成熟。但是，有关氟磺胺草醚的微生物降解，目前很少有资料报道。
发明内容
本发明提供了一株门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)菌株，可高效降解氟磺胺草醚，为二苯醚类除草剂的环境修复和降解机制研究提供理论和微生物资源基础。
本发明高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株为门多萨假单胞菌FB8(Pseudomonas mendocina FB8)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为CGMCC No.4409；本发明门多萨假单胞菌FB8为革兰氏阴性菌，短杆状，细胞大小为(0.59μm～0.62μm)×(1.15μm～1.66μm)，无芽孢、有鞭毛(如图1和图2所示)，有菌膜；在LB固体培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为乳白色。
本发明的门多萨假单胞菌FB8伏普试验呈阳性，淀粉水解试验呈阴性，明胶液化试验呈阴性，七叶灵水解试验呈阴性，硫化氢产生试验呈阴性，脲酶试验呈阴性，氧化酶试验呈阳性，甲基红试验呈阴性。
本发明的门多萨假单胞菌FB8能够利用乳糖为碳源，不能利用水杨苷、山梨醇和蔗糖为碳源；在含有氨苄霉素、阿莫斯林、链霉素和头孢哌酮钠的环境下可以生长，在含有四环素、卡那霉素、状观霉素、氯霉素、头孢曲松钠和头孢噻肟钠的环境下不能生长。
本发明的门多萨假单胞菌FB8(Pseudomonas mendocina FB8)通过16S rDNA基因 序列比对分析，与假单胞菌属(Pseudomonas)的16S rDNA序列的亲缘关系最为接近，保守区相似性为100％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定门多萨假单胞菌FB8属于假单胞菌属(Pseudomonas)，为门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)菌株。
本发明的门多萨假单胞菌FB8可在添加了氟磺胺草醚的LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和无机盐基础培养基上生长，其中最适培养基为添加了氟磺胺草醚的LB培养基，培养基中氟磺胺草醚的最佳终浓度为500mg/L。门多萨假单胞菌FB8的最适生长温度为37℃，最适合生长环境的pH为6～8。
本发明门多萨假单胞菌FB8能够高效降解氟磺胺草醚，门多萨假单胞菌FB8在含500mg/L的氟磺胺草醚液体无机盐培养基中，反应96h，对氟磺胺草醚的降解率达到86.75％；本发明门多萨假单胞菌FB8对含有氟磺胺草醚残留的土壤具有修复作用。
本发明的门多萨假单胞菌FB8(Pseudomonas mendocina FB8)属于假单胞菌属(Pseudomonas)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为CGMCC No.4409。
附图说明
图1为本发明门多萨假单胞菌FB8的扫描电镜照片；图2为门多萨假单胞菌FB8的透射电镜照片；图3为通过门多萨假单胞菌FB8和相近菌株的16S rDNA基因序列进行同源性比对构建的系统发育树图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株为门多萨假单胞菌FB8(Pseudomonas mendocina FB8)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为CGMCC No.4409。
本实施方式门多萨假单胞菌FB8(Pseudomonas mendocina FB8)为革兰氏阴性菌，短杆状，细胞大小为(0.59μm～0.62μm)×(1.15μm～1.66μm)，无芽孢、有鞭毛，有菌膜；在LB培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为乳白色。
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对门多萨假单胞菌 FB8(Pseudomonas mendocina FB8)进行生理生化鉴定：门多萨假单胞菌FB8伏普试验呈阳性，淀粉水解试验呈阴性，明胶液化试验呈阴性，七叶灵水解试验呈阴性，硫化氢产生试验呈阴性，脲酶试验呈阴性，氧化酶试验呈阳性，甲基红试验呈阴性。
