CN115029286B - 一种生防菌复配菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生防菌复配菌剂及其应用，属于生防菌剂技术领域。为解决现有单一生防菌株防治效果不稳定的问题，本发明提供了一种生防菌复配菌剂，包括暹罗芽孢杆菌Bs‑9和粉红粘帚霉C.R，还包括枯草芽孢杆菌Bswy‑1。本发明通过生防细菌暹罗芽孢杆菌Bs‑9、枯草芽孢杆菌Bswy‑1和生防真菌粉红粘帚霉C.R的复配，得到具有促生作用和生物防治作用的微生物菌剂，解决了单一菌株的局限问题。生防菌复配菌剂能够促进种子发芽和幼苗生长、抑菌谱广、拮抗作用强，不但能够有效抑制农作物病原真菌的生长，还能诱导植物相关防御酶活性，从而增强植物的抗病性，能够从不同防治机理出发，获得更全面高效的防治效果、防治范围更广。

Description

一种生防菌复配菌剂及其应用
技术领域
本发明属于生防菌剂技术领域，尤其涉及一种生防菌复配菌剂及其应用。
背景技术
我国是世界上番茄产量最高的国家，近年来番茄的栽培面积仍在逐渐增加。我国大部分番茄栽培以设施栽培为主，番茄灰霉病是设施栽培番茄的重大隐患；设施环境条件适合番茄灰霉病的生长繁殖，设施连作更有利于灰霉病菌孢子侵染下一茬作物。受番茄灰霉病侵染的植株大量减产，严重时甚至绝产。如何有效预防和治理灰霉病是番茄种植过程中的重大问题之一。已有研究表明部分化学农药的作用逐渐减弱，甚至病原菌对混合使用的化学农药产生抗药性。为适应“绿色有机蔬菜”和“可持续发展”的要求，响应国家“两减”政策，生物农药在市场上逐渐受到欢迎，前景十分广阔。目前大部分生物菌剂组成是单一菌株，单一菌株在田间生产上时常出现防治效果不稳定，环境适应能力弱等问题。
发明内容
为解决现有单一生防菌株防治效果不稳定的问题，本发明提供了一种生防菌复配菌剂及其应用。
本发明的技术方案：
一种生防菌复配菌剂，包括暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensisi)Bs-9和粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)C.R，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9的菌种保藏编号为CGMCCNo.25088；所述粉红粘帚霉C.R的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977。
进一步的，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9的活菌数为2.0×106cfu/mL～3.33×106cfu/mL；所述粉红粘帚霉C.R的活菌数为1.25×106cfu/mL。
进一步的，还包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs wy-1，所述枯草芽孢杆菌Bs wy-1的菌种保藏编号为ACCC10655。
进一步的，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和粉红粘帚霉C.R的活菌数均为1×109cfu/mL。
一种生防菌复配菌剂在农作物种子及幼苗促生方面的应用，所述生防菌复配菌剂包括暹罗芽孢杆菌Bs-9和粉红粘帚霉C.R，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9的菌种保藏编号为CGMCCNo.25088；所述粉红粘帚霉C.R的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977。
进一步的，所述生防菌复配菌剂中暹罗芽孢杆菌Bs-9的活菌数为2.0×106cfu/mL～3.33×106cfu/mL，粉红粘帚霉C.R的活菌数为1.25×106cfu/mL。
进一步的，所述应用的具体方法是使用生防菌复配菌剂浸泡处理农作物种子。
一种生防菌复配菌剂在农业生物防治方面的应用，所述生防菌复配菌剂包括暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和粉红粘帚霉C.R，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9的菌种保藏编号为CGMCC No.25088，所述粉红粘帚霉C.R的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述枯草芽孢杆菌Bs wy-1的菌种保藏编号为ACCC10655。
