CN108949632B - 一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌yh-20及其应用 - Google Patents

一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌yh-20及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH‑20及其应用，该菌株分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH‑20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018361，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2018年06月11日。本发明的解淀粉芽孢杆菌YH‑20对10种植物病原真菌均具有较好的拮抗效果，且对植物本身没有危害，可以明显的促进植物的生长。利用本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌菌株YH‑20可以代替部分农药及化肥的施用。可以有效地保护生态环境以及保护林业树木的生产。

Description

一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH-20及其 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH-20及其应用。
背景技术
化学防治是林业上防治病虫害的一种重要手段，我国是世界上农药和化肥的使用大国，但是农药和化肥的大量使用造成了环境污染、土壤板结、生态平衡遭到破坏等一系列的问题，随着环境的日益恶化，农药污染问题愈来愈受到人们的重视，所以寻找一种对环境友好且具有良好防治效果的方法则显得尤为重要。
生物防治由于具有污染小、专一性强、不易产生抗药性等优点，既对人畜及环境无害，又对近年来受到社会的广泛关注和认可。PGPR是一种可以促进植物生长的根际细菌，其在生长的过程中可以通过释放植物激素、溶磷、固氮或产生抗生素、与病原体竞争生长位点从而达到促生和抗病的效果。目前已有许多PGPR菌株，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属和伯克霍尔德氏菌属已在生物防治和促进植物生长中进行应用。这些菌株的应用显著的促进了植物的生长并且减少了植物病害的发生。
芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，作为土壤中的优势菌株，具有生长快、分布广、可以促进植物生长、能够产生的内生孢子、抗逆性强等诸多优点，引起诸多了学者的关注和研究。目前已报道的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等等，其中已有部分菌株投入生产，如如美国Gustafson公司开发的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)GBO3和短小芽孢杆菌(B.pumilus)GB34、美国Novozymes Biologicals公司开发的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)SB3086、德国Abitep Gmb H公司开发的枯草解淀粉芽孢杆菌(B.subtilisvar.amyloliquefaciens)FZB24等。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一株具有广谱促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH-20，满足林业使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述解淀粉芽孢杆菌YH-20的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH-20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018361，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2018年06月11日。
本申请的解淀粉芽孢杆菌YH-20，是从上海市嘉定区健康樱花枝干组织中分离鉴定得到的，具体过程如下：
菌株的分离：取上海市嘉定区健康樱花枝干组织，先将样品用自来水冲洗干净，晾干后将小枝剪成2cm的小段。然后在超净工作台上进行后续消毒处理(1)75％乙醇溶液浸泡2min(2)用活性氯浓度5.2％的次氯酸钠溶液浸泡枝5-7min、叶20s(3)用无菌水漂洗5次(4)用灭过菌的纱布蘸干水分备用。小枝中内生菌的分离采用组织切片法，表面灭菌后先剪去枝两头变褐的部分，去皮，同时去除木质部，只需保留韧皮部。用灭过菌的镊子将处理好的小枝韧皮部分别置于各类培养基培养，每皿3-4片，用封口膜将培养皿密封，置于培养箱中倒置培养，12h观察一次。若有菌落长出及时分离纯化并编号记录。
菌株的筛选：将滤纸片剪成直径5cm的圆形小片灭菌备用，先将过夜摇培的病原细菌(根癌农杆菌(Agrobacterium tumifaciens)cfcc-1369，保存于南京林业大学森林病理实验室，公众索取可得)均匀的涂布于NA固体培养基，半小时后用小圆片蘸取分离到的菌株的发酵液置于带有病原菌的平板上28℃培养观察。
菌株的鉴定：通过培养和观察，发现YH-20细菌菌体均呈杆状，芽孢呈椭圆形或柱状，幼龄菌落为圆形，表面和边缘均光滑，培养15小时后菌落表面变得干燥，起皱，但边缘光滑，菌落仍然为白色，革兰氏染色为阳性，好氧生长。
通过菌落形态、16SrDNA序列(序列如SEQ ID NO.1所示)分析及生理生化特性可知菌株YH-20为解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH-20。
所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20在植物促生中的应用。
所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20在抑菌中的应用。
