CN116240148B - 一种粪产碱杆菌sz-220101及其在防治植物病害中的应用 - Google Patents
一种粪产碱杆菌sz-220101及其在防治植物病害中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种粪产碱杆菌SZ‑220101及其在防治植物病害中的应用，属于植物病害防治技术领域，所述粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)SZ‑220101，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62996。所述粪产碱杆菌SZ‑220101经过实验验证能够显著的抑制植物病菌，尤其是香蕉枯萎病病菌，为香蕉枯萎病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。
Description
技术领域
本发明属于植物病害防治技术领域，尤其涉及一种粪产碱杆菌SZ-220101及其在防治植物病害中的应用。
背景技术
植物内生菌是一个多样性丰富的微生物类群，是植物微生态系统的重要组成部分，也是植物作用于土壤生态过程的重要载体之一。植物-内生菌共生体系是指那些在其生活史的某一阶段生活在健康植物的各种组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌或细菌，在长期的协同进化过程中，内生菌与植物形成了互利共生的关系。有研究表明，内生菌可促进植物生长及营养元素的吸收和利用，拮抗有害微生物，是开发和利用微生物肥料和菌剂的有效菌种资源，植物内生菌是人类开发自然的另一微生物资源宝库，对其进行深入研究对农业、环保、医药等领域的发展具有重要意义。
目前，绿色环保针对性强的生物防治技术研究已成为植物病害防治的热点，而内生菌作为一种绿色环保的生防菌，因而利用其拮抗病原微生物的性能进行病害防治有几个优点。首先，和抗病育种相比，拮抗性内生菌能够起到类似抗病基因的作用而不需要进行抗病基因的分离以及相关的转基因试验操作，节省时间和资金，也不需要考虑转基因食品的生物安全性问题。其次，内生菌防治病害药害相对较低，且原料的获取广泛易得，对环境友好安全、选择性强，利用它进行病害防治具有更稳定的防效效果。第三，内生菌可以在植物体内稳定存在，少量接种即可长期起到防病效果，且豆科植物内生固氮菌还具有固氮效果，可以为作物提供氮肥，一些内生菌还有解磷解钾的功能，所以，内生菌具有多功能的作用，优势明显。
植物内生细菌生防机制主要有产生抗生素、竞争生态位和营养、诱导宿主产生系统抗性、灭活病菌萌发因子、产生胞外酶溶解病原菌细胞壁和降解毒素等几种方式。
光叶苕子(ViciavillosaRothvar.)为豆科植物，其生长快，生物量大，粗蛋白含量高，是优良的饲料作物。同时其固氮能力强，也是一种优质的绿肥作物和农作物生产的重要物质基础，是绿色农业的有效技术支撑。目前，作为南方农田常用的一种冬季绿肥，不仅能充分利用农田冬闲时期的水、光、热和土地资源，翻压还田为农作物提供养分，起到化肥减施的效果，同时还能改善土壤理化性状，提高作物产量，改善生态环境。苕子根系发达，主根入土0.5～1.2m，主根明显，侧根多，而且在南方酸性土壤环境下根瘤多，具有较强的固氮能力。
现目前采用化学药剂防治存在成本高、污染环境等问题，而且药剂在杀死病原菌的同时也抑制有益菌的生长，破坏土壤的微生态，对农田环境造成很大的不利影响。应用内生菌防治植物病害已经有很多的报道，但有关运用光叶苕子内生菌防治植物病害在国内外还没有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供提供一种光叶苕子内生拮抗菌，粪产碱杆菌SZ-220101，及其在防治植物病害中的应用。
本发明提供了一种粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)SZ-220101，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62996。
本发明提供了所述的粪产碱杆菌SZ-220101在防治植物病害中的应用。
优选的，所述植物病害包括真菌性枯萎病。
优选的，所述真菌性枯萎病包括香蕉枯萎病。
本发明提供了所述的粪产碱杆菌SZ-220101在植物促生中的应用。