进一步的，所述生防菌复配菌剂中暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和粉红粘帚霉C.R的活菌数均为1×109cfu/mL。
进一步的，所述农业生物防治包括将所述生防菌复配菌剂用于防治番茄灰霉病，还包括将所述生防菌复配菌剂用于提高作物抗病能力。
本发明的有益效果：
本发明以生防细菌暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和生防真菌粉红粘帚霉C.R为材料，复配得到具有促生作用和生物防治作用的微生物菌剂，通过对不同菌株的复配，解决单一菌株的局限问题。
本发明生防菌复配菌剂能够促进种子发芽和幼苗生长，抑菌谱广、拮抗作用强、生产成本低，能够减缓化学农药对环境的污染，广泛应用于农业生物防治领域。本发明生防菌复配菌剂不但能够有效抑制农作物病原真菌的生长，还能诱导植物相关防御酶活性，从而增强植物的抗病性，能够从不同防治机理出发，获得更全面高效的防治效果、防治范围更广。
附图说明
图1为实施例1中Bs-9和Bs wy-1垂直交叉划线培养的照片；
图2为实施例1中不同处理下的种子发芽率对比图；
图3为实施例1中不同处理下的种子胚根长度对比图；
图4为实施例2中Bs-9、Bs wy-1和C.R混合液体培养的照片；
图5为实施例5不同处理下番茄幼苗的形态照片；
图6为实施例5不同处理下番茄幼苗根系扫描的照片；
图7为实施例5不同处理下光系统ⅡY(NO)和Y(NPQ)值的对比图；
图8为实施例5不同处理下光合系统Ⅱ光能转化率的对比图；
图9为实施例6不同处理对番茄灰霉病病原菌对峙实验结果照片；
图10为实施例6不同处理对番茄离体叶片的防效结果照片；
图11为实施例6不同处理对番茄植株的温室防效结果照片；
图12为实施例7不同处理复配菌剂对番茄SOD活性的影响对比图；
图13为实施例7不同处理复配菌剂对番茄POD活性的影响对比图；
图14为实施例8中三株生防菌株的IAA检测结果对比照片；
图15为实施例8中三株生防菌株的无菌上清液抑菌效果照片；
图16为实施例8中三株生防菌株的沉底菌体抑菌效果照片；
图17为实施例8中三株生防菌株分泌蛋白酶能力检测结果照片；
图18为实施例8中三株生防菌株分泌嗜铁素能力检测结果照片；
图19为实施例8中三株生防菌株产生HCN能力检测结果照片；
图20为实施例8中三株生防菌株产生抗菌粗蛋白的抑菌活性测定结果照片；
图21为实施例8中三株生防菌株产生脂肽类抗生素的抑菌活性测定结果照片；
图22为实施例8中三种生防菌株的乙酸乙酯萃取活性物质的抑菌活性检测结果照片；
图23为实施例8中三种生防菌株挥发性物质的抑菌活性检测结果照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例检测了暹罗芽孢杆菌Bs-9和粉红粘帚霉C.R的生物相容性。
本实施例中暹罗芽孢杆菌Bs-9由番茄根际土壤分离纯化所得，于2022年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25088；
粉红粘帚霉C.R来自东北农业大学番茄实验室，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.1977。
暹罗芽孢杆菌Bs-9的培养方法为：暹罗芽孢杆菌Bs-9的单菌落接种于无菌LB培养液中，28℃、200r/min培养1～2d。
粉红粘帚霉C.R的活化、培养方法为取4℃保藏的C.R，用接种针挑取菌丝，接种于PDA固体培养基，28℃培养7d，使菌株活化，取活化后菌丝接种于PDA固体培养基，扩大培养。
生物相容性具体检测方法为：
(1)用接种环分别蘸取28℃，200rpm/min培养24h的两株生防细菌暹罗芽孢杆菌Bs-9和枯草芽孢杆菌Bs wy-1的菌悬液，采取垂直交叉划线方式于LB固体培养基；28℃，培养48h，观察细菌交叉处生长情况，结果如图1所示，Bs-9和Bs wy-1交叉划线处两种生防细菌均能正常生长。
(2)本实施例以番茄品种为“Glamour”为实验番茄品种，由东北农业大学园艺生物技术课题组提供。
首先对番茄种子进行消毒：将番茄种子置于55℃温水中，浸泡20min；用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3次；3％次氯酸钠浸泡3min，无菌水冲洗3次。