所述解淀粉芽抱杆菌YH-20的菌剂。
所述解淀粉芽抱杆菌YH-20的生物肥料。
所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20的发酵产物在植物促生中的应用。
所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20或其发酵产物在防控植物病害中的应用。
所述解淀粉芽抱杆菌YH-20在制备菌剂中的应用。
所述解淀粉芽抱杆菌YH-20在制备生物肥料中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明的解淀粉芽抱杆菌YH-20，对10种植物病原真菌均具有较好的拮抗效果，且对植物本身没有危害，可以明显的促进植物的生长。利用本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌菌株YH-20可以代替部分农药及化肥的施用。可以有效地保护生态环境以及保护林业树木的生产，具有很好的实用性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
将解淀粉芽孢杆菌YH-20在LB培养基上划线活化，28℃培养箱培养24h后挑取单菌落于500mL LB液体培养基的1L三角瓶中，180r/min，28℃摇培72h，得到发酵液。将发酵液4℃，10000r/min离心l0min，得上清液，用0.22μm的微孔过滤器进行过滤，即得无菌发酵液。
本实例以10种植物病原菌(均保存于南京林业大学森林病理实验室，公众索取可得)为靶标菌，十种植物病原菌分别为：七叶树壳梭孢(Fusicoccus aesculi)、小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、苹果轮纹病菌(Dothierella gregaria)、松树脂溃疡病菌(Fusarium circinatum)、异角状拟盘多毛孢(Pestalotiopsis vesicolor)、茶云纹叶枯病菌(Guignardia camelliae)、炭疽菌(Colletotrichum sp)、交链孢(Alternaria sp)、松树枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)。
采用毒介质法测定解淀粉芽孢杆菌YH-20对植物病原菌的抑制率，将20mL的无菌发酵液与冷却至50℃的180mL PDA培养基混匀，倒平板，待冷却后在平板中央接入菌饼(直径5mm)，每个处理三个重复，在28℃培养72h，以加入无菌水作为对照处理，采用十字相差法测量菌落直径，采用菌丝生长速率法计算发酵液的抑菌率，其计算公式为；抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。
解淀粉芽孢杆菌YH-20对植物病原菌的抑制结果如表1所示。结果显示解淀粉芽孢杆菌YH-20对植物病原菌的抑菌活性较强，抑菌谱较广。
表1解淀粉芽孢杆菌YH-20对供试病原真菌的抑制作用
实施例2
挑取解淀粉芽孢杆菌YH-20单菌落于500mLLB液体培养基的1L三角瓶中，180r/min，28℃摇培72h，得到发酵液。将发酵液用0.22pm的微孔过滤器进行过滤，得YH-20无菌发酵液，挑选籽粒饱满番茄种子30粒，用YH-20无菌发酵液及其不同稀释倍数(10、50、100、200、500、1000倍)的无菌水稀释液和相同稀释倍数的LB培养液(空白对照，CK)各10mL浸泡种子，24h后将种子置于含有湿润滤纸片的培养皿中，每个处理30粒种子，设3次重复，96h后测量、记录种子的根长，结果如表2所示，结果显示经过50×发酵液浸泡过的番茄种子根长的增加率最高，达到78.45％，所以解淀粉芽孢杆菌YH-20发酵液对番茄种子对番茄种子的根长具有显著的促进作用。
表2解淀粉芽孢杆菌YH-20不同稀释倍数的发酵液对番茄种子根长的影响
实施例3
将解淀粉芽孢杆菌YH-20在LB平板上划线活化，放入28℃培养箱中培养24h，挑取单菌落于装有30mL的LB培养基的摇瓶中，以28℃、180r/min摇培，以血球计数法计数，待摇培液中细菌浓度为108cfu/mL时，将发酵液以10000r/min离心，得菌体，以相同体积的无菌水重悬即可得浓度108cfu/mL的菌悬液，待用。无菌发酵液的制备方法同实施例2。
将经过消毒处理的种子播种于播种盘内，待其萌发30天后，测定其原始株高，进行施菌处理。以施培养基为对照，分别施加相同体积50mL的无菌发酵液、发酵液以及菌悬液。15d后测量其株高，并计算其增加率。每个实验处理为50株番茄幼苗。番茄幼苗的株高增加率如表3所示。结果显示施用无菌发酵液、菌悬液及发酵液的番茄幼苗，其株高的增加率均较ck有较大的增长，结果表明解淀粉芽孢杆菌YH-20可以有效的促进番茄幼苗植株的生长。
表3解淀粉芽孢杆菌YH-20对番茄幼苗的影响
处理 株高增加率/％
ck 8.28
无菌发酵液 18.76
菌悬液 14.12
发酵液 37.59
实施例4
将解淀粉芽孢杆菌YH-20在LB平板上划线活化，放入28℃培养箱中培养24h，挑取单菌落于装有500mL的LB培养基的摇瓶中，以28℃、180r/min摇培，以血球计数法计数，待摇培液中细菌浓度为108cfu/mL停止摇培。将发酵液50mL以灌根的方式施于两年生的水杉、柳树、松树、猕猴桃、梧桐盆栽苗的根际，以施相同体积的培养基为对照。两个月后测定其生长量，其株高和地径的增加率如表4所示。结果表明经过解淀粉芽孢杆菌YH-20处理过的五种苗木，不论是株高和地径其增加率均高于ck，说明解淀粉芽孢杆菌YH-20对多种树种均具有良好的促生作用。
表4解淀粉芽孢杆菌YH-20的促生作用
实施例5
将解淀粉芽孢杆菌YH-20在LB平板上划线活化，放入28℃培养箱中培养24h，挑取单菌落于装有30mL的LB培养基的摇瓶中，以28℃、180r/min摇培24h即可得种子液。将种子液接种于50L液体发酵罐中发酵培养24h，获得大量细菌发酵液，以血球计数法计数，待摇培液中细菌浓度为108cfu/mL停止发酵，取出备用。施菌方法：根施法，将发酵所得的液体菌剂与水按1∶4比例混匀，在距离苗木20cm-30cm处挖穴深约10cm(根际)在苗木根际处将稀释液浇灌到苗木根部，盖上土壤。其实验树种与施菌量如表5所示。
表5实验树种与施菌量
