CN113068716B - 一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂及其应用，特别涉及药剂领域。本发明一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂，所述复配剂的有效成分包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN‑Q‑8的发酵液和宁南·嘧菌酯悬浮剂；所述贝莱斯芽孢杆菌HN‑Q‑8的保藏编号为CGMCC No.19554。本发明所述复配剂能够促进植物生长的同时，还能避免出现土壤板结的问题。

Description

一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂及其应用。

背景技术

马铃薯是世界第四大粮食作物，仅次于水稻、小麦和玉米。马铃薯的生长发育是一个十分复杂的生命过程，不仅需要有机物质和无机物质作为细胞生命活动的结构物质和营养物质，还需要有植物生长物质的调节与控制。为了增产这一目的，种植行业技术人员往往盲目过量使用肥料，尤其是化肥，会造成耕地土壤板结问题。可见如何生产出一种能够显著提高马铃薯生长且不会造成土壤板结的菌剂是十分重要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂及其应用。本发明所述复配剂能够达到促进马铃薯幼苗生长的效果，还能避免出现耕地土壤板结问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂，所述复配剂的有效成分包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8的发酵液和宁南·嘧菌酯悬浮剂；所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的保藏编号为CCTCC NO.19554。

本发明提供了上述复配剂在促进马铃薯幼苗生长中的应用。

本发明提供了一种促进马铃薯幼苗生长的方法，包括以下步骤：

播种马铃薯薯块后，浇灌上述复配剂。

优选的，所述浇灌的次数为1次。

优选的，每次浇灌的用量为30mL/株。

有益效果：

本发明提供一种包含贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的发酵液和宁南·嘧菌酯悬浮剂的复配剂；所述复配剂能够达到促进马铃薯幼苗生长的效果。

本发明所述复配剂中，所述宁南·嘧菌酯能够诱导植物抗性，提高防御酶过氧化物酶(PO)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化氢酶和酚类等物质的活性，防御酶活性含量的增加可提高植株ISR抗性，在寄主-病原相互作用中这些物质与细胞壁组分的交联、蛋白质的聚合、木质素和木栓素单体合成以及涉及紧密相关的抗性反应有关，使植株不易被病原菌侵染；还能诱导相关的病程蛋白质(PR)、热休克蛋白和类囊体蛋白等表达，达到拮抗病原菌入侵的目的。

本发明所述复配剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8能够产生植物生长调节物质，通过对植物的光合、呼吸和渗透调节等生理过程的调节而控制植物的生长发育，增强植物的抗逆能力。芽孢杆菌主要产生的植物生长调节剂包括生长素、细胞分裂素等，其中，生长素可以增加植物细胞的生长力，细胞分裂素可以促进植物细胞分裂和细胞体积的增大。同时，芽孢杆菌还可以诱导植物抗性，使SOD酶等活性增加，进而达到促进植物生长的效果。此外，由于芽孢杆菌可改变土壤菌群结构，并在一定程度上减少了化学肥料的使用量，因此可以避免出现耕地土壤板结问题。本发明中贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8和宁南·嘧菌酯的协同配合下，使得促进植物生长的效果显著，因此本发明所述复配剂是能够达到促进植物生长的效果。实验结果表明：采用本发明所述复配剂能够保证株高的增长率达到10％以上，茎围的增长率达到7％以上，根长的增长率达到5％以上。

生物保藏信息

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8，于2020年04月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19554。

附图说明

图1为复配剂的盆栽试验图，其中1～3分别为单施贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液、单施宁南·嘧菌酯悬浮剂、施用宁南·嘧菌酯+贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8(7:3)的复配剂，4为清水对照；

图2为复配剂的盆栽试验图，其中1～3分别为单施噻呋·嘧菌酯悬浮剂、施用噻呋·嘧菌酯+贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8(1:9)的复配剂，施用噻呋·嘧菌酯+贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8(2:8)的复配剂；

图3为复配剂对马铃薯植株促生长的图片，其中处理一为单施贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液，处理二为单施宁南·嘧菌酯悬浮剂，处理三为施用宁南·嘧菌酯+贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8(7:3)的复配剂，处理四单施噻呋·嘧菌酯悬浮剂，处理五为施用噻呋·嘧菌酯+贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8(2:8)，处理六为施用噻呋·嘧菌酯+贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8(1:9)；

图4为抗性菌株HN-Q-8^Rif与野生菌株室内对立枯丝核菌的抑菌活性图，其中HN-Q-8R为抗性菌株HN-Q-8^Rif，HN-Q-8为野生菌株贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8，CK为无菌水对照；

