CN101502271B - 一种防治害虫的真菌颗粒剂的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备昆虫病原真菌海藻酸钠颗粒剂的方法和通过该方法制备得到的颗粒剂。与现有技术相比，本发明不仅保持了藻胶粒持久不散和粒内真菌恢复生长的有优点，还在其它方面有所创新和完善。这种含有活真菌的藻胶粒用于投撒到农田或林间防治害虫。

Description

一种防治害虫的真菌颗粒剂的制造方法

技术领域

本发明涉及一种制造生产微生物制剂的方法和通过该方法制备得到的微生物制剂。

背景技术

利用昆虫病原真菌防治农林害虫被广泛研究和讨论。至今，全球有包括球孢白僵菌、金龟子绿僵菌、蜡蚧轮枝孢、汤姆逊被毛孢等多种昆虫病原真菌被作为生物农药用于几十种害虫的防治，包括鳞翅目、鞘翅目、直翅目、同翅目等科目的昆虫及螨虫。有的已经开发成生物农药制剂在不同国家获得农药注册登记和被FAO推荐使用，在保护植物、减少化学农药使用、维护生态平衡方面起积极作用。

将昆虫病原真菌制成一定形式的制剂，是使其能够在农林田间有效发挥防治害虫作用的关键。因为昆虫病原真菌被投放到田间后，会遭到多种不利环境因子的损害，如紫外线辐射、高温、干旱、环境微生物侵袭和营养竞争等，因此要设法保护昆虫病原真菌的存活能力并促进其生长繁殖和田间定植。

已有研究和存在问题：根据植物生长特点和环境以及施菌操作要求，一般将昆虫病原真菌制成粉剂、粒剂、液剂，可分别用于投撒、喷洒、喷雾等操作。在粒剂中，有不同的成粒原理和成粒方法，常见的为挤压造粒法，即以粘性土或非粘性材质添加粘合剂，通过机械挤压成粒。此法的优点是简单、成本低、程序通用，主要缺点是不易掌握颗粒的紧密度，多数情况是过紧，不利于其中的真菌存活和生长；有时是过松，颗粒在运输、贮存过程中或在投撒操作时散裂。有的颗粒剂遇水或遇雨立即松散或崩解，使其中的真菌被直接暴露于环境，遭到各种不利因素侵袭，损失大，不利于繁殖和定植，不能达到有效防治害虫的预期目的。

利用海藻酸钠制成昆虫病原真菌颗粒剂可以较好地克服上述不足。其基本原理是：海藻酸钠(sodium alginate)是一种从海藻中提取的亲水性胶态多聚糖，稳定、无毒，与生物和生物制品相容性好，当遇钙或其他一些多价阳离子可固化成型，是常用的囊材或载体材料，多用于酶的固定化和药物的缓释处理。例如郁建平等(2003)、张富新等(2005)分别报道了海藻酸钠固定化多酚氧化酶用于红酚的合成和海藻酸钠固定化中性蛋白酶的方法和效果；李宝红等(2001)介绍了用作医疗药剂缓释新辅料的海藻酸钠和海藻酸钙的特点和应用。也有以海藻酸钠固定微生物细胞用于特定环境处理的，例如李辉华等(2001)、李超敏等(2006)分别报道了以海藻酸钠固定微生物用于污水处理、固定根瘤菌和光合细菌作为生物肥料的技术方法。

US Patent 4724147公开了一种用于防治(植物)土生病害的真菌颗粒制造方法。其方法要点是将所选择的真菌培养足够时间，收获菌丝体并分散均匀，然后用海藻酸钠溶液稀释，将菌丝体与海藻酸钠混合物滴加到氯化钙或葡萄糖酸钙溶液中，完成制粒。之后将此含有活真菌的藻胶粒干燥，用于接种农田中使植物的土生病菌被侵染。

US Patent 4718935公开了一种包含真菌除草剂的颗粒的制造方法。该方法在的要点在于将所选择的真菌接种培养足够时间，收获真菌培养物，并均质化约30秒，然后用1.33％(w/v)的海藻酸钠溶液按大约1∶3(v/v)比例稀释，然后滴加到0.25M的CaCl₂水溶液形成颗粒，所得藻胶粒直径约3-5mm，经干燥后接种到农田中用于杀死所选定的杂草。