优选的，所述植物促生通过粪产碱杆菌SZ-220101的固氮、解磷和产铁载体能力实现。
本发明提供了一种防治植物病害的制剂，所述制剂包括所述的粪产碱杆菌SZ-220101。
优选的，所述制剂为液体制剂或固体制剂。
优选的，当所述制剂为液体制剂时，所述制剂中粪产碱杆菌SZ-220101的浓度为1×107～1×109CFU/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的粪产碱杆菌SZ-220101分离自健康的光叶苕子根内，是光叶苕子内生拮抗细菌，具有植物内生菌的优势；所述粪产碱杆菌SZ-220101经过实验验证能够显著的抑制植物病菌，尤其是香蕉枯萎病病菌，为香蕉枯萎病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。
进一步的，根据实施例的记载，只接病原菌的对照组病情指数为84.72，接种粪产碱杆菌SZ-220101作为拮抗菌的实验组病情指数为29.17，空白组病情指数为0，计算得其生防效果为65.57％，表明粪产碱杆菌SZ-220101具有较强的防治效果，能够有效地控制控香蕉枯萎病，减少损失，是一株在防治香蕉枯萎病上具有重大意义的生防菌株。
附图说明
图1为粪产碱杆菌SZ-220101的菌落形态；
图2为粪产碱杆菌SZ-220101的显微结构图；
图3为粪产碱杆菌SZ-220101的系统进化树分类；
图4A为粪产碱杆菌SZ-220101和香蕉枯萎病病菌对峙培养试验；
图4B为香蕉枯萎病病菌；
图5A为香蕉枯萎病培养基上的抑菌培养；
图5B为未接种粪产碱杆菌SZ-220101的香蕉枯萎病对照；
图5C为挑取香蕉枯萎病菌丝示意；
图6A为粪产碱杆菌SZ-220101+TR4的香蕉枯萎病真菌菌丝显微结构；
图6B为CK+TR4的香蕉枯萎病真菌菌丝显微结构；
图7A为粪产碱杆菌SZ-220101中的促生基因SrfAA和yndJ的检测结果；
图7B为粪产碱杆菌SZ-220101中的促生基因fenD和ituD的检测结果；
图7C为粪产碱杆菌SZ-220101中的促生基因yngG和bamD的检测结果；
图7D为粪产碱杆菌SZ-220101中的促生基因dhb和dfn的检测结果；
图7E为粪产碱杆菌SZ-220101中的促生基因mIn和bac的检测结果；
图7F为粪产碱杆菌SZ-220101中的促生基因SboA的检测结果；
图8A为粪产碱杆菌SZ-220101的固氮效果图；
图8B为粪产碱杆菌SZ-220101的解磷效果图；
图8C为粪产碱杆菌SZ-220101的产铁载体效果图；
图9为粪产碱杆菌SZ-220101处理香蕉幼苗盆栽的效果，其中处理1为在盆栽香蕉植株根部浇灌NA液体培养基，处理2和处理3在盆栽香蕉植株根部浇灌香蕉枯萎病菌发酵液；处理3在盆栽培养至第7天浇灌粪产碱杆菌SZ-220101的发酵液。
生物保藏说明
本发明提供的粪产碱杆菌Alcaligenesfaecalis SZ-220101，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62996，保藏时间为2022年11月28日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体实施方式
本发明提供了一种粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)SZ-220101，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62996。
在本发明中，所述粪产碱杆菌SZ-220101分离自健康的光叶苕子根内；在本发明中，采用尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种热带型(Foc TR4)作为病原菌，进行筛选获得的所述粪产碱杆菌SZ-220101。
本发明提供了所述的粪产碱杆菌SZ-220101在防治植物病害中的应用。
在本发明中，所述植物病害包括真菌性枯萎病，优选的香蕉枯萎病，更优选的为由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种热带型(Foc TR4)引起的香蕉枯萎病。
本发明提供了所述的粪产碱杆菌SZ-220101在植物促生中的应用。