将生防细菌Bs-9和生防真菌C.R原菌悬液(1×109cfu/mL)均稀释100倍，实验对比分为7组：组合1(Bs-9)；组合2(Bs wy-1)；组合3(C.R)；组合4(Bs-9和C.R，1：1)；组合5(Bswy-1和C.R，1：1)；组合H(Bs-9、Bs wy-1、C.R，1：1：1)和CK(无菌水)，每组10mL液体，各浸泡30粒种子，3h后用无菌水冲洗，后将种子摆入种子袋。分别记录36h、48h种子发芽率和4d种子胚根生长量。试验3次重复，结果如图2和图3所示。
图2显示，单一菌株和复配菌株的发芽率均高于对照，复合菌株的种子发芽率均高于单一菌株，说明菌株的复配不会降低生防菌液对种子萌发得的促进作用，且能提高菌株的促生效果，其中发芽率最高的为Bs-9+C.R组合，36h和48h种子发芽率分别为74％和88％。
4d后测定种子胚根长度，图3显示，单一菌株和复配菌株的胚根长度均高于对照，复配菌株Bs wy-1+C.R和H与单一菌株相比差异不显著，说明菌株的复配不会降低生防菌对根系发育的促进作用，且促进效果更好，其中胚根长度最长为Bs-9+C.R组合，为5.00cm。
实施例2
本实施例提供了一种生防菌复配菌剂，包括暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensisi)Bs-9、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs wy-1和粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)C.R，其中暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和粉红粘帚霉C.R的活菌数均为1×109cfu/mL。
本实施例中暹罗芽孢杆菌Bs-9由番茄根际土壤分离纯化所得，于2022年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25088；
枯草芽孢杆菌Bs wy-1购自中国农业微生物保藏管理中心，保藏编号为ACCC10655。
粉红粘帚霉C.R来自东北农业大学番茄实验室，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.1977。
暹罗芽孢杆菌Bs-9的培养方法为：暹罗芽孢杆菌Bs-9的单菌落接种于无菌LB培养液中，28℃、200r/min培养1～2d。
枯草芽孢杆菌Bs wy-1的活化、培养方法为：取-80℃甘油保藏的Bs wy-1，于室温下完全解冻，取菌液1mL于50mL的LB液体培养基，28℃，200rpm/min培养24h；取培养好的菌液在LB固体培养基划线，挑取划线后得到单菌落，转接到LB固体培养基，28℃恒温培养24h，备用。
粉红粘帚霉C.R的活化、培养方法为取4℃保藏的C.R，用接种针挑取菌丝，接种于PDA固体培养基，28℃培养7d，使菌株活化，取活化后菌丝接种于PDA固体培养基，扩大培养。
本实施例检测了暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和粉红粘帚霉C.R的生物相容性，具体方法为将培养的两株细菌菌悬液按1％(V/V)接种于300mLPDA液体培养基中，加入真菌粉红粘帚霉C.R的菌块；于28℃，200rpm/min培养，观察是否有菌丝产生，结果如图4所示，Bs-9、Bs wy-1和C.R的混合培养液中，可见C.R菌丝产生，说明在生防细菌存在的环境下C.R可生长。
实施例3
本实施例提供了一种生防菌复配菌剂，由暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensisi)Bs-9的菌悬液和粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)C.R的菌悬液组成，其中暹罗芽孢杆菌Bs-9的活菌数为3.33×106cfu/mL；所述粉红粘帚霉C.R的活菌数为1.25×106cfu/mL。
实施例4
本实施例提供了一种生防菌复配菌剂，由暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensisi)Bs-9的菌悬液和粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)C.R的菌悬液组成，其中暹罗芽孢杆菌Bs-9的活菌数为2.00×106cfu/mL；所述粉红粘帚霉C.R的活菌数为1.25×106cfu/mL。
实施例5
