CN109749940B - 一种真菌菌剂的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种真菌菌剂的制备方法及其产品和应用，属于微生物技术领域。本发明所述制备方法包括如下步骤：①菌株液体培养，得到培养液；②将所述培养液与辅料混合，得到混合料；③对所述混合料进行通气搅拌，成型；所述辅料包括海藻酸钠和聚乙烯醇；所述海藻酸钠的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为1‰～1％；所述聚乙烯醇的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为8‰～2.5％。本发明提供的制备方法能有效提高生防菌体在菌剂中以及施用后在土壤中的存活率，刺激菌株萌发和生长，有效保证了菌株在土壤中或防治环境中的活菌体数量，避免防效减弱或丧失。

Description

一种真菌菌剂的制备方法及其产品和应用

技术领域

本发明属于微生物生防制剂技术领域，具体涉及一种真菌菌剂的制备方法及其产品和应用。

背景技术

植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类就达70多种，为害3000多种植物，每年造成巨大的损失。我国植物寄生线虫主要危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等经济作物，造成的损失十分惊人。据不完全统计，线虫病害使我国各种作物年平均产量损失达10～15％，全球每年因线虫造成的损失达1500亿美元(Weischer,2010)。

目前线虫的防治主要依靠化学杀线虫剂，但化学杀线虫剂多为灭生性巨毒农药，化学杀线虫剂在防治线虫危害，保障农业生产的同时，给人类健康和环境带来了严重的负面影响。目前国内使用的化学杀线虫剂主要为国外进口产品，价格过于昂贵。因此，线虫生防制剂显得尤为重要。线虫生防制剂早在上个世纪70年代就已上市。但经过几十年的发展，到今天其使用和推广仍不广泛，许多在室内试验中对线虫表现出很强作用的菌株在实际应用中的效果不理想。

在田间，生防菌的防治效果会受各种外部因素的影响。土壤中丰富的微生物间既互相依存，又相互制约，这些关系维持了土壤中微生物数量和比例的平衡，从而为作物的根系及作物的生长提供了良好的生态环境。外源生防菌与植物根围及内部定殖的其它微生物之间存在必然的竞争、拮抗或者互利等关系，这种相互关系也在影响生防菌在土壤中的定殖情况。同时生防菌剂在土壤中的存活、定殖、扩散还受到土壤环境(有机质含量、湿度、温度等)等的影响。此外，土壤中残留的化学农药，土壤中存在的一些金属离子也将影响到生防菌剂在土壤中的存活、定殖以及对线虫的防治效果。其他影响生防菌生存定殖的非生物学因素还有土壤温度、土壤水分含量、土壤中无机离子含量等。这些因素一方面可以影响植物的生长与发育，改变根分泌物的质量，进而影响微生物在根部的定殖，另一方面对生防菌与土著微生物的繁殖产生直接影响。

生物学因素方面，生防菌的接种量是一个重要的因素。然而，提高接种量虽然能够提高根际生防菌数，但未必能提高菌剂在根部的定殖水平，并且可能会因生防菌代谢形成的某些有害成分过多抑制作物生长，或者由于生防菌数量过大破坏作物根际土壤中微生物的正常平衡，导致生防菌的防效下降。同时，这种方法也提高了处理成本。因此，生防菌的接入量必须控制在一个适宜水平。另外，由于植物根系分泌物中含有和大量低分子量有机酸，如乳酸、苹果酸、草酸等，一定程度上影响了生防菌的存活生长。

适宜的方法和剂型能有效保持生防菌的最大存活率、在应用中的最大萌发率及对环境因素的最大抗性。许多生防活菌剂由于剂型不适宜，还没有施到土壤中就难以从中检测到活的菌体，因此防效难以体现。因此，提供一种能有效避免和克服外部因素对生防菌影响，保持生防菌防效的方法显得尤为重要。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种真菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

①菌株液体培养，得到培养液；

②将步骤①所述培养液与辅料混合，得到混合料；

③对步骤②所述混合料进行通气搅拌，成型；

所述辅料包括菌体保护剂；

所述菌体保护剂包括海藻酸钠和聚乙烯醇；

所述海藻酸钠的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为1‰～1％；

所述聚乙烯醇的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为8‰～2.5％。

优选的，所述步骤③通气搅拌中通入的气体的体积与混合料的体积之比为1：0.6～1：1.5。

优选的，所述步骤③通气搅拌的搅拌速率为65～150r/min；搅拌时间为30～50min。

优选的，在所述通气搅拌后，还包括将搅拌后的混合料与营养剂混合的步骤。

优选的，所述营养剂包括玉米粉、豆饼粉、油菜籽饼粉、玉米芯颗粒、蟹壳粉和虾壳粉中的一种或多种；所述营养剂的质量占真菌菌剂质量的百分含量为1％～3.5％。

优选的，所述营养剂的粒径为10～80目。

优选的，所述菌株为生防菌菌株。

优选的，所述菌株的类型包括木霉、厚垣孢轮枝孢、淡紫拟青霉、被毛孢、粉红粘帚霉、曲霉、弯孢霉、节丛孢、隔指孢中的一种或多种。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的真菌菌剂，所述真菌菌剂中的孢子数不低于1.5亿/克。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的真菌菌剂在生物防治中的应用。

