CN113773970A - 一株具备植物促生作用的黑曲霉bzzj-17 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株具有高效固氮、溶磷及解钾能力、具备植物促生作用的黑曲霉。该菌的分类名称为黑曲霉(Aspergillus niger)，于2021年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC N0.22469。该菌具有高效固氮、溶磷及解钾能力，还具备植物促生的作用，可实际应用于促进植物生长、制备生物肥料上。

Description

一株具备植物促生作用的黑曲霉BZZJ-17

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株具有高效固氮、溶磷及解钾能力、具备植物促生作用的黑曲霉BZZJ-17。

背景技术

无论什么作物，氮磷钾三元素的需求是最多的，氮磷钾对植物有一定的促生作用。氮是植物生长的必需养分，是每个活细胞的主要组成部分，氮素是植物体内蛋白质、核酸和叶绿素的组成成分，叶绿素a和叶绿素b都是含氮化合物。氮也是植物体内维生素和能量系统的组成部分。磷是植物主要组成元素之一，植物体内的核蛋白、核酸、磷酯、磷酸腺苷等都含有磷；核蛋白是细胞核的主要成分，磷酯是原生质的主要成分。钾是植物体内许多化学反应所必需的元素，它帮助植物吸收和平衡其它元素，调节水和空气的流通。钾还能帮助植物制造和储藏淀粉、糖、油脂和蛋白质，增强植物的抗旱、抗寒和抗病能力。

20世纪60年代以来，人们长期使用含氮磷钾的化肥促进农植物生长发育，随着大量化学化肥的使用，虽然农植物的产量短期内有所提升，但是化肥的使用会造成土壤团粒结构破坏、土壤板结，土壤中有益菌、生物死亡，最终使作物产量下降，不利于可持续发展。因此，改良土壤、提升地力、改善土壤生态环境、提高农作物产量和品质已成为当前农业工作的重点。目前并无针对白芷的专用微生物菌肥。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一株具有高效固氮、溶磷及解钾能力、具备植物促生作用的黑曲霉。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的黑曲霉，该菌具有高效固氮、溶磷及解钾能力，还具备植物促生的作用。

附图说明

图1为黑曲霉BZZJ-17的显微结构示意图；

图2为黑曲霉BZZJ-17的初始菌落形态示意图；

图3为黑曲霉BZZJ-17培养48h后的菌落形态示意图；

图4为黑曲霉BZZJ-17溶解无机磷效果展示图；

图5为黑曲霉BZZJ-17溶解有机磷效果展示图；

图6为黑曲霉BZZJ-17溶解难溶性钾效果展示图；

图7为崇州土壤条件下，黑曲霉BZZJ-17促进白芷BZA001生长效果对比图；

图8为崇州土壤条件下，黑曲霉BZZJ-17促进白芷BZB003生长效果对比图；

图9为遂宁土壤条件下，黑曲霉BZZJ-17促进白芷BZA001生长效果对比图；

图10为遂宁土壤条件下，黑曲霉BZZJ-17促进白芷BZB003生长效果对比图；

图11为黑曲霉BZZJ-17固氮效果展示图。

具体实施方式

下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

本发明涉及的培养基和试剂如下：

1、马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)：土豆200g，氯化钠20g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，自然pH。

2、固氮培养基：甘露醇10.0g，葡萄糖10g，氯化钠0.2g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸钙0.1g，硫酸镁0.2g，碳酸钙2g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，自然pH。

3、无机磷固体平板培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸镁0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，一水硫酸锰0.03g，磷酸钙0.7g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。

4、有机磷固体平板培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸镁0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，一水硫酸锰0.03g，碳酸钙5g，卵磷脂2g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。

5、解钾培养基：蔗糖5g，七水硫酸镁0.5g，碳酸钙0.1g，磷酸氢二钠2g，氯化铁0.005g，硫酸铵1g，钾长石1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5。

6、马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基(PDB)：土豆200g，氯化钠20g，加蒸馏水定容至1000mL，自然pH。