本实施例考察了实施例3和实施例4提供的生防菌复配菌剂的促生作用效果。
本实施例以番茄品种为“Glamour”为实验番茄品种，由东北农业大学园艺生物技术课题组提供。
(一)种子发芽率
将消毒后的番茄种子浸泡在含10mL生防菌复配菌剂中，3h后将种子取出，均匀摆放在一层铺有无菌滤纸的培养皿中，用无菌水将滤纸浸湿，每皿30粒种子，试验3次重复，记录36h后的发芽率，其中实施例3复配菌剂的36h发芽率为82.33％，实施例4复配菌剂的36h发芽率为80.00％。
(二)番茄幼苗形态和根系形态
用实施例3复配菌剂、实施例4复配菌剂和无菌水对照CK分别浸泡消毒后的番茄种子3h后，播种于营养钵中。移苗时两处理分别在土壤中注入10mL实施例3复配菌剂、实施例4复配菌剂和等量无菌水，培养30d后测定以下指标。
(1)形态指标的测定
测定幼苗的株高、茎粗、鲜重和干重；结果如图5和表1所示；在不损伤根系下用流水冲洗干净后，利用图像分析系统测定幼苗根系指数，结果如图6和表2所示。
表1
Figure BDA0003758136080000061
如表1所示，经实施例3复配菌剂和实施例4复配菌剂处理组的株高、茎粗、根系鲜重、根系干重、植株鲜重、植株干重均高于对照组。其中实施例3复配菌剂处理组的株高和茎粗显著高于实施例4复配菌剂处理组和对照组；根系鲜重和根系干重三组处理差异不显著；植株鲜重实施例3复配菌剂处理组、实施例4复配菌剂处理组和对照组之间差异显著；植株干重实施例3复配菌剂处理组和实施例4复配菌剂处理组显著高于对照组。
表2
Figure BDA0003758136080000062
Figure BDA0003758136080000071
如表2所示，经实施例3复配菌剂处理组的根长、根系表面积、节点数量和根尖数量均高于实施例4复配菌剂处理组和对照，由此说明实施例3复配菌剂处理组的根系生长环境更有利于根系生长。实施例3复配菌剂处理组的根长和表面积显著高于对照，与实施例4复配菌剂处理组的差异不显著。
(三)番茄光合作用效率
叶绿素荧光参数的测定：幼苗测定前进行3h黑暗处理，利用IMAGING-PAM植物荧光成像系统测定各处理的叶绿素荧光参数。部分叶绿素荧光参数意义如表3所示，结果如图7和图8所示。
表3
Figure BDA0003758136080000072
如图7所示，实施例3复配菌剂、实施例4复配菌剂和CK处理组的Y(NO)值分别为0.2461、0.2486、0.2480，均在0.24-0.25之间，各处理之间差异不显著；说明经过实施例3复配菌剂和实施例4复配菌剂处理后，番茄幼苗没有受到损伤和胁迫。实施例3复配菌剂、实施例4复配菌剂和CK处理组的Y(NPQ)值分别为0.4658、0.4048、0.3318，实施例3复配菌剂、实施例4复配菌剂显著高于CK；Y(NPQ)值越高说明植物光保护能力越强。经实施例3复配菌剂处理后的番茄幼苗光保护能力最强。
如图8所示，Fv/Fm表示光系统Ⅱ的最大光能转换率，实施例3复配菌剂处理组为0.7667、实施例4复配菌剂处理组为0.7601、CK为0.7475；实施例3复配菌剂和实施例4复配菌剂处理组差异不显著，与CK差异显著。Y(Ⅱ)为光系统Ⅱ的实际光能转换率，实施例3复配菌剂处理组为0.7293、实施例4复配菌剂处理组为0.7086、CK为0.6985；实施例3复配菌剂和实施例4复配菌剂处理组显著高于CK。说明实施例3复配菌剂和实施例4复配菌剂处理均能够提高番茄叶片的光能转化率，实施例3复配菌剂效果优于实施例4复配菌剂。
实施例6
本实施例考察了实施例2提供的生防菌复配菌剂对番茄灰霉病的防效。
本实施例以番茄品种为“Glamour”为实验番茄品种，由东北农业大学园艺生物技术课题组提供。供试番茄灰霉病病原菌：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)保藏于本实验室。
(一)番茄灰霉病病原菌对峙实验
实验对比分为8组，分别为是组合1(Bs-9)、组合2(Bs wy-1)、组合3(C.R)、组合4(Bs-9和Bs wy-1，活菌数比为1：1)、组合5(Bs-9和C.R，活菌数比为1：1)、组合6(Bs wy-1和C.R，活菌数比为1：1)、组合7(Bs-9、Bs wy-1和C.R，活菌数比为1：1：1)和CK(无菌水)，用血球计数板和平板计数法调节各组合浓度在1×109cfu/mL。
在PDA固体培养基中心接种番茄灰霉病病原菌块，在灰霉病菌块等距三点放置牛津杯，共三板。每板分别为组合1、2、3，组合5、6、7，组合4、7和CK。牛津杯中分别加入100μL各组复合菌剂，28℃恒温培养7d，观察是否有抑菌圈产生，并记录其宽度。试验3次重复，结果如图9和表4所示。