有益效果：本发明提供了一种真菌菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：①菌株液体培养，得到培养液；②将步骤①所述培养液与辅料混合，得到混合料；③对步骤②所述混合料进行通气搅拌，成型；所述辅料包括海藻酸钠和聚乙烯醇；所述海藻酸钠的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为1‰～1％；所述聚乙烯醇的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为8‰～2.5％。本发明在菌剂制备过程中添加菌株保护剂，使制得的真菌菌剂能够更好的保持真菌的活性，延长了菌剂的保存时间，有效提高生防菌体在菌剂中以及施用后在土壤中的存活率。本发明还通过添加利于真菌在土壤中萌发的营养刺激因素，刺激菌株萌发、生长，增强菌体对应用环境的抗性，从而使真菌在应用环境中最大程度地存活、生长，有效保证了菌株在土壤中或防治环境中的活菌体数量，最终避免防效减弱或丧失，有效保持了真菌菌株应有的生防效果。

本发明实施简单、成本低廉、易于操作。本发明还提供了上述制备方法制备得到的真菌菌剂在生防中的应用，防效明显。

生物保藏说明：

厚垣孢轮枝孢(Verticillium chlamydosporium)于1999年09月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCCNo.0418；

木霉(Trichoderma aquatilis)，于2017年07月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.14143；

黑曲霉(Aspergillus niger)，于2015年09月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.11340。

具体实施方式

本发明提供了一种真菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

①菌株液体培养，得到培养液；

②将步骤①所述培养液与辅料混合，得到混合料；

③对步骤②所述混合料进行通气搅拌，成型；

所述辅料包括菌体保护剂；

所述菌体保护剂包括海藻酸钠和聚乙烯醇；

所述海藻酸钠的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为1‰～1％；

所述聚乙烯醇的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为8‰～2.5％。

本发明先对菌株进行液体培养，得到培养液。在本发明中，所述菌株优选为生防菌菌株。所述菌株的类型优选包括包括木霉(Trichoderma)、厚垣孢轮枝孢(Verticilliumchlamydosporium)、淡紫拟青霉(penicillium lilac)、被毛孢(Trichosporites)、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)、曲霉(Aspergillus)、弯孢霉(Curvularia sp)、节丛孢(Arthrobotrys)、隔指孢(Dactylella)中的一种或多种，更优选包括厚垣孢轮枝孢和/或淡紫拟青霉。本发明对所述液体培养的方法不作特别限定，本领域根据不同菌株类型所采取的常规培养方法均可。

液体培养后得到培养液。本发明将所述培养液与辅料混合，得到混合料。在本发明中，所述辅料包括菌体保护剂；所述菌体保护剂包括海藻酸钠和聚乙烯醇；所述海藻酸钠的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为1‰～1％，优选为3‰～5‰，更优选为4‰；所述聚乙烯醇的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为8‰～2.5％，优选为1～1.4％，更优选为1.2％。在本发明中，所述海藻酸钠和聚乙烯醇能对菌体产生包裹，进而提高菌体在菌剂中以及施用后在土壤中的存活率，有效保证菌株在土壤中或防治环境中的活菌体数量。

得到混合料后，本发明对所述混合料进行通气搅拌。在本发明中，所述通气搅拌中通气的体积与混合料的体积之比优选为1：0.6～1：1.5，更优选为1：0.8。所述通气搅拌的搅拌速率优选为65～150r/min，更优选为80～130r/min；搅拌时间优选为30～50min，更优选为40min。所述通气搅拌有利于菌体保护剂包裹菌体时，保持菌体透气。

本发明在所述通气搅拌后，优选还包括将搅拌后的混合料与营养剂混合。在本发明中，所述营养剂优选包括玉米粉、豆饼粉、油菜籽饼粉、玉米芯颗粒、蟹壳粉和虾壳粉中的一种或多种；更优选包括玉米粉。所述营养剂的质量占真菌菌剂质量的百分含量优选为1％～3.5％，更优选为2.5％。所述营养剂的粒径优选为10～80目，更优选为20～60目，更优选为45目。在本发明中，所述营养剂能提高菌株在防治环境中的萌发率及生长，有效保证菌株在防治环境中的正常生长。