施菌前测量栽种数木的地径和株高的原始数据，两个月后在进行地径和株高的统计，计算地径和株高的增加率。其促生结果如表6所示。结果表明，在大田试验中，解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌YH-20对杨树、东方杉、樟树，水杉、樱花均具有较高的促生率。
表6促生结果
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌YH-20及其应用
<130> 100
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1568
<212> DNA
<213> Bacillus. amyloliquefaciens
<400> 1
tgtaatacga ctcactatag ggcgaattga agctgccctt ggttaccttg ttacgacttc 60
accccaatca tctgtcccac cttcggcggc tggctcctaa aaggttacct caccgacttc 120
gggtgttaca aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca 180
ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac 240
tgcgatccga actgagaaca gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct 300
ttgttctgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg 360
tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc 420
tggcaactaa gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg 480
agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta 540
ggattgtcag aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac 600
atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta 660
ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac 720
acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca 780
cgctttcgct cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct 840
ccacatctct acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa 900
gttccccagt ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag 960
aaaccgcctg cgagcccttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt 1020
accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg 1080
ccctatttga acggcacttg ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc 1140
atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct 1200
gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt 1260
cggctacgca tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg 1320
tccatctgta agtggtagcc gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcagacaac 1380
tatccggtat tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg 1440
tgttactcac ccgtccgccg ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactt 1500
gcatgtatta ggcacgccgc cagcgttcgt cctgagccag gatcaaactc taagggcagc 1560
ttggcgta 1568

Claims (9)

1.一株具有广谱抗病促生作用的解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)YH-20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018361，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2018年06月11日。
2.权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20在植物促生中的应用。
3.权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20在抑菌中的应用。
4.含有权利要求1所述解淀粉芽抱杆菌YH-20的菌剂。
5.含有权利要求1所述解淀粉芽抱杆菌YH-20的生物肥料。
6.权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20的发酵产物在植物促生中的应用。
7.权利要求1所述的解淀粉芽抱杆菌YH-20或其发酵产物在防控植物病害中的应用。
8.权利要求1所述解淀粉芽抱杆菌YH-20在制备菌剂中的应用。
9.权利要求1所述解淀粉芽抱杆菌YH-20在制备生物肥料中的应用。
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