现有技术制备的颗粒剂的优点是能够保持粒型持久不散，同时粒内真菌在适宜条件下能够恢复生长，但仍存在以下不足：1)所用的真菌培养物为菌丝体，为液体发酵直接获得，单位体积中的生物量通常有较大变化，所提供的方法是按一定体积比与海藻酸钠混合，因此每次制备的颗粒剂的实际含菌量难以准确计算；2)所用的真菌培养物为菌丝体，在颗粒剂的干燥和贮存过程中比较容易失活；3)由于不添加载体物，直接将菌体与海藻酸钠的混合物滴加到CaCl₂水溶液中，形成的颗粒在干燥后通常不再呈球形，而是呈扁饼或薄片状，不利于投撒施用；4)按现有技术方法制备的颗粒剂中含菌量较高，而恢复生长的成菌落数并不高，即单位菌量生长的菌落数较低，用于田间控制病害或杂草的用量和成本相对较高；5)海藻酸钠可以被环境中微生物分解利用，按现有技术方法制备的颗粒剂在贮存和投撒到田间后，容易较快地被环境微生物污染，直接影响颗粒内有益真菌的生长及其对目标病菌或杂草的侵染作用。

发明内容

本发明涉及一种通过以下方法获得的胶体颗粒：(1)以海藻酸钠包裹昆虫病原真菌形成颗粒剂，用于防治农林害虫。(2)所用昆虫病原真菌经固相基质上发酵培养，形成孢子。(3)在海藻酸钠包裹前，以矿物载体吸附虫生真菌孢子，并添加一定量营养物。(4)将上述虫生真菌-矿物载体-营养物混合均匀，加入到海藻酸钠中，分散均匀，滴加到含多价阳离子的溶液中固化成胶粒。(5)在藻胶粒形成后，以海藻酸钠-聚乙烯醇复合包覆形成保护膜。(6)以添加抗菌防腐剂溶液洗涤颗粒外表，干燥后封装。

此外，本发明提供了一种制备昆虫病原真菌海藻酸钠颗粒剂的方法，该方法包括以下步骤：

(1)对选定的昆虫病原真菌进行生物发酵培养，获得干燥均匀的分生孢子粉；

(2)将孢子粉与载体物、营养物混合均匀，形成混合物I；

(3)将混合物I与海藻酸钠水溶液混合均匀，形成混合物II；

(4)将混合物II滴加到氯化钙水溶液中，固化形成颗粒；

(5)将颗粒移出，转投到海藻酸钠与聚乙烯醇混合的水溶液中，几分钟后再移出转到含有氯化钙、饱和硼酸水溶液中，在颗粒上形成外膜；

(6)移出颗粒，分别用灭菌水和含苯甲酸钠或水杨酸钠的灭菌水溶液漂洗，沥干水分，干燥，得到颗粒剂。

在进一步的实施方案中，优选在步骤2)中，优选载体物是有粘性或无粘性的无机矿粉，营养物优选是谷物粉，孢子粉与载体物、营养物的预混比例优选为2～20∶70～96∶2～10(w∶w∶w)。更优选载体物是硅藻土、白炭黑、凹凸棒土或者高岭土，更优选营养物是可溶性淀粉、普通淀粉、米粉或者玉米粉。

在上述实施方案中，优选步骤3)中的海藻酸钠水溶液浓度为1～5％(w∶v)，混合物I与海藻酸钠水溶液的比例是5～40∶100(w∶v)。

在上述实施方案中，优选步骤4)中使用滴管、注射器或至少有1个漏孔使溶液可以滴落的容器进行滴加。

在上述实施方案中，优选步骤4)中的氯化钙水溶液的浓度为0.2～0.3M，将混合物II滴加到氯化钙水溶液中的固化反应时间为15～30分钟。

在上述实施方案中，优选在步骤5)中，海藻酸钠与聚乙烯醇混合水溶液中海藻酸钠终浓度为1～5％(w∶v)、聚乙烯醇的终浓度为5～8％(w∶v)，氯化钙、硼酸的混合水溶液中氯化钙终浓度为0.2～0.3M、硼酸为饱和浓度，成膜反应时间为5～10分钟。

