CN116548473B - 一种含青岛假单胞菌的组合物及其在花卉病害上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含青岛假单胞菌的组合物及其在花卉病害上的应用，属于生物技术领域。本发明提供的青岛假单胞菌具有高效拮抗植物细菌性病害的特点，本发明提供的组合物以真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸和甘蔗糖蜜作为主要原料，联合青岛假单胞菌，具有防治花卉细菌性病害、提高花卉植株根系土壤酶活性及防御性酶活性等优点。本发明具有原材料广泛、成本低廉、制备方法简单等优点，对环境安全和农业可持续发展具有很高的实用性。

Description

一种含青岛假单胞菌的组合物及其在花卉病害上的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种含青岛假单胞菌的组合物及其在花卉病害上的应用。
背景技术
细菌性病害是花卉中的一种常见病害，可以导致植物的生长受到严重影响，如细胞腐烂、叶片凋零、花序变形等，甚至死亡。针对这类病害，目前的防治方法主要包括化学药剂防治、生物农药防治和环境调控等。化学药剂防治是通过使用化学农药控制细菌性病害的方法，虽然该方法可以快速有效地控制病害，但由于对环境和人类的危害较大而不足以广泛使用。生物农药防治则是利用微生物制剂和植物制剂来抑制病原体的生长，逐渐成为当前的热点研究领域。微生物制剂可以通过促进土壤中的微生物多样性，增加土壤肥力和作物品质，提高植物的免疫力和抗性。植物制剂则是通过植物中的次级代谢产物来控制病原体的生长。在环境调节方面，人们可以通过改善种植技术、栽培环境、灌溉水源等控制病菌的传播，减少病害的发生。例如，在种植花卉的过程中可以坚持草本花卉除草，细心修剪树枝和叶片，加强通风、保持合适的潮湿度和温度等方法控制病原体的生长。
微生物肥料中含有活的微生物，可以促进作物的生长。但是目前使用的微生物肥料通常采用经过突变或定向改造的菌株，这些菌株往往在实际应用中会受到环境因素的限制，难以在土壤或植物中定植、生长和发挥应有的作用。因此，基于自然菌株的微生物肥料研究逐渐成为了本领域的热点，但目前鲜有基于天然微生物制备的微生物制剂可用于花卉防病等领域。
综上所述，对花卉的细菌性病害防治，需要综合利用化学药剂防治、生物农药防治和环境调控等手段，而微生物肥料作为一种新兴的肥料类型，需要在基于天然菌株的前提下进一步研究和应用，以提高其制备技术和应用效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种含青岛假单胞菌的组合物及其在花卉病害上的应用。本发明提供的青岛假单胞菌是一株天然的植物根际菌，相比于基因工程改造菌而言，该菌株具有更好的土壤和植物根际定殖能力，含有该菌的菌剂和液态组合物在施用后具有防治花卉细菌性病害、提高花卉植株防御性酶活性等优势效果。
本发明提供了一种含青岛假单胞菌的组合物及其在花卉病害上的应用，其中，该青岛假单胞菌（Pseudomonas qingdaonensis）的保藏编号为CCTCC NO：M2023153；青岛假单胞菌的含量不低于1×1010cfu/g（固体）或1×1010cfu/mL（液体或浓缩）。
本发明提供了含青岛假单胞菌的组合物，包括真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸、甘蔗糖蜜、青岛假单胞菌。
其中，真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸、甘蔗糖蜜的重量比为1-2:1.5-2.5:0.5-1:10-15。
优选地，青岛假单胞菌为保藏编号为CCTCC NO：M 2023153的青岛假单胞菌。以液态组合物的总重量计，青岛假单胞菌的用量为0.1-1重量％；优选青岛假单胞菌在该液态组合物中的含量不低于1×108cfu/mL。
优选地，真菌多糖中水分含量为20-40重量％；真菌多糖中，以干物质计，糖含量为30-50重量％，可溶性胶体含量为15-25重量％，矿物质含量为5-15重量%，粗蛋白含量为2-8重量%；和/或，甘蔗糖蜜中，水分含量为25-35%；糖分含量为24-48%；粗蛋白含量为3-6%；矿物质含量为8-10%；甘蔗糖蜜中，以干物质计，总糖量分别为70-80%，粗蛋白质6-12%；矿物质含量为10-15%。
本发明提供了含青岛假单胞菌的组合物在防治花卉细菌性病害、提高花卉植株根际土壤酶活性或提高花卉植株叶面防御酶活性中的应用。