图5为抗性菌株HN-Q-8^Rif在马铃薯根际的定殖动态图，其中HN-Q-8R为抗性菌株HN-Q-8^Rif。

具体实施方式

如无特殊要求，本发明采用的材料均为本领域技术人才常规购买所得。

本发明提供了一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂，所述复配剂的有效成分包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8的发酵液和宁南·嘧菌酯悬浮剂；所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的保藏编号为CGMCC No.19554。

在本发明中，所述复配剂中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8发酵液和宁南·嘧菌酯悬浮剂(宁南·嘧菌酯SC)的体积比优选为优选为6:0.00875。

在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液中活菌总数优选为8.0×10⁰～8.0×10⁸cfu/mL，更优选为8.0×10²～8.0×10⁸cfu/mL，最优选为8.0×10⁴～8.0×10⁸cfu/mL。

在本发明中，贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8优选为野生型贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8。

在本发明中，所述宁南·嘧菌酯悬浮剂中宁南·嘧菌酯的质量百分含量优选为25％；所述宁南·嘧菌酯悬浮剂优选购自德强生物股份有限公司。本发明具体实施例部分进行生物相容性测定试验时，所述宁南·嘧菌酯悬浮剂的浓度优选为10～500mg/mL，更优选为10～250mg/mL，最优选为10～50mg/mL。在本发明中，所述马铃薯的品种优选为夏波蒂。

本发明对所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的发酵液的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。在本发明具体实施例中，当进行室内盆栽时，优选将贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8接种于发酵培养基进行发酵培养，得贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8菌液发酵液；当进行定殖试验时，优选将贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8接种于LB培养基进行发酵培养，得贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8菌液发酵液。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为37℃；所述发酵培养的时间优选为24h；所述LB培养基的组分优选包括氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L和琼脂18g/L；所述发酵培养基的组分优选包括玉米粉20g/L、豆饼粉20g/L、葡萄糖5g/L、蛋白胨2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.05g/L和碳酸钙1g/L。

在本发明中，所述复配剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将宁南·嘧菌酯与水混合，得稀释药剂；所述宁南·嘧菌酯悬浮剂与水混合的体积比为0.84：674.16；

(2)将贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液与水混合，得稀释菌剂；所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液与水混合的体积比为450：225；

(3)将稀释药剂与稀释菌剂进行混合后，得复配剂；

步骤(1)和步骤(2)没有先后顺序的限定。

本发明对步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)对混合的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

在本发明中，步骤(3)中所述稀释菌剂和稀释药剂混合的体积比为3:7。

在本发明中，所述宁南·嘧菌酯能够诱导植物抗性，提高防御酶过氧化物酶(PO)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化氢酶和酚类等物质的活性，防御酶活性含量的增加可提高植株ISR抗性，在寄主-病原相互作用中这些物质与细胞壁组分的交联、蛋白质的聚合、木质素和木栓素单体合成以及涉及紧密相关的抗性反应有关，使植株不易被病原菌侵染；还能诱导相关的病程蛋白质(PR)、热休克蛋白和类囊体蛋白等表达，达到拮抗病原菌入侵的目的；再结合贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8能够诱导植物产生生长调节物质，如生长素和细胞分裂素等。通过对植物的光合、呼吸和渗透调节等生理过程的调节而控制植物的生长发育，增强植物的抗逆能力，进一步保证提高植物生长的效果，可见在本发明所述发酵液中嘧菌酯和贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的协同配合下，使得促进植物生长的效果显著，因此本发明所述复配剂是能够达到促进植物生长的效果。

本发明提供了上述的复配剂在促进马铃薯幼苗生长中的应用。本发明所述复配剂中贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8能够产生植物生长调节物质，如生长素和细胞分裂素等。通过对植物的光合、呼吸和渗透调节等生理过程的调节而控制植物的生长发育，增强植物的抗逆能力，进而达到促进植物生长的效果。

本发明提供了一种促进马铃薯幼苗生长的方法，包括以下步骤：

播种马铃薯薯块后，浇灌上述复配剂。

在本发明中，优选采用盆栽实验法进行促进马铃薯幼苗生长的验证；所述盆栽试验过程中采用的花盆的直径优选为17.5cm，高度优选为14cm；每个花盆种植1块薯块；所述马铃薯薯块优选为已催芽的种薯；本发明对催芽的方式没有任何特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。在本发明中，所述浇灌的次数优选为1次；每次浇灌的用量优选为30mL/株。在本发明中，所述播种的方式优选为穴播。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