本发明与现有技术相比，不仅保持了藻胶粒持久不散和粒内真菌恢复生长的有优点，还在以下方面有所创新和完善：1)所用的真菌培养物为孢子粉，由固相基质上培养而获得，孢子粉容易分散，并可采用显微计数方法准确测量和计算得到单位重量中孢子数，因此推算每次制备的颗粒剂中的实际含菌量；2)所用的真菌培养物为孢子粉，从生物学特性上，孢子是真菌生活史中抗逆性最强的阶段，因此在颗粒剂的干燥和贮存过程中比现有技术所用的菌丝体更好地保持生物活性；3)在用藻胶包裹前添加载体物和营养物，使藻胶粒形成时内部有一个支撑核，颗粒在干燥后能够保持球形或近球形，利于田间投撒施用，同时添加的营养物为粒内真菌的恢复生长提供了基础营养，利于真菌保持活力和促进其恢复生长；4)由于孢子粉容易分散，而且粒内包含有一定量的营养物，可以将颗粒中的含菌量适当降低，而恢复生长后仍能够生成较高的成菌落数，即提高了单位菌量生长的菌落数，从而降低田间控制目标害虫的用量和应用成本；5)以海藻酸钠-聚乙烯醇复合包覆形成颗粒剂的外层保护膜，并最后以添加抗菌防腐剂溶液洗涤颗粒外表，能够有效阻隔和抑制环境微生物污染，利于颗粒内有益真菌的生长及其对目标害虫的侵染控制。

附图说明

图1a和图1b分别是根据本发明方法和现有技术方法制造的球孢白僵菌颗粒剂的颗粒形态比较；

图2是按照效果实施例4形成的分生孢子；

图3是按照效果实施例5，绿僵菌侵染杀死的金龟子幼虫；

图4是按照效果实施例6，蜡蚧轮枝孢侵染杀死的蚜虫。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明实施例的制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1

1)在马铃薯葡萄糖培养基琼脂上培养金龟子绿僵菌，获得干燥均匀的绿僵菌分生孢子粉。

2)分别称取孢子粉5g、硅藻土85g、玉米粉10g，预混均匀，形成混合物I；

3)将混合物I加入到400mL 2％(w∶v)的海藻酸钠水溶液中，混合均匀，形成混合物II；

4)用注射器将混合物II滴加到0.25M的氯化钙水溶液中，固化反应放置15分钟，间或缓慢摇动几次；

5)将颗粒移出，转投到2％(w∶v)海藻酸钠与6％(w∶v)聚乙烯醇混合的水溶液中，几分钟后再移出转到含有0.25M氯化钙和饱和硼酸的混合水溶液中，静置5分钟；

6)将颗粒移出，分别用灭菌水漂洗1次，再用和1％(w∶v)苯甲酸钠的灭菌水溶液漂洗1次，移出沥干，室温风干20小时，得到颗粒剂，密封包装保存。

实施例2

1)在麦麸秸秆粉培养基上培养球孢白僵菌，经分离去杂获得干燥均匀的白僵菌分生孢子粉；

2)称取孢子粉10g、凹凸棒土88g、米粉2g，预混均匀，形成混合物I；

3)将混合物I加入到400mL 1％(w∶v)的海藻酸钠水溶液中，混合均匀，形成混合物II；

4)用带控制滴头的漏斗将混合物II滴加到0.28M的氯化钙水溶液中，固化反应放置20分钟，间或轻轻摇动几次；

5)将颗粒移出，转投到1％(w∶v)海藻酸钠与5％(w∶v)聚乙烯醇混合的水溶液中，几分钟后再移出转到含有0.28M氯化钙和饱和硼酸的混合水溶液中，静置5分钟；

6)将颗粒移出，分别用灭菌水漂洗1次，再用和1％(w∶v)水杨酸钠的灭菌水溶液漂洗1次，移出沥干，负压抽干，得到颗粒剂，密封包装保存。

实施例3：

1)在大米粒培养基上培养蜡蚧轮枝孢，经分离去杂获得干燥均匀的蜡蚧轮枝孢的分生孢子粉；

2)称取孢子粉10g、凹凸棒土80g、可溶性淀粉10g，预混均匀，形成混合物I；

3)将混合物I加入到250mL 1％(w ∶v)的海藻酸钠水溶液中，混合均匀，形成混合物II；

4)用可加压的滴管将混合物II滴加到0.25M的氯化钙水溶液中，固化反应放置30分钟，间或轻轻摇动几次；

5)将颗粒移出，转投到1.5％(w∶v)海藻酸钠与3.5％(w∶v)聚乙烯醇混合的水溶液中，几分钟后再移出转到含有0.25M氯化钙和饱和硼酸的混合水溶液中，静置10分钟；