优选地，所述花卉为非洲菊、洋桔梗、菊花、红掌中的一种或多种。
本发明提供了一种防治花卉细菌性病害的方法，将保藏编号为CCTCC NO：M2023153的青岛假单胞菌或含青岛假单胞菌的组合物施用于土壤中或喷施于叶面上。
优选地，保藏编号为CCTCC NO：M 2023153的青岛假单胞菌或上述含青岛假单胞菌的组合物的施用量以青岛假单胞菌的用量不低于1×109cfu/株/次为准，优选为1×1010-1×1012cfu/株/次，更优选为3×1010-3×1012cfu/株/次。
优选地，含青岛假单胞菌的组合物施用于土壤中或喷施于叶面上的用量可以为20-30 kg/亩/次；优选为25-30 kg/亩/次。
优选地，保藏编号为CCTCC NO：M 2023153的青岛假单胞菌或上述含青岛假单胞菌的组合物的施用频率为每茬花卉施用1-2次。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
（1）本发明提供的青岛假单胞菌（Pseudomonas qingdaonensis）是一株天然菌株，具有更好的定植能力，相比于基因工程菌株或诱导突变菌株而言，更利于发挥菌株的生防特性，从而能取得优良的病害防治效果。
（2）本发明提供的含青岛假单胞菌的组合物可以有效地调节花卉植株的代谢，并提高花卉植株中防御性酶的含量，从而可以有效地解决花卉生长中病害发生严重或者植株抗性下降等问题。此外，本发明提供的含青岛假单胞菌的组合物可以进一步提高花卉植株的系统抗性，为花卉细菌性病害的防治提供了一种新的技术方案。该方案具有很高的实用性，并且符合当前农业生产的可持续发展方向。
（3）本发明提供的含青岛假单胞菌的组合物具有原料来源来源广、成本低廉、绿色环保等特点。同时，该含青岛假单胞菌的组合物的制备方法也很简单，存储稳定性高。通过对组合物中原料种类和用量的甄选，使得加入青岛假单胞菌时的活菌数达到较高水平。
（4）本发明提供的防治花卉细菌性病害方法简单易行，不会对环境安全产生不利影响，能够促进农业生产可持续发展。
生物保藏
本发明提供的青岛假单胞菌（Pseudomonas qingdaonensis），已于2023年2月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023153。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，青岛假单胞菌YIM B08402和青岛假单胞菌CCTCC NO：M 2023153是同一菌株，其二者意义相同，其名称（编号）可以互换使用。
本发明中，“任选的”是指该成分属于非必须成分，本领域技术人员可以根据实际情况选择是否添加该成分。本发明提供的技术方案中，不添加“任选的”成分时即可实现本发明的目的（例如防治花卉细菌性病害，提高花卉植株防御性酶活性等），但是若添加该“任选的”成分，则可以进一步提高效果。
本发明的发明人在研究的过程中分离获得一株青岛假单胞菌（Pseudomonasqingdaonensis），命名为YIM B08402，于2023年2月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023153。
基于上述发现，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂含有保藏编号为CCTCC NO：M2023153的青岛假单胞菌（Pseudomonas qingdaonensis）。
本发明中，对于上述菌剂的具体剂型没有特别限制，任意本领域常用的菌剂类型均可适用于本发明。例如可以为固体菌剂、液体菌剂或是半固体（浓缩）菌剂等常见的菌剂类型。
优选地，所述菌剂中，青岛假单胞菌的含量不低于1×1010cfu/g（固体菌剂）或1×1010cfu/mL（液体菌剂或浓缩菌剂）。例如可以为1×1010-1×1011cfu/g或1×1010-1×1011cfu/mL。
本发明中，对于所述菌剂中选用的辅料及其含量没有特别限制，只要其对于青岛假单胞菌CCTCC NO：M 2023153的作用没有不利影响，或基本没有不利影响（例如加入辅料后该菌株的作用效果不低于仅采用该菌株时的80%）即可。本领域中常用于菌剂制备的辅料均可适用于本发明，例如保护剂、赋形剂、黏合剂、填充剂等。
本发明提供一种含有青岛假单胞菌的组合物，包括真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸、甘蔗糖蜜、青岛假单胞菌CCTCC NO：M 2023153（或基于该菌株制成的菌剂）。