本发明提供了上述制备方法制备得到的真菌菌剂。在本发明中，所述真菌菌剂中的孢子数优选不低于1.5亿/克，更优选为1.5-6亿/克，更优选为2.5-4亿/克。所述真菌菌剂相较于常规方法制备得到的菌剂能够更好的保持真菌活性，延长真菌保存期。

本发明还提供了上述制备方法制备得到的真菌菌剂在生防中的应用。在本发明中，所述应用相较于常规方法制备得到的菌剂具有更高的真菌萌发率，更强的不良环境抗性。菌体在应用环境中能最大程度的存活、生长，最终保持应有的防控效果。

下面结合实施例对本发明提供的一种真菌菌剂的制备方法及其产品和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)斜面种子培养：将本实验室自主分离得到的生防菌株厚垣孢轮枝孢(Verticillium chlamdosporium，中国微生物菌种保藏中心，保藏登记号为CGMCCNO.0418，专利公开号：CN99117391.0)转接到改良PDA固体培养基(PDA+2％蔗糖+1％麸皮+0.3％甘油)斜面上，28℃培养4天，获得斜面种子；

(2)液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的液体改良PDA培养基(不加琼脂的PDA培养基)中，28℃摇床培养，摇床转速为150r/min，培养3天，获得液体种子；

(3)发酵罐大量培养：将液体种子按3％(V/V)的比例接入发酵罐中的改良PDA液体培养基中，于发酵罐中发酵培养；培养温度30℃，搅拌速度200rpm，发酵4天，发酵过程中持续通入无菌压缩空气，通气气液比为1:0.8；

(4)在培养好的菌体培养液中加入1％培养液质量的甘油和1.5％培养液质量的磷酸二氢钾，另外还需要加入已经完全溶解并降温至30℃，1‰培养液质量的海藻酸钠和8‰培养液质量的聚乙烯醇，180rpm搅拌混匀，搅拌时间30min。

(5)在搅拌过程的同时持续通入洁净空气，通气的气液比为1:0.6，按培养液体积计算通气量比，通气时间与搅拌时间等同；

(6)颗粒剂的制备：在上述液体中加入1.2倍培养液质量的草炭，另外还需要加入粒径为16目粉状，1％菌剂质量(以草炭量来计算)的玉米粉，充分混匀后在60℃条件下烘干至水分含量小于15％，即制成厚垣孢轮枝菌生防颗粒剂。

土壤盆栽试验测算防效，步骤如下：

将5克厚垣孢轮枝菌生防颗粒剂与50克10目的细土混匀。将待移栽花盆中的土挖一个直径5-10厘米，深5-8厘米的穴，在穴中撒入真菌菌剂与细土的混匀物后，与穴周边的土混合，混合范围以穴中心8-15厘米范围，将长出2片真叶的蕃茄幼苗移栽入穴中，浇适量的水，对照每株不施用菌剂。移栽10天后，每株接种600条根结线虫，每个处理20株，重复3次。接种45天后，统计蕃茄根结数量，计算真菌菌剂对蕃茄根结线虫的防效。计算公式如下：

结果表明：实施例1制得的厚垣孢轮枝菌生防颗粒剂对线虫的防效为84.1％。

对比例1

与实施例1不同之处：不添加海藻酸钠、聚乙烯醇、玉米粉；搅拌时间为30min；搅拌过程不通入洁净空气。该方法制备得到的剂型为厚垣孢轮枝孢常规剂型，用作实施例1的对照。

经土壤盆栽试验，对比例1制得的常规剂型对线虫的防效为70％。说明实施例1提供的剂型相比常规剂型对线虫的防效提高了20％。

实施例2

与实施例1不同之处：海藻酸钠的添加量为5‰培养液质量，聚乙烯醇的添加量为1.5％培养液质量，玉米粉的粒径为30目，添加量为2％菌剂质量(以草炭量来计算)。搅拌时间为40min，洁净空气通气量比为1:1.0。

剂型经土壤盆栽试验，防效为78.4％；与不添加海藻酸钠、聚乙烯醇、玉米粉的常规剂型相比提高了12％。

实施例3

与实施例1不同之处：海藻酸钠的添加量为1％培养液质量，聚乙烯醇的添加量为2.5％培养液质量，玉米粉的粒径为80目，添加量为3.5％菌剂质量(以草炭量来计算)。搅拌时间为50min，洁净空气通气量比为1:1.5。

剂型经土壤盆栽试验，防效为81.9％；与不添加海藻酸钠、聚乙烯醇、玉米粉的常规剂型相比提高了17％。

实施例4

一种生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)斜面种子培养：将本实验室自主分离获得的生防菌株木霉(保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC 14143)转接到改良PDA(PDA+1％蔗糖+0.3％硫酸镁+0.1％磷酸氢二钾)固体培养基斜面上，在28℃培养5天，获得斜面种子；