6)将颗粒移出，分别用灭菌水漂洗1次，再用和1％(w∶v)水杨酸钠的灭菌水溶液漂洗1次，移出沥干，冷冻干燥，得到颗粒剂，密封包装保存。

实施例4

1)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上接种培养球孢白僵菌，获得干燥均匀的白僵菌分生孢子粉。

2)称取1.92g孢子粉与16.58g硅藻土、1.5g玉米粉预混均匀，得到20g混合物I；

3)将混合物I加入到300mL 1.5％(w∶v)的海藻酸钠水溶液中混合均匀，形成混合物II；

4)将混合物II滴加到0.25M的氯化钙水溶液中，固化形成颗粒；

5)移出颗粒，到终浓度为2％(w∶v)海藻酸钠与6％(w∶v)聚乙烯醇混合的水溶液中，几分钟后再移出转到含有0.25M氯化钙和饱和硼酸的混合水溶液中；

6)再将颗粒移出，分别用灭菌水和1％(w∶v)苯甲酸钠的灭菌水溶液各漂洗1次，沥出干燥，得到颗粒剂，经称量重量为27.2g，备用。

实施例5

1)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上接种培养金龟子绿僵菌，获得干燥均匀的绿僵菌分生孢子粉。

2)称取与对照同等生物量即1.39g孢子粉与17.11g凹凸棒土、1.5g可溶性淀粉预混均匀，得到20g混合物I；

3)将混合物I加入到300mL 1.5％(w∶v)的海藻酸钠水溶液中混合均匀，形成混合物II；

4)将混合物II滴加到0.25M的氯化钙水溶液中，固化形成颗粒；

5)移出颗粒，到终浓度为1.5％(w∶v)海藻酸钠与5％(w∶v)聚乙烯醇混合的水溶液中，几分钟后再移出转到含有0.25M氯化钙和饱和硼酸的混合水溶液中；

6)再将颗粒移出，分别用灭菌水和1％(w∶v)苯甲酸钠的灭菌水溶液各漂洗1次，沥出干燥，得到颗粒剂，经称量重量为26.3g，备用。

效果实施例1：

颗粒剂的真菌生命活力比较

1)参考现有技术US Patent 4718935和US Patent 4724147公开的方法，制造虫生真菌颗粒剂，作为与本发明的对照。具体操作步骤如下：①将虫生真菌球孢白僵菌接种到土豆葡萄糖液体培养基中，25℃培养72h，获得真菌培养物；②量取10mL培养物置于9cm直径的培养皿中，于烤箱中100℃烘烤4h去除水分，称量获知皿中培养物的真菌生物量，重复10次，结果见表1，计算得到真菌培养物的生物量为1.92g/100mL；③量取真菌培养物100mL，均质化后用1.33％(w/v)的海藻酸钠溶液按1∶3(v/v)比例稀释；④滴加到0.25M的CaCl₂水溶液中，固化形成颗粒；⑤沥水并干燥，得到颗粒剂，经称量重量为6.75g，备用。

表1球孢白僵菌72h培养的生物量(g/10mL)

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均
											0.185	0.192	0.183	0.190	0.179	0.174	0.183	0.168	0.179	0.185	0.192

2)将用上述用现有技术方法制造的颗粒剂和用本发明实施例4的颗粒剂各取1/10，即0.675g和2.72g，分别接种到2％琼脂培养基上，于25℃培养15天，可见颗粒表面生长出菌丝体并形成分生孢子。将这2种颗粒分别移到灭菌的三角瓶中，用灭菌的吐温80水溶液清洗培养基表面2次，清洗液加到各自的颗粒剂三角瓶中，补足灭菌的吐温80水到100mL。加几粒玻璃珠，充分震荡，制成真菌孢子悬浮液。用血球计数板在显微镜下计数，重复计3次取平均值，计算孢子浓度(表2)，可推算得知用现有技术方法和本发明方法制造的球孢白僵菌颗粒剂中的真菌恢复生长产生孢子的数量分别为5.83亿和19.6亿。由于上述1)用现有技术方法和本发明方法制造的颗粒剂所用菌量相同，因此可直接比较两者的产孢量，结果证明本发明方法制造的颗粒剂的真菌恢复生长能力优于现有技术，前者比后者提高2.36倍。