表4
Figure BDA0003758136080000081
如图9和表4所示，单一菌剂抑菌效果抑菌Bs-9＞Bs wy-1＞C.R，分别为0.25cm、0.23cm、0.20cm。复配菌剂抑菌效果均大于Bs wy-1和C.R，效果最好的为实施例2复配菌剂Bs-9+Bs wy-1+C.R的组合，与番茄灰霉病对峙中，抑菌带宽度为0.50cm，显著高于单一菌剂和其他复配菌剂。说明生防菌复配能够提高单一菌株的抑菌效果。
(二)番茄离体叶片防效
灰霉病原菌孢子悬液制备：取产孢量大的灰霉病原菌，用无菌水冲洗培养基表面，并用灭菌枪头在菌丝表面划线，刮落孢子，过滤菌丝。用分光光度计和血球计数板调节浓度为1×106cfu/mL。
摘取无病害的番茄叶片，75％酒精浸泡30s，后用无菌水冲洗3次；3％次氯酸钠浸泡3min，水洗3次。将晾干的叶片置于放有湿润无菌滤纸的培养皿中，叶柄用浸湿无菌脱脂棉包裹，叶片均匀涂抹Bs-9菌液、Bs wy-1菌液、C.R菌液、无菌水、嘧霉胺杀菌剂和实施例2的复配菌剂，晾干后用浓度为1×106cfu/mL的灰霉病原菌孢子悬液均匀涂抹叶片，25℃恒温培养，逐日观察并记录发病情况。
番茄灰霉病分级标准：
番茄在遭受灰霉病侵害后，会出现叶片褪绿现象。在离体叶片实验中，用番茄离体叶片褪绿面积为发病等级指标；温室盆栽实验中，依照叶片病斑面积计算植株发病情况，病害等级如表5所示。
表5
Figure BDA0003758136080000091
计算公式：
Figure BDA0003758136080000092
每次处理20片叶片，试验3次重复，结果如图10和表6所示。
表6
Figure BDA0003758136080000093
Figure BDA0003758136080000101
如表6和图10所示，CK病情指数为67.04，各处理病情指数C.R(36.85)＞Bs wy-1(34.81)＞Bs-9(32.78)＞嘧霉胺(26.67)＞Bs-9+Bs wy-1+C.R(24.44)，病情指数最低的为实施例2提供的Bs-9+Bs wy-1+C.R复配菌剂。单一菌剂处理之间病情指数差异不显著，复配菌剂和嘧霉胺之间病情指数差异不显著，复配菌剂病情指数显著低于单一菌剂和CK。
防治效果Bs-9+Bs wy-1+C.R(63.43％)＞嘧霉胺(60.11％)＞Bs-9(50.84％)＞Bswy-1(47.87％)＞C.R(44.82％)，防治效果最好的为实施例2提供的Bs-9+Bs wy-1+C.R复配菌剂。单一菌剂之间防治效果差异不显著，复配菌剂和嘧霉胺之间防治效果差异不显著，复配菌剂防治效果显著高于单一菌剂。
综合病情指数和防治效果，实施例2提供的Bs-9+Bs wy-1+C.R复配菌剂能显著降低番茄离体叶片的病情指数，提高防治效果。
(三)番茄植株的温室防效
将经浸种后的番茄种子播种到育苗穴盘中，种子发芽15d后移苗到营养钵，幼苗生长至4-5叶后进行温室防效试验。
复配菌剂采用喷施叶片和灌根两种方式：
(1)喷施：Bs-9、Bs wy-1和C.R的复配菌剂喷施叶片；
(2)灌根：在植株根部1cm处加入20mLBs-9、Bs wy-1和C.R复配菌液。
接种灰霉孢子悬浮液为1×106cfu/mL。
实验设计如下：
BC：仅番茄灰霉病处理，用的灰霉病原菌孢子悬液喷施植株叶片正反面。
BC+复配菌剂(喷施)：先灰霉病原菌孢子悬液喷洒植株叶片正反面；24h后叶片正反喷施Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂。
BC+复配菌剂(灌根)：先灰霉病原菌孢子悬液喷洒植株叶片正反面；24h后用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂进行灌根处理。
复配菌剂(喷施)+BC：先用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂喷施植株叶片正反，24h后用灰霉病原菌孢子悬液，喷施植株叶片正反面。
复配菌剂(灌根)+BC：先用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂灌根，24h后用灰霉病原菌孢子悬液，喷施植株叶片正反面。
BC+嘧霉胺：先用灰霉病原菌孢子悬液，喷洒植株叶片正反面；24h后叶片正反喷施嘧霉胺。
嘧霉胺+BC：先用嘧霉胺喷施植株叶片正反，24h后用灰霉病原菌孢子悬液，喷洒植株叶片正反面。