(2)液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的液体改良PDA培养基(不加琼脂的改良PDA)中，在28℃摇床培养，摇床转速为200r/min，培养2天，获得液体种子；

(3)发酵罐大量培养：将液体种子按4％(V/V)的比例接入发酵罐中的改良PDA液体培养基中于发酵罐中发酵培养；培养温度31℃，搅拌速度180rpm，发酵时间5天，发酵过程中持续通入无菌压缩空气，通气气液比为1:0.8；

(4)在培养好的菌体培养液中加入0.8％培养液质量的甘油，同时加入2％培养液质量的磷酸二氢钾，另外还需要加入已经完全溶解并降温至31℃，1‰培养液质量的海藻酸钠和8‰培养液质量聚乙烯醇，180rpm搅拌混匀，搅拌时间30min。

(5)在搅拌过程的同时，持续通入洁净空气，通气的气液比为1:0.6，按培养液体积计算通气量比，通气时间与搅拌时间等同；

(6)颗粒剂的制备：在上述液体中加入1.2倍培养液质量的秸秆粉，另外还需要加入粒径为16目粉状，1％菌剂质量(以秸秆粉量来计算)的玉米粉，充分混匀后自然晒干至水分含量小于15％，即制成木霉的生防菌颗粒剂。

最后，剂型经土壤盆栽试验测定，对线虫的防效为77％；与不添加海藻酸钠、聚乙烯醇、玉米粉防效为67％的常规剂型相比，本发明提供的剂型对线虫的防效提高了15％。

实施例5：

一种生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)斜面种子培养：将本实验室自主分离得到的生防菌株黑曲霉(保藏于武汉中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC11340。)转接到PDA固体培养基斜面上，在28℃培养3天，以该菌株菌丝长满斜面为终止培养的时间条件，获得斜面种子；

(2)液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的液体PDA培养基中，在28℃摇床培养，摇床转速为150r/min，培养2天，获得液体种子；

(3)发酵罐大量培养：将液体种子按2％(V/V)的比例接入发酵罐中的PDA液体培养基中于发酵罐中发酵培养；培养温度29℃，搅拌速度150rpm，发酵时间6天，发酵过程中持续通入无菌压缩空气，通气气液比为1:0.6；

(4)在培养好的菌体培养液中加入1.5％培养液质量的磷酸二氢钾，另外还需要加入已经完全溶解并降温至29℃，1‰培养液质量的海藻酸钠和8‰培养液质量聚乙烯醇，150rpm搅拌混匀，搅拌时间30min。

(5)在搅拌过程的同时，持续通入洁净空气，通气的气液比为1:0.6，按培养液体积计算通气量比，通气时间与搅拌时间等同；

(6)颗粒剂的制备：在上述液体中加入1.2倍培养液质量的草炭，另外还需要加入粒径为16目粉状，1％菌剂质量(以草炭量来计算)的玉米粉，充分混匀后用在58℃条件下烘干至水分含量小于15％，即制成淡紫拟青霉菌的生防菌颗粒剂。

最后，剂型经土壤盆栽试验测定，对线虫的防效为90％；与不添加海藻酸钠、聚乙烯醇、玉米粉防效为78％的常规剂型相比，本发明提供的剂型对线虫的防效提高了15％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种真菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：

①菌株液体培养，得到培养液；

②将步骤①所述培养液与辅料混合，得到混合料；

③对步骤②所述混合料进行通气搅拌，成型；

其特征在于，所述辅料包括菌体保护剂；

所述菌体保护剂包括海藻酸钠和聚乙烯醇；

所述海藻酸钠的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为1‰～1％；

所述聚乙烯醇的质量占步骤①所述培养液质量的百分含量为8‰～2.5％；

所述步骤③通气搅拌中通入的气体的体积与混合料的体积之比为1:0.6～1:1.5；

所述步骤③通气搅拌的搅拌速率为65～150r/min；搅拌时间为30～50min；

在所述通气搅拌后，还包括将搅拌后的混合料与营养剂混合；

所述营养剂包括玉米粉、豆饼粉、油菜籽饼粉、玉米芯颗粒、蟹壳粉和虾壳粉中的一种或多种；所述营养剂的质量占真菌菌剂质量的百分含量为1％～3.5％。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述营养剂的粒径为10～80目。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌株为生防菌菌株。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述菌株的类型包括木霉、厚垣孢轮枝孢、淡紫拟青霉、被毛孢、粉红粘帚霉、曲霉、弯孢霉、节丛孢、隔指孢中的一种或多种。

5.权利要求1～4任意一项所述制备方法制备得到的真菌菌剂，其特征在于，所述真菌菌剂中的孢子数不低于1.5亿/克。

6.权利要求3或4所述制备方法制备得到的真菌菌剂在生物防治中的应用。