供试培养基有LB培养基和发酵培养基，其中发酵培养基配方：玉米粉20g/L，豆饼粉20g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.05g/L，碳酸钙1g/L；LB培养基：氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、琼脂18g/L。

供试药剂：25％宁南·嘧菌酯悬浮剂(德强生物股份有限公司)；45％噻呋·嘧菌酯悬浮剂(河北冠龙农化有限公司)；贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液。

室内盆栽试验(实施例2)所用贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8菌液发酵液的制备方法：将贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8接种于发酵培养基，在37℃培养24h后，得贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8菌液发酵液。

定殖试验(实施例3)所用贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8菌液发酵液的制备方法：将贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8分种于LB培养基，在37℃培养24h后，得贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8菌液发酵液。

实施例2

将无菌的蛭石、土壤和营养土，按质量比为1:1:1混合均匀。装入已消毒的花盆中，将已催芽的种薯切块进行播种，花盆的直径为17.5cm，高为14cm，每盆穴播1块后，浇灌三种不同比例的复配药剂，分别为复配剂1(宁南·嘧菌酯SC的稀释药剂和贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8发酵液的体积比为7:3，活菌数是3.6×10⁸cfu/mL)、复配剂2(噻呋·嘧菌酯SC和贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8发酵液的体积比为1:9，活菌数是3.6×10⁸cfu/mL)、复配剂3(噻呋·嘧菌酯SC和贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8发酵液的体积比为2:8，活菌数是3.6×10⁸cfu/mL)、单施贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8发酵液的稀释菌剂(活菌数是3.6×10⁸cfu/mL)、单施25％宁南·嘧菌酯悬浮剂药、单施45％噻呋·嘧菌酯悬浮剂药及清水对照，复配剂1的具体制备方法为将0.84L的宁南·嘧菌酯SC加入到674.16L水里，得到稀释药剂；450L贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液加225L水至675L，得到稀释菌剂；然后二者按照体积比7:3混合；复配剂2和复配剂3的具体制备方法为将0.42L噻呋·嘧菌酯SC加入到674.58L，得到稀释药剂，450L贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液加225L水至675L，得到稀释药剂；然后二者按照体积比1:9或2:8混合；浇灌量为每盆30mL剂量，浇灌1次。

试验共设4个处理，每个处理8盆苗。播种6周后，调查全部马铃薯植株根长、茎围和株高，计算其增长率，调查结果见表1、图1～图3。增长率的公式为增长率(％)＝[(处理组(植株指标)-对照组(植株指标))/对照组(植株指标)]×100％，式Ⅲ。

表1不同处理马铃薯的根长、茎围、株高的调查数据

由表1、图1～图3记载的可知，复配剂2和复配剂3虽然相较于单施噻呋·嘧菌酯SC的稀释菌剂效果好，但低于单施贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8发酵液的稀释菌液的处理，可见噻呋·嘧菌酯SC和贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8发酵液混合使用后没有协同增效作用，而采用本发明所述复配剂株高的增长率为53.62％，茎围的增长率为21.6％，根长的增长率为27.27％。

实施例3

复配剂中HN-Q-8在马铃薯根际的定殖规律研究

1、抗利福平菌株HN-Q-8^Rif的获得

将贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8单菌落接种到利福平浓度为0.5μg/mL的LB培养皿中，待菌株可稳定的在其上生长后，再依次转接到利福平浓度为1、10、25、50、100、200、300μg/mL的LB培养基中，转接量为1％，直至诱导至利福平浓度为300μg/mL时结束，即得到抗利福平抗性标记菌株HN-Q-8^Rif，即抗性菌株HN-Q-8^Rif，并保存备用。

2、抗性菌株HN-Q-8^Rif的抑菌稳定性的测定

将保存的抗性菌株HN-Q-8^Rif划线于含30μg/mL利福平的LB培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落于含300μg/mL利福平的LB液体培养基中，37℃200rmp培养12h，以1％的接种量转接到无利福平的液体培养基中，37℃200rmp培养12h，以1％的接种量转接到新的无利福平的液体培养基中，如此反复120h后，将获得发酵液接种5μL于PDA培养皿具中央25mm的滤纸片上，接种马铃薯黑痣病菌(直径5mm)菌饼于培养皿中央。以点接未标记的原始贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8的发酵液和无菌水为对照，25℃培养5d，测量抑菌带宽度，每处理重复3次。