经上述处理后，25℃，保持一定湿度，每日观察植株发病情况并记录，结果如图11和表7所示。
表7
Figure BDA0003758136080000111
如图11和表7所示，6组处理中病情指数最低(19.14)和防治效果最好(69.48％)的为Bs-9+Bs wy-1+C.R复配菌剂(喷施)+BC，所有处理的病情指数均显著低于对照，经复配菌剂处理的病情指数和防治效果与嘧霉胺相比差异不显著。
结果表明叶面喷施和灌根均能有效防治番茄灰霉病，叶面喷施效果要好于灌根。进行灌根处理时，后接种灰霉病的效果要优于先接种灰霉病；而在进行叶面喷施时，先施用复配菌剂后接种灰霉病的防治效果更好，复配菌剂在叶面首先迅速繁殖，占领生存空间，从而抑制灰霉病菌的侵染。
实施例7
本实施例考察了复合菌剂对诱导番茄叶片相关酶活性的影响。
以4-5片真叶的番茄幼苗为试验材料，设如下处理组：
BC：浓度为1×106cfu/mL灰霉孢子菌悬液喷施处理；
处理1：先接种番茄灰霉病病原菌，再用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂喷施叶片；
处理2：先接种番茄灰霉病病原菌，再用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂灌根处理；
处理3：先用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂喷施处理，再接种番茄灰霉病病原菌；
处理4：先用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂灌根处理，再接种番茄灰霉病病原菌。
均处理完成后，从第二天开始7d连续取样，取生长部位、生长状况一致的叶片于1.5mL离心管中，液氮速冻，保存于-80℃冰箱备用。
准确称取同一部位，生长较一致的叶片0.1g，加入1mL提取液，4℃低温破碎研磨机充分研磨，4℃低温8000g离心10min，后取上清液于新的离心管中，按本领域常规方法测定相关酶活，结果如图12和图13所示。
如图12所示，SOD酶活性呈现先升高后降低趋势，各处理和在番茄灰霉病病原菌胁迫下都能诱导SOD活性增强。处理1、3、4在第三天SOD达到最高值(20.8U/gFW，24.9U/gFW，28.14U/gFW)，处理2和BC在第四天达到最高值(23.91U/gFW，15.43U/gFW)。4组处理的诱导能力均强于番茄灰霉病菌，且作用时间更长。说明复配菌剂叶面喷施和灌根均能提高SOD酶活性，复配菌剂在接种灰霉病原菌前后施用都能有效提高SOD酶活性，诱导植物产生抗性。其中效果最好的为处理4(先用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂灌根处理再接种灰霉)。
如图13所示，POD活性呈先升高后降低趋势，各处理和在番茄灰霉病病原菌胁迫下都能诱导POD活性增强。处理1、处理2POD活性在三天达到最高值(6453U/gFW，7267U/gFW)，处理3和BC在第四天达到最高值(12027U/gFW，4933U/gFW)，处理4在第5天达到最高值(8200U/gFW)。4组处理的POD活性均高于BC，且作用时间更长。说明复配菌剂叶面喷施和灌根均能提高POD酶活性，复配菌剂在接种灰霉病原菌前后施用都能有效提高POD酶活性，诱导植物产生抗性。其中效果最好的为处理3(先用Bs-9、Bs wy-1和C.R复配菌剂喷施处理，再接种灰霉)。
实施例8
本实施例检测了生防菌株的促生及抑菌物质。
(一)IAA检测
分别配置50mL LB液体培养基，加入1％的L-色氨酸，后接种生防细菌Bs wy-1、Bs-9，28℃恒温，200rpm/min培养48h；配置50mL PDB培养基，加入1％的L-色氨酸，后接种生防真菌C.R，28℃恒温，200rpm/min培养4d。
分别取Bs wy-1、Bs-9和C.R菌液于离心管，10000rpm离心20min。分别取1mL上清液，加入2mL Salkowaski试剂，随后加入两滴正磷酸。将混合液于28℃水浴2h，观察溶液是否变红，若变红则说明生防菌能分泌IAA。试验3次重复，结果如图14所示。
如图14所示，加入1％L-色氨酸的培养48h细菌菌液和培养4d真菌菌液，离心取上清液，加入Salkowaski后，菌株Bs-9、Bs wy-1和C.R溶液变为红色，三株生防菌都能产生IAA。Bs-9、Bs wy-1和C.R能通过产生植物生长素IAA来促进植物生长。
(二)生防菌株上清液和沉淀抑菌活性测定