在本发明中，所述植物促生优选的通过粪产碱杆菌SZ-220101的固氮、解磷和产铁载体实现。本发明提供的粪产碱杆菌SZ-220101具有很好的固氮、解磷和产铁载体能力。
本发明提供了一种防治植物病害的制剂，所述制剂包括所述的粪产碱杆菌SZ-220101。
在本发明中，所述制剂优选为液体制剂或固体制剂。在本发明中，当所述制剂为液体制剂时，所述制剂中粪产碱杆菌SZ-220101的浓度优选为1×107～1×109CFU/mL，进一步优选为5×107～5×108CFU/mL，更进一步优选为1×108CFU/mL。当所述制剂为固体制剂时，所述制剂还包括辅料，本发明对所述辅料的种类和用量没有特殊限定，采用本领域固体菌剂制备过程中常用的辅料和用量即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
光叶苕子内生拮抗细菌的筛选
光叶苕子于2021年11月取样，采用五点取样法在云南省昆明市嵩明县绿肥长期定位实验基地进行(102°41’E和25°28’N)。该地区的年平均气温和年平均降水量分别为11～22℃和899.8mm。试验区土壤为典型的云南省砂质红壤，是光叶苕子冬闲种植土的主要类型。土壤由28％的沙土、50％的淤泥和22％的粘土组成。光叶苕子样品连同根际土装入事先准备的干净保鲜袋中后，带回实验室4℃保存待测。
将采集的光叶苕子根系用灭菌水冲洗干净，室内晾干后，无菌条件下，称取l0 g洗净的植物根系，用75％的乙醇进行表面消毒，用无菌刀片切成2～3cm的小段，用75％的乙醇浸泡1min，后用无菌水冲洗2次。再用0.1％升汞浸泡30s，无菌水冲洗3次，放入装有9mL无菌水的灭菌研钵中，加入少许灭菌的石英砂研磨均匀，静置15min取1mL稀释至10-4、10-5、10-6浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1mL用无菌涂布棒涂于NA培养基(配方：蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，琼脂粉15g，葡萄糖10g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH至7.0，121℃灭菌20min)平板上于30℃倒置培养，以最后1次洗过样品的无菌水为对照。
连续观察1～2天，待固体培养基表面长出菌落时，分别挑取形态、大小各异的菌落接种到新的固体培养基上进行划线培养，分离出单一形态的菌种，待新的固体培养基上长出菌落时，再纯化2次，即分离到多个单菌株。
菌种临时保藏：纯化后的单菌株用接种针挑取菌落接种至NA固体斜面培养基上，4℃冰箱保存。菌种的冷藏需将纯化后的菌株置于无菌甘油中于-80℃保存。
本实施例中，采用PDA固体培养基进行病原菌培养。制备新的PDA培养基(配方：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去皮马铃薯取800mL蒸馏水煮沸30min后用双层纱布过滤，取滤液加入琼脂，蒸馏水定容至1000mL，121℃，灭菌20min)，待冷却至60℃左右(即不烫手同时琼脂未凝固时)，采用9cm的培养皿，按照20mL/皿的用量倒平板。将供试病原菌[本实施例中，采用尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种热带型(Foc TR4)作为病原菌，具体采用的菌株为Foc 15-1(获取方法详见文献[1]Lei,Z.,et al.,Identification andevaluation of resistance to Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4inMusa acuminata Pahang.Euphytica,2018.214(7):106.)]接种于PDA平板，在28℃培养7天后，用无菌打孔器打取直径5mm的菌饼备用。
活化已保藏的菌种，用接种工具挑取4℃冰箱中NA固体斜面培养基上的菌种划线接种至新的NA(配方:蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，琼脂粉15g，葡萄糖10g，用蒸馏水定容至1000mL，调整pH至7.0，121℃灭菌20min)培养基平板上，30℃下倒置培养24h后备用。