实施例一：菌株的筛选与鉴定

1、菌株分离：将从四川省崇州市隆兴镇(四川农业大学现代农业研发基地)采集的川白芷【其原植物为伞形科植物杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss)Shan et Yuan】的根际进行处理：小心抖落根系表面土壤，将根系表面紧紧附着的土壤用灭过菌的软毛刷轻轻刷入无菌水中，得到根际土壤原液。使用灭菌注射器吸取1mL所述根际土壤原液进行取样，血球计数板进行计数，分别稀释到10³、10⁴、10⁵和10⁶稀释度，再将各个稀释度分别涂布到PDA培养基上。将各培养基30℃恒温培养1-5天，挑取不同类型的典型单菌落，经平板纯化后，4℃斜面保藏。

经过菌株初步分离，发明人发现其中一株菌具有良好的固氮、溶磷及解钾能力，命名为BZZJ-17。

2、菌株菌落形态及生理生化特征鉴定

(1)如图1所示，通过观测发现，形态特征为：菌丝有隔，分生孢子梗长短不一，不分枝，透明无色，顶囊头状，近球形，表面呈辐射状长满单列小瓶梗；瓶梗着生分生孢子；分生孢子串生，头球状，褐黑色。如图2和图3所示，其菌落特征为：在PDA培养基上蔓延迅速，初为白色绒毛，后变成黑色厚绒状,背面初为白色，后略带黄色。

(2)生理生化特征为：生长pH范围为3-7，生长温度范围为28-37摄氏度。

3、分子鉴定

测定菌株的16SrDNA序列：

采用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，其序列为：

ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；

ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

以分离菌株的总DNA为模板进行PCR扩增，然后测序分析，测序结果如SEQ ID NO.1所示。所测序列通过BLAST比对，在GenBank中找到相似性最高的菌株为Aspergillus niger(登陆号：MT123512.1)同源性达到100％。

生理生化特征及分子鉴定，证明菌株BZZJ-17为黑曲霉(Aspergillus niger)，该菌已于2021年7月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.22469，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

实施例二：菌株BZZJ-17固氮、溶磷和溶钾性能展示

1、固氮性能：

将菌株活化后划线接种在固氮培养基上，28℃恒温培养，连续转接3次，仍能生长，其在固氮培养基上以产孢为主，少产菌丝(如图11所示)。

2、溶磷性能：

菌株活化后打取6mm菌饼分别接于无机磷、有机磷固体平板培养基上，28℃恒温培养24h，出现透明圈，表示菌株BZZJ-17有溶磷活性，以透明圈直径与菌落直径比值表示其溶磷能力大小，BZZJ-17溶解无机磷能力D/d＝2.60±0.13(如图4所示)，溶解有机磷能力D/d＝1.82±0.13(如图5所示)。

3、溶钾性能：

活化后将6mm菌饼接种于解钾培养基上，28℃培养箱恒温培养24h，观察菌落周围出现透明圈，表示菌株BZZJ-17有溶钾活性，以透明圈直径与菌落直径比值表示其溶磷能力大小，BZZJ-17溶解难溶性钾能力D/d＝2.82±0.06(如图6所示)。

实施例三、菌株BZZJ-17促生效果展示

将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基中，置于28℃恒温震荡培养箱中120r/min培养10d后，抽滤，收集菌丝体，用无菌滤纸吸干表面水分，置于研钵中研磨成匀浆，称取2.0g匀浆于试管中加入20.0mL蒸馏水，按此比例于涡旋仪上混匀备用。

以白芷品种BZA001、品系BZB003为试验材料，均为多年来选育的遗传稳定的川白芷品种(系)，其中，BZA001为“川芷2号”白芷品种，BZB003为川白芷重要品系材料。分别种植在来自四川省崇州市(四川农业大学现代研发基地)及四川省遂宁市船山区余建村的土壤中。盆栽试验所用川白芷均于2020年10月播种于四川农业大学成都校区青蒲园内。于第二年3月选择长势一致的川白芷植株，并通过适当修剪枯叶腐叶，使各基因型川白芷每株保持在相似重量下。流水冲洗川白芷幼苗根部至无褐色土壤痕迹。将川白芷根部浸泡于75％乙醇中5min，迅速用无菌水冲洗掉残余酒精，重复两次。菌液分别接种于各试验组中，每次接种时距川白芷根部3.0cm处浇灌菌液，每株100mL，对照浇等量无菌水，每月浇一次，共3次。连续培养至7月川白芷采收期。每个试验组30株，使用圆形花盆(d＝35cm)，每盆5株。