本发明的发明人在研究中论证了，将本发明提供的含有青岛假单胞菌的组合物施用于土壤中或喷施植株叶面时能够有效促防治花卉细菌性病害，提高花卉植株根际土壤酶活性或防御性酶活性，从而促进植株生长以及提高植株的系统抗性，降低化学农药的使用量。
其中，液态组合物中，真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸、甘蔗糖蜜的重量比为1-2:1.5-2.5:0.5-1:10-15。
也即，本发明提供的液态组合物的配方为：
重量比为1-2:1.5-2.5:0.5-1:10-15的真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸、甘蔗糖蜜，以及青岛假单胞菌（菌剂）。
优选地，所述液态组合物中，真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸、甘蔗糖蜜的重量比为1-1.5:2-2.5:0.8-1.2:10-13。更优选为1-1.2:2-2.2:0.8-1:10-11。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述真菌多糖中，以干物质计，糖含量为30-50重量％，可溶性胶体含量为15-25重量％，矿物质含量为5-15重量%，粗蛋白含量为2-8重量%；。本发明对于选用的真菌多糖的具体成分和来源没有特别限制，任意具有上述特征的真菌多糖均可适用于本发明。其既可以直接通过商购获得，也可以为根据现有技术自行制备的相关产品。
本发明的发明人在研究中发现，采用赤霉酸作为增效剂应用于本发明提供的液态组合物中时，不仅防效能够得到进一步提高，而且对于作物，尤其是花卉植株的防御蛋白活性和根际土壤的酶活性也有提高的效果。此外，在含有青岛假单胞菌的液态组合物中，采用甘氨酸作为增效剂还能进一步提高组合物中的活菌数。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述青岛假单胞菌为保藏编号为CCTCC NO：M2023153的青岛假单胞菌。
优选地，以液态组合物总重量计，青岛假单胞菌的用量为0.1-1重量％。优选为0.3-0.8重量%。更优选为0.5-0.7重量%。
更优选地，所述青岛假单胞菌的用量使得液态组合物中青岛假单胞菌的含量为不低于1×106cfu/mL。优选为1×106-5×107cfu/mL。更优选为1×107-5×107cfu/mL。进一步优选为1×107-2×107cfu/mL。当在液态组合物中以固体菌剂的形式添加所述青岛假单胞菌时，按照1mL最终获得的液态组合物即为1g的比例换算添加后液态组合物中的青岛假单胞菌含量。
本发明提供了上述含有青岛假单胞菌的组合物在防治植物病害、土壤养分改良或促进植物生长中的应用。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述植物为花卉，优选非洲菊、洋桔梗、菊花或红掌中的一种或多种。
本发明中，防治病害是指降低病害的发病率，以及提高花卉植株防御性酶活性（例如提高作物中超氧化物歧化酶、多酚氧化酶和过氧化氢酶活性等）。
本发明中，土壤养分改良是指提高土壤生物学指标（例如提高土壤中的酶活性等）。
本发明提供了一种防治花卉细菌性病害的方法，所述方法包括将含有青岛假单胞菌的液态组合物施用于土壤中或喷施于叶面上。
本发明中，对于含有青岛假单胞菌的液态组合物的具体施用方式没有特别限定，任意本领域中常用的在土壤中进行施肥的方式均可适用于本发明。例如可以先将植株周围土壤刨沟后采用本发明的液态组合物进行灌根再覆土，也可直接将本发明的液态组合物浇淋在植株根际，也可以采用本发明的液态组合物进行叶面喷施。
本发明中，对于液态组合物的具体用量没有特别限制，只要能够起到降低病害的发病率，以及提高花卉植株防御性酶活性的作用即可。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述菌剂或液态组合物的施用量以青岛假单胞菌的用量不低于1×109cfu/株/次为准。优选为1×109-1×1013cfu/株/次。更优选为3×109-3×1011cfu/株/次。例如可以为3×109cfu/株/次、4×109cfu/株/次、5×109cfu/株/次、6×109cfu/株/次、8×109cfu/株/次、1×1010cfu/株/次、5×1010cfu/株/次、8×1010cfu/株/次、1×1011cfu/株/次、2×1011cfu/株/次、3×1011cfu/株/次，或者也可以为上述任意两个数值的任意中间值。青岛假单胞菌的用量为按照菌剂或液态组合物的施用量以及其中所含青岛假单胞菌数量计算获得，其中液体菌剂和液态组合物按照1g/mL进行换算。