平板对峙法拮抗实验：用接种工具挑取香蕉枯萎病尖孢镰刀菌4号生理小种热带型病原菌菌饼(直径5mm)接种在新制备的PDA培养基中央(平板直径9cm)，并轻轻按压，防止掉落。用接种针挑取已活化的NA培养基平板上的光叶苕子内生菌株接种在距菌饼2cm处，用密封条封好，同时将不接种拮抗细菌的带菌平板在相同条件下培养作为对照，将此平板置于28℃培养24h～72h。在PDA平板培养基上尖孢镰刀菌生长受到抑制的即为尖孢镰刀菌的候选拮抗菌株。筛选抑菌作用最强(抑菌作用最大)的菌株，结果得到一株对香蕉真菌性枯萎病病菌具有较强拮抗作用的菌株，将该菌株命名为SZ-220101。
实施例2
SZ-220101菌株的形态特征及菌种鉴定
采用上述方法分离获得的菌株SZ-220101在NA固体培养基表面形成圆形不透明菌落，表面湿润黏稠，有隆起，中间凸起，边缘规则呈波浪状(图1中示出了菌株SZ-220101的菌落形态)。经检测，该菌呈革兰氏阴性染色，兼性厌氧，光学显微镜下观察该菌短杆状，近球形；图2中示出了菌株SZ-220101的显微结构图。最适生长pH为7，最适生长温度为37℃。
采用16S rDNA扩增及序列分析的方法对上述纯化后的菌株(菌SZ-220102)进行鉴定。具体方法为：采用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)对纯化后菌株进行基因组DNA提取，采用以下通用引物(委托北京擎科生物科技有限公司合成)对该菌株的16S rDNA进行扩增：27F(上游引物，序列为5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，SEQ ID No.1)和1492R(下游引物，序列5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ ID No.2)扩增体系和条件详见以下表1和表2。扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。
表1 16S rDNA扩增体系
| 组分 | 体积/μL |
| 1×TSE101金牌mix | 45 |
| 27F(10P) | 2 |
| 1492R(10P) | 2 |
| DNA模板 | 1 |
| 总体积 | 50 |
表2 16S rDNA扩增条件
通过上述方法扩增获得的PCR产物，将其测序结果在NCBI网站进行BLAST比对，并使用MEGA 11软件，采用邻接法构建系统进化树(详见图3)，确定所分离获得的内生拮抗细菌(SZ-220101)的分类地位。分类检索参照以下参考文献[2]和[3]。
[2]车秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:43-65.
[3]李阜棣，喻子牛，何绍江.农业微生物学实验技术[M].北京：中国农业出版社,1996.
结果表明，菌株SZ-220101与菌株Alcaligenes faecalis的序列相似性为100％。根据系统进化树(详见图3)的分类结果，该菌株与粪产碱杆菌亲缘关系最近，聚类为一支。
根据菌株SZ-220101的培养特征、形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析结果，确定该菌株为粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)。
实施例3
SZ-220101菌株对香蕉真菌性枯萎病病菌的拮抗活性遗传稳定性鉴定
将SZ-220101菌株接种在NA斜面培养基上，30℃培养24小时，4℃冰箱保存，15天后再接种至NA斜面培养基上，30℃培养24小时，4℃冰箱保存。按此方法连续转接培养20代后，活化第5、10、15和20代菌株，按照实施例1植物病原菌拮抗菌的筛选中所述的方法测定其抑菌活性，结果表明各世代所活化的菌体抑菌活性均与初始菌株一致，表明其拮抗活性是稳定遗传的。
实施例4
光叶苕子内生拮抗细菌抑菌谱测定
按照实施例1中的方法，将SZ-220101菌株与香蕉枯萎病尖孢镰刀菌4号生理小种热带型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)共同培养。该菌株对香蕉枯萎病病菌初次拮抗作用结果如图4所示，结果表明筛选得到的菌株对香蕉枯萎病病菌具有很强的拮抗作用。图4A为SZ-220101和香蕉枯萎病病菌对峙培养试验，图4B为对照香蕉枯萎病病菌生长情况。