本实施方式门多萨假单胞菌FB8可在添加了氟磺胺草醚的LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和无机盐基础培养基上生长，其中最适培养基为添加了氟磺胺草醚的LB培养基，培养基中氟磺胺草醚的最佳终浓度为500mg/L。其中无机盐基础培养基(1000mL)由1.0g的NaCl、1.0g的NH4NO3、1.5g的K2HPO4、0.5g的KH2PO4和0.1g、MgSO4·7H2O和余量的蒸馏水组成。无机盐基础培养基加热充分溶解后与121℃高压灭菌15min，冷却至50～60℃后向其中加入氟磺胺草醚至终浓度为500mg/L。
本实施方式门多萨假单胞菌FB8的最适生长温度为37℃，最适合生长环境的pH为6～8。
具体实施方式二：本实施方式门多萨假单胞菌FB8(Pseudomonas mendocina FB8)由中国黑龙江省讷河市受除草剂污染的土壤中筛选得到。筛选按以下步骤进行：取5g黑龙江省讷河市受除草剂污染的土壤于三角瓶中，加入50mL生理盐水，振荡30s，用8层纱布过滤，取过1mL滤液加入到含100mg/L氟磺胺草醚的无机盐基础培养基中，于30℃、180r/min下培养，每隔7天提高氟磺胺草醚浓度100mg/L，直至氟磺胺草醚的浓度为500mg/L，得富集培养液；取富集培养液100μL均匀涂布于氟磺胺草醚浓度为500mg/L的固体无机盐培养基上培养，30℃培养24h后挑取生长较好的菌落进行纯化，即可得到门多萨假单胞菌FB8。
对筛选得到的门多萨假单胞菌FB8进行分子鉴定，按以下步骤进行：用热破壁法提取菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒(购自于大连宝生物工程有限公司)回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托上海生工生物技术有限公司测序。
门多萨假单胞菌FB8的16SrDNA序列长度为1511bp，其序列提交至GenBank获得的登录号为HQ701687，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件DNAMAN的Observed Divergency构建系统发育树(如图3所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与假单胞菌属(Pseudomonas)的16S rDNA序列的亲缘关系最为接近，保守区相似性为100％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定门多萨假单胞菌FB8属于假单胞菌属(Pseudomonas)，为门多萨假 单胞菌(Pseudomonas mendocina)。
PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。
对本实施方式门多萨假单胞菌FB8降解氟磺胺草醚的降解率进行测定，具体方法如下：
将门多萨假单胞菌FB8接入含有500mg/L氟磺胺草醚的无机盐培养基中，于30℃，200r/min条件下培养，设置不接菌的无机盐培养基为对照，做三个重复，培养96h后取样，按甲醇∶水∶无水乙酸＝60∶40∶0.5的体积比，直接向培养液(视为水)中加甲醇和无水乙酸，充分混匀，用注射器吸取一定量过0.45μm滤膜，用高效液相色谱检测其残留。色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-3C18(4.6×250mm，5μm)；柱温：室温；流动相：甲醇∶水∶无水乙酸＝60∶40∶0.5；检测波长：220nm；流速：0.8mL/min；进样量：10μL。根据标准曲线计算出样品中氟磺胺草醚的残留量，根据以下公式求出其降解率：氟磺胺草醚降解率(％)＝[1-(处理实测残留量/对照实测残留量)]×100％。
本实施方式门多萨假单胞菌FB8在含500mg/L的氟磺胺草醚液体无机盐培养基中，反应96h，降解率达到86.75％，说明门多萨假单胞菌FB8为高效降解氟磺胺草醚的菌株。
检测本实施方式门多萨假单胞菌FB8对含有氟磺胺草醚残留的土壤的修复作用，具体方法如下：
以氟磺胺草醚的后茬敏感作物玉米、高粱以及靶标杂草苘麻、稗草作为指示植物，采用盆栽方式，挑选饱满的作物及杂草种子，在恒温培养箱中浸种催根24h，设置不加氟磺胺草醚且不接门多萨假单胞菌FB8的为空白组，设置不加氟磺胺草醚只接门多萨假单胞菌FB8的为对照组CK1，设置加氟磺胺草醚且不接门多萨假单胞菌FB8的为对照组CK2，设置加氟磺胺草醚且接门多萨假单胞菌FB8的为处理组，每个处理设置3个重复，待门多萨假单胞菌FB8分别处理5d、10d、15d、20d、25d和30d后同时播种，对照组和处理组所施用的氟磺胺草醚的浓度为5mg/kg，门多萨假单胞菌FB8的接种量为109cfu/kg，置于光照温室(27～30℃)培养5d左右观察，观察作物及靶标杂草的出苗和生长发育情况，记录湿重、干重、株高及根长等生物量，使用Excel，SPSS统计学软件对所得数据进行分析。
本实施方式门多萨假单胞菌FB8的修复作用对后茬敏感作物玉米和高梁生长指标的影响分别见表1和表2。