本发明提供的真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸、甘蔗糖蜜和青岛假单胞菌共同使用时具有协同增效作用，为了获得更好的效果，可以适当提高青岛假单胞菌用量。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述液态组合物施用于土壤中或喷施于叶面上的用量可以为20-30 kg/亩/次；优选为25-30 kg/亩/次。
优选地，所述含有青岛假单胞菌的组合物的施用频率为每茬花卉施用1-2次。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
实施例1菌株的保藏
本实施例用于说明本发明提供的青岛假单胞菌YIM B08402的保藏。
已于2023年2月20日将青岛假单胞菌YIM B08402（Pseudomonas qingdaonensis）保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023153。
实施例2菌剂的制备
本实施例用于说明本发明提供的青岛假单胞菌YIM B08402菌剂的制备过程。
包括如下步骤：
（1）将上述的青岛假单胞菌在固体培养基中进行固体培养获得试管种；
步骤(1)中，所述青岛假单胞菌采用斜面接种的方式进行接种，所述固体培养在温度为25-30℃培养40-50h；所述固体培养基包括：葡萄糖10-12g/L，琼脂15-20g/L，牛肉浸膏3-5g/L，酵母浸膏1-3g/L，蛋白胨10-15g/L，pH＝6.5-7.5。
（2）制备液体种子培养基，并在其中接种试管种进行液体培养制得液体种子；
步骤(2)中，试管种接种到液体种子培养基中，所述液体培养在温度为25-30℃、转速为200-250r/min的条件下处理45-50h；所述液体种子培养基包括：蛋白胨10-15g/L，牛肉浸膏3-5g/L，氯化钠10-12g/L，pH＝6.5-7.5。
该步骤中，液体种子培养基优选在120-125℃下灭菌20-30min，冷却后在100mL液体种子培养基中接入0.5-1.5cm2的试管种，并在28-30℃下在转速为220-250r/min的摇床上培养45-50h得液体种子。
（3）配制液体发酵培养基，并在其中接种液体种子进行发酵。
步骤(3)中，液体种子在液体发酵培养基中按照体积比为0.05-0.1:1的接种量接种，并在温度为25-30℃、转速为200-250r/min的条件下处理45-50h；所述液体发酵培养基包括：蔗糖20-23g/L，蛋白胨10-15g/L，酵母浸膏5-8g/L，磷酸二氢钾3-5g/L，硫酸铵5-8g/L，碳酸钙2-4g/L，pH＝6.5-7.5。
该步骤中，液体发酵培养基优选在120-125℃灭菌20-30min，冷却后接种液体种子，并优选在28-30℃下于转速为220-250r/min的摇床上培养45-50h制得发酵液。
此外，制备步骤还包括：
培养结束后采用适量新鲜NB培养基将获得的培养液进行稀释，获得活菌数约为2×1010cfu/mL的青岛假单胞菌液体菌剂。将液体菌剂干燥处理获得干粉菌剂，活菌数约为2×1010cfu/g。
实施例3液体组合物的制备
本实施例用于说明本发明提供的液态组合物的制备过程。
液态组合物的配方详见表2，其中真菌多糖、甘蔗糖蜜的物料成分检测结果详见表1(其中水含量以物料总重量为基准计算，其余成分以物料中干物质为基准计算)。真菌多糖中的糖含量采用硫酸苯酚法测定，可溶性胶体含量采用3,5-二甲基苯酚比色法测定，矿物质含量采用原子吸收分光光度法测定，粗蛋白含量采用凯式定氮法测定。菌剂由实施例2制备得到。真菌多糖购自西安万方生物科技有限公司，甘氨酸购自广州广裕生物科技有限公司，赤霉酸购自上海富氏达生物科技有限公司，甘蔗糖蜜购自柳州市金黔湾糖蜜有限公司。
液态组合物的具体配制方法：按照表2中的比例称取原料，1 L/kg加水，混合均匀即获得液态组合物。
表1液态组合物物料成分
表2 液态组合物配方
实施例4青岛假单胞菌、含有该菌的菌剂和液态组合物对花卉植物的施用效果
本实施例用于说明本发明提供的青岛假单胞菌YIM B08402、含有该菌的菌剂和液态组合物对花卉植物的施用效果。