用PDA培养基平板(配方：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL，121℃，灭菌20min)将供试病原菌将供试病原菌[香蕉枯萎病尖孢镰刀菌4号生理小种热带型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4,FocTR4)(云南省农业科学院农业环境资源研究所香蕉产业体系)]在28℃培养7天后，用无菌打孔器打取直径5mm的菌饼备用。用NB液体培养基(每1000mL含有蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，葡萄糖10g，pH 7.0)将SZ-220101菌株在28℃，摇床培养24h。在新制备的PDA培养基底部(平板直径8.4cm)用记号笔划十字线(十字定位法)，确保十字线交点位于平板中央(平板半径4.2cm)，将香蕉枯萎病病原菌菌饼接种在新制备的PDA培养基平板十字线中央，用接种环蘸取SZ-220102菌液，在TR4菌饼延十字刻度线上约2cm处进行接种(如图5所示)，以不接种SZ-220101菌液为对照，28℃下培养7天，3次重复。测量病原菌生长距离，计算平均抑菌效果。抑制率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-处理组病原菌生长直径)/(对照组病原菌生长直径-接种菌饼直径)]×100％。该菌株对香蕉枯萎病病菌抑菌率为51.36％。如图5所示，图5A为香蕉枯萎病培养基上的抑菌培养，图5B为未接种SZ-220102菌液的香蕉枯萎病对照。由图中可以看出，处理组中Foc 15-1的生长受到明显抑制，其菌落大小明显小于对照组，说明菌株SZ-220101具有较强的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种抑制效果。
实施例5
SZ-220101对Foc 15-1菌丝体的影响
选取实验菌株SZ-220101与Foc 15-1对峙培养7天的对峙平板(处理组)，用灭菌牙签挑取靠近生防菌(SZ-220101菌落)部分的Foc 15-1新生菌丝制作临时玻片(图5C)，体式显微镜40倍下(光学显微镜)观察菌株SZ-220101对Foc 15-1菌丝体生长的影响，以PDA正常培养7天(对照组)的菌落边缘新生菌丝为对照。
图6中示出了一组观察结果。图6A(SZ-220101+TR4)为处理组Foc 15-1的菌丝，从图中可以看出菌丝肿胀变形，端部膨大为圆形，隔膜之间菌丝节间缩短，内原生质浓缩聚集；图6B(CK+TR4)为对照组Foc 15-1的菌丝，从图中可以看出菌丝较为光滑，均匀，自然伸直，菌丝内无大量色素积累现象，原生质正常。该实验结果说明SZ-220101能够有效抑制尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种热带型菌株的生长。
实施例6
光叶苕子内生拮抗细菌生防/促生基因检测
对菌株SZ-220101进行生防/促生基因检测，通过PCR检测12个拮抗基因SrfAA、yndJ、fenD、ituD、yngG、bamD、dhb、dfn、bae、mIn、bac、SboA在菌株中是否存在，从而鉴别其生防和促生潜力。具体方法为：将SZ-220101进行活化：划线法采用NA固体培养基在37℃培养24h。用灭菌的牙签挑取活化后的单菌落于50μl的Lysis Buffer中混匀，然后置于80℃匀水浴裂解15min，8000rpm离心1min，取上清液作为DNA模板(即菌株SZ-220101的基因组DNA作为DNA模板)。具体基因对应的引物及引物的序列详见表3，扩增体系详见表4，扩增程序详见表5。
表3检测基因对应的物质种类及引物
其中，用于检测的基因及其引物参考以下参考文献[4]-[6]获得。
[4]Joshi,R.and M.S.Gardener,Identification and Characterization ofNovel Genetic Markers Associated with Biological Control Activities inBacillus subtilis.Phytopathology,2006.96(2):p.145.