分别配置LB、PDA液体培养基，细菌28℃，200rpm/min培养48h，真菌28℃，200rpm/min培养4d得到发酵液；4℃，10000rpm/min离心10min，上清液过0.22μm滤膜，沉淀用等量无菌水溶解后超声破碎。将灰霉病菌块和牛津杯分别放置PDA培养基两侧，牛津杯加入100μL液体，28℃，恒温培养7d，观察抑菌情况，结果如图15和图16所示。
如图15所示，Bs-9、Bs wy-1和C.R发酵液，离心后取上清液，过0.22μm滤膜；牛津杯加入100μm滤液与灰霉病菌平板对峙。Bs-9、Bs wy-1和C.R滤去菌体的上清液均有抑菌效果，说明生防菌能分泌抑菌物质存在于发酵液上清液中。
如图16所示，Bs-9、Bs wy-1和C.R培养48h发酵液，离心后取沉淀，用无菌水溶解后超声破碎；牛津杯加入100μm菌液与灰霉病菌平板对峙。Bs-9、Bs wy-1和C.R的菌体水溶液均有抑菌效果。
(三)生防菌株蛋白酶、嗜铁素和HCN的能力检测
蛋白酶：采用蛋白酶培养基，检测生防菌是否具有此种酶活性。在晾干的培养基中间放置一无菌滤纸片(Φ5mm)，滴加5μL菌液；28℃恒温，逐日观察是否有解酶圈产生。结果如图17所示。
嗜铁素：生防细菌采用嗜铁素固体培养基，晾干培养基中间放置无一菌滤纸片(Φ5mm)，滴加5μL生防菌液；28℃，逐日观察是否有透明圈产生。生防真菌采用嗜铁素液体培养基，配置嗜铁素液体培养基20mL，添加真菌菌块，以不添加菌块为对照，28℃恒温，200rpm/min培养5-7d；观察菌液颜色，若变成粉红色，则证明能产生嗜铁素。结果如图18所示。
HCN：取10mL菌液于试管，滴加一滴浓硫酸，充分混匀，取HCN试纸浸入溶液中；等待15min，浓度较低时可等待过夜，根据HCN浓度试纸由浅蓝色变为深蓝色，未变色则证明未产生HCN。结果如图19所示。
如图17所示，Bs-9、Bs wy-1和C.R滴加菌液的滤纸片外围均有明显透明圈产生，说明Bs-9、Bs wy-1和C.R能分泌蛋白酶。
如图18所示，Bs-9和Bs wy-1嗜铁素检测固体培养基，菌落周围有明显透明圈产生，说明Bs-9和Bs wy-1可以产生嗜铁素。C.R嗜铁素检测液体培养基，培养4d后颜色变为粉红色，对照未变色，说明C.R可以产生嗜铁素。Bs-9、Bs wy-1和C.R均可通过产生嗜铁素，从而在营养竞争中占据优势。
如图19所示，HCN检测中，浸有检测液的试纸等待过夜后仍未变色，说明Bs-9、Bswy-1和C.R不能产生HCN。
(四)生防菌株抗菌粗蛋白检测
挑取生防菌分别于LB、PDA液体培养基，细菌28℃，200rpm/min培养48h，真菌28℃，200rpm/min培养4d；后4℃低温，8000rpm/min离心30min，取上清液过0.45μm滤膜；得到抑菌物质粗提产物。
向上述无菌滤液中加入硫酸铵至饱和度为60％，4℃低温静置12h；后8000rpm/min离心30min，去上清液，在沉淀中加入磷酸缓冲液(pH7.4、0.02mol/L)完全溶解，即得到粗提蛋白。将灰霉病原菌块(Φ＝5mm)放在凝固的PDA培养基中心，等距放置牛津杯，取100μL样品于牛津杯，28℃，培养一周，测定抑菌活性。
结果如图20所示，生防菌液经硫酸铵沉淀后，磷酸缓冲液溶解沉淀与灰霉病菌的平板对峙中，Bs-9、Bs wy-1和C.R的蛋白类物质对灰霉病菌均有抑制作用。说明三株生防菌均有抑菌蛋白产生。说明Bs-9、Bs wy-1和C.R可通过产生抗菌粗蛋白来抑制病原菌。
(五)生防菌株脂肽类抗生素检测
将培养3d菌液离心，取上清液，用浓盐酸调节至pH2.0，沉淀过夜；10000rpm/min离心20min，弃上清，沉淀用原菌液10％体积的甲醇抽提，抽提2h，得到甲醇抽提物过0.22μm滤膜，即为脂肽类抗生素粗提物。按常规方法测定脂肽类抗生素的抑菌活性。
结果如图21所示，生防菌液经浓盐酸沉淀后，甲醇抽提物与灰霉病菌的平板对峙中。Bs-9、抽提物质对灰霉病菌有明显抑制作用，Bs wy-1和C.R抽提物质对灰霉病菌有抑制作用但效果不明显，说明三株菌株均能产生脂肽类抗生素。Bs-9、Bs wy-1和C.R可通过产生脂肽类抗生素来抑制病原菌生长。
(六)乙酸乙酯萃取抑菌活性检测
取培养好Bs-9、Bs wy-1、C.R和三株生防菌混合液的发酵液，8000rpm/min离心20min，分别取400mL发酵液上清液，加入等体积乙酸乙酯萃取，磁力搅拌器搅拌过夜；分液漏斗取上层液体，旋转蒸发浓缩至2mL，测定其抑菌活性。按常规方法测定乙酸乙酯萃取活性物质的抑菌活性，结果如图22所示。