将抗性菌株HN-Q-8^Rif行连续传代培养的120h发酵液及野生型菌株发酵液，测定二者对马铃薯黑痣病菌抑菌活性，结果见表2和图4。

表2抗性菌株HN-Q-8^Rif与野生菌株室内对立枯丝核菌的抑菌作用

菌株	抑菌带宽度(mm)
		HN-Q-8	8.44±0.42
HN-Q-8R	8.06±0.32

注：HN-Q-8为贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8，HN-Q-8R为抗性菌株HN-Q-8^Rif。

结果如表2和图4所示，抗性菌株HN-Q-8^Rif对马铃薯黑痣病菌的抑菌带宽度为8.06±0.32mm，野生型菌株HN-Q-8对黑痣病的抑菌带宽度为8.44±0.42mm，两者的抑菌活性无显著差异，对马铃薯黑痣病菌均有较强的抑制作用。

3、抗性菌株HN-Q-8^Rif在马铃薯根际的定殖能力测定

采用温室盆栽种植马铃薯，当马铃薯长到4～6片真叶时，将30mL的抗性菌株HN-Q-8^Rif分别与宁南·嘧菌酯按3:7和噻呋·嘧菌酯按9:1和8:2制成复配剂，将复配剂浇灌于花盆中，以浇灌等量的抗性菌株HN-Q-8^Rif和等量的培养基为对照，每处理30盆。浇灌后立即取样，然后每5天取样一次，取样至第40天。

从花盆中挖取10g根际土于无菌的三角瓶，加入90mL蒸馏水，充分震荡，80℃水浴15min，吸取1mL土壤悬浮液用0.85％盐水梯度稀释成10^-1～10^-5浓度的悬液，分别吸取100μL梯度稀释液，涂布于含300μg/mL利福平LB固体培养基上，重复三次。37℃培养24h后统计菌落数，最后计算每克根际土中的含菌量。

将三种复配剂和抗性菌株HN-Q-8^Rif的发酵液浇灌于马铃薯根际周围，通过平板稀释涂板的方法测定根际定殖的HN-Q-8的数量，结果见表3和图5。

表3抗性菌株HN-Q-8^Rif在马铃薯根际的定殖情况

注：HN-Q-8R为抗性菌株HN-Q-8^Rif。

结果如表3和图5所示，抗性菌株HN-Q-8^Rif在马铃薯根际土中的生长动态为先增加后减少。浇灌后0～10天菌落数不断增长，第10天定殖数量达到最大值；10天后开始逐渐降低，20天后趋于平稳。其中，宁南·嘧菌酯和HN-Q-8^Rif复配剂处理中HN-Q-8^Rif在第10天时的定殖菌量最大，为7.89×10⁴cfu/g，且在20天后的趋于稳定；噻呋·嘧菌酯和HN-Q-8^Rif复配剂处理中HN-Q-8^Rif的稳定性与单施HN-Q-8^Rif无显著差异。可见各复配剂中宁南·嘧菌酯和HN-Q-8^Rif复配效果最为显著，可促进HN-Q-8在土壤中定殖。由上述可知贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8能够调节土壤微生物菌群，促进植物根系吸收养分，保证种子的发芽率，从而促进植株地上部和地下部的生长。但贝莱斯芽胞杆菌HN-Q-8的单独施用，会造成菌株不能在土壤中有效定殖，从而影响其生防效果。宁南·嘧菌酯和HN-Q-8^Rif复配后，芽胞杆菌定殖能力增强，有利于植株生长。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种促进马铃薯幼苗生长的复配剂，其特征在于，所述复配剂的有效成分包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HN-Q-8的发酵液和25％宁南·嘧菌酯悬浮剂；所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8的保藏编号为CGMCC No.19554；所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液和宁南·嘧菌酯悬浮剂的体积比为2:0.00875；所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液中活菌数为3.6×10⁸cfu/mL。

2.权利要求1所述的复配剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将宁南·嘧菌酯与水混合，得稀释药剂；所述宁南·嘧菌酯悬浮剂与水混合的体积比为0.84：674.16；

(2)将贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液与水混合，得稀释菌剂；所述贝莱斯芽孢杆菌HN-Q-8发酵液与水混合的体积比为450：225；

(3)将稀释药剂与稀释菌剂按体积比7:3进行混合后，得复配剂；

步骤(1)和步骤(2)没有先后顺序的限定。

3.权利要求1或2所述复配剂在促进马铃薯幼苗生长中的应用。

4.一种促进马铃薯幼苗生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：

播种马铃薯薯块后，浇灌权利要求1或2所述复配剂。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述浇灌的次数为1次。

6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，每次浇灌的用量为30mL/株。

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