[5]Mora I,Cabrefiga J,Montesinos E.Antimicrobial peptide genes inBacillus strains fromplant environments[J].International Microbiology,2011,14(4):213-223.
[6]Li,B.The Antagonistic Mechanism of Bacillus amyloliquefaciensSQR9against Soil-Borne Pathogens and In Situ Rhizosphere Antibiotic GeneExpression.Ph.D.Thesis,NanjingAgriculture University,Nanjing,China,2015.
表4生防/促生基因扩增体系
| 试剂 | 用量/μL |
| 模板DNA | 2 |
| 上游引物 | 0.5 |
| 下游引物 | 0.5 |
| 2xTaqPCRMasterMix | 12.5 |
| ddH2O | 9.5 |
试剂用量/μL：模板DNA2μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、2xTaq PCR MasterMix 12.5μL，补至总体积25μL。
表5生防/促生基因扩增程序
采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果如图7A、图7B、图7C、图7D、图7E和图7F所示。其中，M泳道为Marker，泳道1-2扩增产物，泳道3为阴性对照。从图中可以看出，11个拮抗基因SrfAA、yndJ、fenD、ituD、yngG、bamD、dhb、dfn、mIn、bac、SboA均可在SZ-220101基因组中扩增获得，说明SZ-220101菌株中含有上述基因，具有良好的生防潜力。
实施例7
光叶苕子内生拮抗细菌促生功能检测
配置Pikovskava((NH4)2SO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、FeSO4·7H2O 0.3g/L、MnSO4·7H2O 0.03g/L、Ca3(PO4)25g/L、葡萄糖10.0g/L、琼脂15.0-18.0g、体积1L；pH 7.0-7.5)无机解磷固体培养基，将促生菌接种在无机解磷固体培养基上，30℃培养箱培养7d。菌落周围有透明圈出现则为该菌株具有解无机磷的能力。
将分离到的内生菌接种于固体Ashby(甘露醇10.0g、KH2PO40.2 g、MgSO40.2g、NaCl0.2g、CaSO40.1 g、CaCO35 g、琼脂15.0-18.0g，用去离子水溶解定容至1L，pH 6.8-7.0；高压蒸汽灭菌121℃，20min。)无氮培养基上，30℃培养7d。菌落周围有透明圈出现则为该菌株具固氮的能力。
铁载体是指细菌在贫铁条件下向周围分泌的一种对Fe3+有极强特异性螯合作用的物质。CAS平板法利用的是铬天青S(CAS)、三价铁离子和十六烷基三甲基溴化铵(HTDMA)可以形成天蓝色的络合物，用CAS染液染色培养平板，当菌株向培养平板中释放三价铁离子时，三元络合物被破坏，变为黄色，即菌落周围出现黄色晕圈。
如图8A、图8B和图8C所示，SZ-220101菌株具有良好的固氮、解磷和产铁载体能力，能够具有较好的促生效果。
实施例8
光叶苕子内生拮抗细菌盆栽试验
本实施例用于说明本发明提供的粪产碱杆菌SZ-220101对于香蕉枯萎病盆栽植株的防治效果和促生作用。
取组培的巴西香蕉苗，洗净根部培养基后，移栽至育苗袋中，待香蕉苗长出3-4片叶后(约一个月)，将其移栽至装有灭菌基质的直径11cm、高12cm塑料盆中。移栽后经常淋水保湿，每周施肥一次。具体施肥方式为：按照每株香蕉苗2g/次的用量将复合肥溶于水中施用，该复合肥中，N的含量为15重量％，P2O5的含量为15重量％，K2O的含量为15重量％。待香蕉苗长出5-6片叶后作为香蕉盆栽苗进行香蕉枯萎病防治和促生实验。