（1）本实施例采用的液态组合物由实施例3制备得到，按照表3中的用量，将实施例3制备得到的液态组合物施用于花卉植株根际土壤中或喷施于花卉植株叶面，然后在其他条件均保持一致的情况下同时进行培养。具体施肥方式：将液态组合物对花卉进行四周灌根处理后，再覆土，完成施肥；将液态组合物喷施于植株叶面。每茬花卉施用1-2次，用量为25-30 kg/亩/次，使得青岛假单胞菌的用量不低于1×109cfu/株/次为准，优选为1×1010-1×1012cfu/株/次，更优选为3×1010-3×1012cfu/株/次；青岛假单胞菌、菌剂或液态组合物的施用频率为每茬花卉施用1-2次。
（2）采用实施例2制备得到的液态菌剂或干粉菌剂，按实施例4中（1）的方法施用于花卉植株根际土壤中或喷施于花卉植株叶面，记为D7。
施肥后，于花卉采收期采集花卉根际土壤以及采集花卉植株。具体测量各组花卉根际土壤的纤维素酶（S-CL）、过氧化氢酶（CAT）、脲酶（S-UE）和蔗糖酶（S-SC）；以及测量花卉植株叶片的超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、和过氧化氢酶（CAT）。
植株根际土壤酶活性的测定方法：
纤维素酶（S-CL）（mg 10g-172h-1）、过氧化氢酶（CAT）（mg H2O2g-120min-1）、脲酶（S-UE）（mg g-1d-1）、蔗糖酶（S-SC）（mg g-1d-1）均使用试剂盒进行测定，试剂盒购自苏州格锐思生物技术有限公司，使用方法参照说明书。
植株叶面防御酶活性的测定方法：
超氧化物歧化酶（SOD）（U g-1）、多酚氧化酶（PPO）（U g-1）、和过氧化氢酶（CAT）（nmol min-1g-1）均使用试剂盒进行测定，试剂盒购自苏州格锐思生物技术有限公司，使用方法参照说明书。
从表3、4、5中的数据可以看出，施用本发明提供的液态组合物的情况下，对花卉病害的防控作用以及对花卉植株根际土壤酶活性和花卉植株防御酶活性的提高效果强于对照，当施用的液态组合物采用本发明的优选组分且其中各组分的含量比在本发明优选范围内时，效果进一步得到提高。
表3青岛假单胞菌及液态组合物对花卉病害防控试验测试条件及结果
表4 青岛假单胞菌及液态组合物浇淋施用对洋桔梗和菊花根际土壤酶活性
表5 青岛假单胞菌及液态组合物浇淋施用对洋桔梗和菊花叶面防御酶活性的影响
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种含青岛假单胞菌的组合物，其特征在于，包括真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸、甘蔗糖蜜、青岛假单胞菌；所述青岛假单胞菌为保藏编号为 CCTCC NO：M 2023153 的青岛假单胞菌（Pseudomonas qingdaonensis），于2023年2月20日保藏于中国典型培养物保藏中心；以液态组合物的总重量计，青岛假单胞菌的用量为0.1-1重量％；青岛假单胞菌在该液态组合物中的含量不低于1×108 cfu/mL；真菌多糖、甘氨酸、赤霉酸和甘蔗糖蜜的重量比为（1-2）:（1.5-2.5）:（0.5-1）:（10-15）。
2.如权利要求1所述的含青岛假单胞菌的组合物，其特征在于，所述真菌多糖中水分含量为20-40重量％；所述真菌多糖中，以干物质计，糖含量为30-50重量％，可溶性胶体含量为15-25重量％，矿物质含量为5-15重量%，粗蛋白含量为2-8重量%；和/或，所述甘蔗糖蜜中，水分含量为25-35%；糖分含量为24-48%；粗蛋白含量为3-6%；矿物质含量为8-10%；所述甘蔗糖蜜中，以干物质计，总糖量分别为70-80%，粗蛋白质6-12%；矿物质含量为10-15%。
3.如权利要求1-2任一项所述的含青岛假单胞菌的组合物在防治花卉细菌性病害、提高花卉植株根际土壤酶活性或提高花卉植株叶面防御酶活性中的应用。
4.如权利要求3所述含青岛假单胞菌的组合物在防治花卉细菌性病害、提高花卉植株根际土壤酶活性或提高花卉植株叶面防御酶活性中的应用，其特征在于，所述花卉植株为非洲菊、洋桔梗、菊花、红掌中的一种或多种。
5.一种防治花卉细菌性病害的方法，其特征在于，将权利要求1-2任一项所述的含青岛假单胞菌的组合物施用于土壤中或喷施于植株叶面，用量为20-30 kg/亩/次。
6.如权利要求5所述的防治花卉细菌性病害的方法，其特征在于，所述含青岛假单胞菌的组合物的施用量以青岛假单胞菌的用量不低于1×109 cfu/株/次为准；含青岛假单胞菌的组合物的施用频率为每茬花卉施用1-2次。
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