BZZJ-17对白芷苗的促进生长作用

试验结果如上表所示，菌株BZZJ-17对各处理组白芷生长均有明显的促进作用。在遂宁土壤中，接种菌株BZZJ-17的白芷BZA001的株高、根粗、地上鲜重和根鲜重均显著增长，增产率最高，达73.59％；接种后BZB003的株高、根长、地上鲜重和根鲜重均显著增长，增产率达46.07％。在崇州土壤中，白芷BZA001的根长和根鲜重表现出显著增加，增产率达30.64％，白芷BZB003的根长、地上鲜重和根鲜重显著增加，增产率达39.49％。如图，CA为崇州土壤中BZA001组，左为不施菌对照，右为施加BZZJ-17处理(图7)；CB为崇州土壤中BZB003组，左为不施菌对照，右为施加BZZJ-17处理(图8)；SA为遂宁土壤中BZA001组，左为不施菌对照，右为施加BZZJ-17处理(图9)；SB为崇州土壤中BZB003组，左为不施菌对照，右为施加BZZJ-17处理(图10)。

菌株BZZJ-17在其他常见植物生长过程中页展示出类似结果，这些结果说明该菌株确实有促进植物生长、增加产量的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一株具备植物促生作用的黑曲霉BZZJ-17

<141> 2021-10-12

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 586

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

tgcggaagga tcattaccga gtgcgggtcc tttgggccca acctcccatc cgtgtctatt 60

gtaccctgtt gcttcggcgg gcccgccgct tgtcggccgc cgggggggcg cctctgcccc 120

ccgggcccgt gcccgccgga gaccccaaca cgaacactgt ctgaaagcgt gcagtctgag 180

ttgattgaat gcaatcagtt aaaactttca acaatggatc tcttggttcc ggcatcgatg 240

aagaacgcag cgaaatgcga taactaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc 300

tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc 360

tgccctcaag cccggcttgt gtgttgggtc gccgtccccc tctccggggg gacgggcccg 420

aaaggcagcg gcggcaccgc gtccgatcct cgagcgtatg gggctttgtc acatgctctg 480

taggattggc cggcgcctgc cgacgttttc caaccattct ttccaggttg acctcggatc 540

aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataaggc ggagga 586

Claims (9)

1.一株黑曲霉BZZJ-17，其特征在于：该菌的分类名称为黑曲霉(Aspergillus niger)，于2021年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC N0.22469。

2.根据权利要求1所述的黑曲霉BZZJ-17，其特征在于：所述黑曲霉BZZJ-17是从伞形科植物的根际中筛选得到。

3.根据权利要求2所述的黑曲霉BZZJ-17，其特征在于：所述伞形科植物为川白芷。

4.根据权利要求1所述的黑曲霉BZZJ-17，其特征在于：所述菌株的形态特征为：菌丝有隔，分生孢子梗长短不一，不分枝，透明无色，顶囊头状，近球形，表面呈辐射状长满单列小瓶梗；瓶梗着生分生孢子；分生孢子串生，头球状，褐黑色。

5.根据权利要求1所述的黑曲霉BZZJ-17，其特征在于：所述菌株的菌落特征为：在PDA培养基上蔓延迅速，初为白色绒毛，后变成黑色厚绒状,背面初为白色，后略带黄色。

6.权利要求1所述的黑曲霉在促进植物生长中的应用。

7.根据权利要求6所述黑曲霉在促进植物生长中的应用，其特征在于：所述植物为伞形科植物川白芷。

8.根据权利要求7所述黑曲霉在促进植物生长中的应用，其特征在于：所述应用的温度为28-37℃，所述应用的pH为3-7。

9.权利要求1所述的黑曲霉在固氮和/或溶磷和/或解钾中的应用。

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