粪产碱杆菌发酵液制备：将超低温(-80℃)甘油保存的粪产碱杆菌SZ-220101进行活化：划线法采用NA固体培养基在30℃培养24h。而后将单菌落用无菌接种环挑取后接种于NA液体培养基(200mL)中，37℃，220rpm震荡培养2天，获得菌株发酵液。采用无菌水将菌株发酵液配制成1×108CFU/mL的粪产碱杆菌发酵液备用。
采用香蕉枯萎病孢子液处理香蕉盆栽苗，模拟香蕉枯萎病发生。香蕉枯萎病孢子液制备方法为：将分离纯化后的香蕉枯萎病菌4号小种(Foc 15-1)菌饼接种到液体PDA培养基中，28℃、220rpm摇床振荡培养3天，用4层无菌纱布过滤培养液，得到病原菌孢子悬浮液。用无菌水配制为浓度1×106cfu/mL的香蕉枯萎病孢子液备用。
将香蕉盆栽苗分为三组：(1)单独浇灌NA液体培养基；(2)单独浇灌香蕉枯萎病孢子液；(3)浇灌粪产碱杆菌发酵液和香蕉枯萎病孢子液。其中，(1)组为对照组，(2)组和(3)组为实验组(处理组)。每组采用6株香蕉盆栽苗进行实验，共设置3组平行试验。具体浇灌方法为：试验期间浇灌1次，每次浇灌量为50mL，浇灌前进行伤根处理。其中(1)组在盆栽香蕉植株根部浇灌NA液体培养基，(2)组和第(3)组在盆栽香蕉植株根部浇灌香蕉枯萎病菌发酵液，盆栽培养至第7天在第(3)组浇灌粪产碱杆菌发酵液。而后置于相同条件下进行盆栽培养，45天后，再次进行测量。调查各处理组发病情况，统计各处理病情指数(根据表6中的病害分级标准按照公式计算获得)，并计算防治效果。
表6香蕉枯萎病病害分级标准
防效的计算采用下列两公式：
防治效果(％)＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100％
香蕉幼苗移栽入盆里面后第45天，三组处理效果如图9所示，统计病叶数，以及香蕉枯萎病的分级情况(表6和表7)。根据计算公式，只接病原菌的对照组病情指数为84.72，接种粪产碱杆菌SZ-220101作为拮抗菌的实验组病情指数为29.17，空白组病情指数为0，计算得其生防效果为65.57％，表明粪产碱杆菌SZ-220101(Alcaligenes faecalis SZ-220101)具有较强的防治效果，可以有效地控制控香蕉枯萎病，减少损失，是一株在防治香蕉枯萎病上具有潜在意义的生防菌株。
表7香蕉枯萎病分级统计
| 项目 | 0级/株 | 1级/株 | 2级/株 | 3级/株 | 4级/株 |
| (1) | 17 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| (2) | 0 | 0 | 2 | 7 | 9 |
| (3) | 2 | 12 | 3 | 1 | 0 |
由上述实施例可知，本发明提供的所述粪产碱杆菌SZ-220101经过实验验证能够显著的抑制植物病菌，尤其是香蕉枯萎病病菌，为香蕉枯萎病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）SZ-220101，其特征在于，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为 GDMCC No：62996。
2.权利要求 1 所述的粪产碱杆菌 SZ-220101 在防治香蕉枯萎病中的应用。
3.权利要求 1 所述的粪产碱杆菌 SZ-220101 在植物促生中的应用，其特征在于，所述植物促生通过粪产碱杆菌 SZ-220101 的固氮、解磷和产铁载体能力实现。
4.一种防治植物病害的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求 1 所述的粪产碱杆菌 SZ-220101。
5.根据权利要求 4 所述的制剂，其特征在于，所述制剂为液体制剂或固体制剂。
6.根据权利要求 5所述的制剂，其特征在于，当所述制剂为液体制剂时，所述制剂中粪产碱杆菌 SZ-220101 的浓度为1×107~1×109CFU/mL。
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