如图22所示，Bs-9、Bs wy-1、C.R和三株生防菌混合液等量进行乙酸乙酯萃取，浓缩后与番茄灰霉病病原菌进行平板对峙，均对番茄灰霉病病原菌有抑制作用。说明三株生防菌能产生聚酮、环二肽类化合物等物质。Bs-9、Bs wy-1、C.R混合发酵后的萃取产物仍具有抑菌效果，说明其产生的物质之间的作用不会影响抑菌活性。
(七)生防菌株挥发性物质检测
将配置好的LB、PDA固体培养基倒在二分格培养皿一格中(真菌全部倒PDA培养基)，晾干，用接种环挑取细菌接种于LB培养基一格(真菌接种菌块于PDA培养基)，灰霉菌块接种于PDA培养基一格，对照只接种灰霉菌块。28℃恒温培养，当对照灰霉病原菌长满二分格培养皿一半时，观察接种生防菌培养皿生长情况。
结果如图23所示，利用二分格培养皿进行菌株挥发性物质检测，当对照板灰霉病菌长满一半时，培养皿另一侧接种Bs-9、Bs wy-1和C.R的灰霉病菌未长满半板；说明Bs-9、Bs wy-1和C.R在生长过程中产生挥发性物质，抑制灰霉病原菌的生长。

Claims (9)

1.一种生防菌复配菌剂，其特征在于，包括暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensisi)Bs-9和粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)C.R，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9的菌种保藏编号为CGMCCNo. 25088；所述粉红粘帚霉 C.R的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977。
2.根据权利要求1所述一种生防菌复配菌剂，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9的活菌数为2.0×106cfu/mL~3.33×106cfu/mL；所述粉红粘帚霉C.R的活菌数为1.25×106cfu/mL。
3.根据权利要求1所述一种生防菌复配菌剂，其特征在于，还包括枯草芽孢杆菌Bs wy-1，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) Bs wy-1的菌种保藏编号为ACCC10655。
4.根据权利要求3所述一种生防菌复配菌剂，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和粉红粘帚霉C.R的活菌数均为1×109cfu/mL。
5.一种生防菌复配菌剂在农作物种子及幼苗促生方面的应用，其特征在于，所述生防菌复配菌剂包括暹罗芽孢杆菌Bs-9和粉红粘帚霉C.R，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9的菌种保藏编号为CGMCC No. 25088；所述粉红粘帚霉C.R的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977。
6.根据权利要求5所述一种生防菌复配菌剂在农作物种子及幼苗促生方面的应用，其特征在于，所述生防菌复配菌剂中暹罗芽孢杆菌Bs-9的活菌数为2.0×106cfu/mL~3.33×106cfu/mL，粉红粘帚霉C.R的活菌数为1.25×106cfu/mL。
7.根据权利要求5或6所述一种生防菌复配菌剂在农作物种子及幼苗促生方面的应用，其特征在于，所述应用的具体方法是使用生防菌复配菌剂浸泡处理农作物种子。
8.一种生防菌复配菌剂在农业生物防治方面的应用，其特征在于，所述农业生物防治为将所述生防菌复配菌剂用于防治番茄灰霉病，所述生防菌复配菌剂包括暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和粉红粘帚霉C.R，所述暹罗芽孢杆菌Bs-9的菌种保藏编号为CGMCC No. 25088，所述粉红粘帚霉 C.R的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述枯草芽孢杆菌Bs wy-1的菌种保藏编号为ACCC10655。
9.根据权利要求8所述一种生防菌复配菌剂在农业生物防治方面的应用，其特征在于，所述生防菌复配菌剂中暹罗芽孢杆菌Bs-9、枯草芽孢杆菌Bs wy-1和粉红粘帚霉C.R的活菌数均为1×109cfu/mL。
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