表1Duncan法分析门多萨假单胞菌FB8施用后对玉米生长指标的影响
  No.   湿重(g)   干重(g)   株高(mm)   根长(mm)
  空白组   1.87±0.13aA   0.36±0.029aA   148.99±9.76aA   173.67±17.19aA
  CK1   1.83±0.13aA   0.38±0.039aA   144.12±8.17aA   167.87±11.22aA
  CK2   1.46±0.17bB   0.25±0.044bAB   103.61±8.53cdCD   119.85±18.32dD
  处理5d   1.29±0.095bB   0.220±0.012bB   97.16±7.28dD   125.65±10.68dCD
  处理10d   1.45±0.16bB   0.23±0.0091bB   109.37±10.43cBC   137.65±10.86cC
  处理15d   1.48±0.12bB   0.22±0.017bB   101.47±17.25dCD   138.36±16.96cC
  处理20d   1.38±0.042bB   0.26±0.022bAB   110.59±7.83bcBC   154.97±29.47bB
  处理25d   1.40±0.31bB   0.30±0.036abAB   117.18±8.52bB   154.69±28.67bB
  处理30d   2.04±0.054aA   0.34±0.098aA   152.60±28.54aA   181.22±29.43aA
数据结果表明：对照组CK2的湿重、干重、株高和根长均显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理30d后玉米的各项指标均显著高于对照组CK2，且均已恢复至空白组水平。
表2 Duncan法分析门多萨假单胞菌FB8施用后对高粱生长指标的影响
  No.   湿重(g)   干重(g)   株高(mm)   根长(mm)
  空白组   2.28±0.33aA   0.42±0.060aA   89.19±5.88aA   108.38±9.44aA
  CK1   2.38±0.31aA   0.38±0.062aA   86.86±6.69aA   105.25±8.14aA
  CK2   1.37±0.14cdD   0.27±0.010bB   39.95±3.36eE   59.08±6.83eD
  处理5d   1.51±0.010bcCD   0.19±0.0058dCD   46.83±3.06dD   62.75±5.58eD
  处理10d   1.53±0.062bcCD   0.19±0.011dD   48.38±6.30dCD   99.07±22.85cdC
  处理15d   1.47±0.044cCD   0.21±0.012cdCD   47.09±5.93dD   97.37±8.98dC
  处理20d   1.15±0.031dD   0.21±0.013cdCD   54.68±10.51bB   104.66±4.70acAC
  处理25d   1.76±0.035bBC   0.24±0.011bcBC   51.64±1.74cBC   104.04±3.76acAC
  处理30d   2.04±0.20aAB   0.41±0.0058aA   52.86±2.26bcB   118.74±11.48bB
数据结果表明：对照组CK2的湿重和干重均显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理30d后，湿重和干重均显著增加，且达到空白组水平；对照组CK2的株高和根长均显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理5、10、15、20、25和30d后株高虽均未达到空白组水平，但均有显著性增加，门多萨假单胞菌FB8处理20、25和30d后根长显著增加，且均达到空白组水平。
本实施方式门多萨假单胞菌FB8的修复作用对靶标杂草苘麻和稗草生长量的影响分 别见表3和表4。
表3 Duncan法分析门多萨假单胞菌FB8施用后对苘麻生长指标的影响
  No.   湿重(g)   干重(g)   株高(mm)   根长(mm)
  空白组   0.91±0.062aA   0.14±0.032aA   75.67±7.67aA   61.79±5.03aA
  CK1   0.89±0.048aA   0.16±0.049aA   77.89±8.51aA   63.61±5.53aA
  CK2   0.66±0.051bcB   0.087±0.023cC   44.03±3.57dC   44.69±8.34eE
  处理5d   0.65±0.052cB   0.087±0.0058cC   43.92±4.97dC   51.27±7.64dD
  处理10d   0.71±0.011bcB   0.09±0.011bcC   46.69±3.34dC   52.58±7.07dCD
  处理15d   0.72±0.012bB   0.093±0.012bcBC   47.11±7.25dC   56.05±4.69cC
  处理20d   0.73±0.031bB   0.12±0.011abABC   63.10±6.92bcB   56.79±5.22cC
  处理25d   0.71±0.011bcB   0.11±0.012abcABC   61.43±8.78cB   65.77±5.56bAB
  处理30d   0.87±0.012aA   0.13±0.012aAB   64.91±6.57bB   66.94±5.52bB
数据结果表明：对照组CK2的湿重显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理30d湿重显著增加，且达到空白组水平；对照组CK2的干重显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理20、25和30d干重均显著增加，且达到空白组水平；对照组CK2的株高显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理20、25和30d株高虽未达到空白组水平，但均有显著性增加；对照组CK2的根长显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理25和30d根长均显著增加，并高于空白组水平。
表4 Duncan法分析门多萨假单胞菌FB8施用后对稗草生长指标的影响
  No.   湿重(g)   干重(g)   株高(mm)   根长(mm)
  Blank   0.66±0.015aA   0.091±0.0035aA   63.15±6.14aA   60.21±5.83aA
  CK1   0.65±0.013aA   0.092±0.0036aA   62.61±6.54aA   61.38±6.04aA
  CK2   0.51±0.017dC   0.063±0.0020cC   49.72±3.31cC   44.43±8.53fE
  处理5d   0.51±0.012dC   0.076±0.0046acAC   46.55±3.35dCD   49.79±6.08eD
  处理10d   0.51±0.012dC   0.083±0.0058aAC   43.73±5.07eD   51.90±6.82deCD
  处理15d   0.53±0.020cdC   0.080±0.0045aAC   46.89±7.54dCD   53.46±3.93cdBCD
  处理20d   0.53±0.030cdC   0.087±0.0064aA   55.29±4.05bB   56.56±4.92bcAB
  处理25d   0.58±0.076cC   0.087±0.0058aA   53.65±5.52bB   55.44±5.25bcBC
  处理30d   0.85±0.031bB   0.11±0.021bB   55.61±3.16bB   57.57±5.67abAB
数据结果表明：对照组CK2的湿重和根长均显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8 处理30d后湿重和根长有显著性增加且已达到空白组水平；对照组CK2的干重显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理20、25和30d干重均有显著性增加，且已达到空白组水平；对照组CK2的株高显著低于空白组，门多萨假单胞菌FB8处理20、25和30d株高虽均未达到空白组水平，但均有显著性增加。
通过对后茬敏感作物和靶标杂草的各项生长指标的测定，表明本实施方式门多萨假单胞菌FB8对含有氟磺胺草醚残留的土壤具有修复作用，有很好的修复效果，且未表现出对后茬作物的病害作用。

Claims (1)

1.一株高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株，其特征在于高效降解氟磺胺草醚的门多萨假单胞菌菌株为门多萨假单胞菌FB8(Pseudomonas mendocina FB8)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月06日，保藏号为CGMCC No.4409。 
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