表2两种方法的颗粒剂中真菌恢复生长的孢子量

效果实施例2：

颗粒剂的真菌生命活力比较

1)参照现有技术US Patent 4724147公开的方法，制造虫生真菌颗粒剂，作为与本发明的对照。具体操作步骤如下：①将虫生真菌金龟子绿僵菌接种到蔗糖蛋白胨液体培养基中，25℃培养60h，获得真菌培养物；②量取10mL培养物置于9cm直径的培养皿中，于烤箱中100℃烘烤4h去除水分，称量获知皿中培养物的真菌生物量，重复10次，结果见表3，计算得到真菌培养物的生物量为1.39g/100mL；③量取真菌培养物100mL，均质化后用1.33％(w/v)的海藻酸钠溶液按1∶3(v/v)比例稀释；④滴加到0.25M的CaCl₂水溶液中，固化形成颗粒；⑤沥水并干燥，得到颗粒剂，经称量重量为5.97g，备用。

表3金龟子绿僵菌60h培养的生物量(g/10mL)

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	平均
											0.144	0.147	0.112	0.157	0.163	0.125	0.135	0.130	0.139	0.135	0.139

2)将用上述用现有技术方法制造的颗粒剂和用本发明实施例5的颗粒剂各取1/10，即0.597g和2.63g，分别接种到2％琼脂培养基上，于25℃培养15天，可见颗粒表面生长出菌丝体并形成分生孢子。将这2种颗粒分别移到灭菌的三角瓶中，用灭菌的吐温80水溶液清洗培养基表面2次，清洗液加到各自的颗粒剂三角瓶中，补足灭菌的吐温80水到100mL。加几粒玻璃珠，充分震荡，制成真菌孢子悬浮液。用血球计数板在显微镜下计数，重复计3次取平均值，计算孢子浓度(表4)，可推算得知用现有技术方法和本发明方法制造的绿僵菌颗粒剂中的真菌恢复生长产生孢子的数量分别为5.22亿和14.7亿。由于上述1)用现有技术方法和本发明方法制造的颗粒剂中所用菌量相同，因此可直接比较两者的产孢量，结果证明本发明方法制造的颗粒剂的真菌恢复生长能力优于现有技术，前者比后者提高1.82倍。

表4两种颗粒剂真菌恢复生长的孢子量

效果实施例3

颗粒剂的形态比较

按照效果例1的1)现有技术方法的操作步骤和本发明方法制造球孢白僵菌颗粒剂过程中，在氯化钙水溶液中固化形成的颗粒均为球形，而经过干燥后用现有技术方法制造的颗粒收缩比例较大，最终形状不规则，多数扁平或扁曲(图1b)；用本发明方法制造的颗粒剂则能够保持球状(图1a)，这不仅使产品外形整齐美观，更重要的是利于产品在农林田间应用时的投撒和均匀分布。

效果实施例4

颗粒剂的用途

现有技术的颗粒剂产品用于控制田间的病害或杂草，本发明的颗粒剂产品用于控制害虫。

选定好所用的真菌菌株，用本发明实施例4方法制造的球孢白僵菌颗粒剂，按照效果例1的2)的方法，即接种颗粒剂到2％琼脂培养基上，于25℃培养15天，待颗粒表面生长出菌丝体并形成分生孢子，用灭菌的吐温80水溶液将颗粒表面的孢子洗脱下来，配制成1x10⁸孢子/mL真菌孢子悬浮液。用喷雾器将孢子喷布到玉米螟2龄幼虫体表上，饲养观察，可见1d内幼虫取食减少，3d内有一定比例幼虫死亡，5～7d死亡率达到95％，随后虫体表面长出菌丝，产生分生孢子(图2)，由此证明，本发明制造的球孢白僵菌颗粒剂能够很好地恢复生长，并能够有效地侵染目标害虫，达到防治害虫的目的。

效果实施例5

颗粒剂的用途

现有技术的颗粒剂产品用于控制田间的病害或杂草，本发明产品用于控制害虫。

选定好所用的真菌菌株，用本发明实施例5制造的金龟子绿僵菌颗粒剂，按照效果例2的2)的方法，即接种颗粒剂到2％琼脂培养基上，于25℃培养15天，待颗粒表面生长出菌丝体并形成分生孢子，用灭菌的吐温80水溶液将颗粒表面的孢子洗脱下来，配制成真菌孢子悬浮液，用血球计数板计数确定孢子浓度。将孢子悬浮液加入到土壤中混拌均匀，使土壤含菌量达到5x10⁷孢子/g，再将金龟子2龄幼虫接到土壤中，加土豆块饲养，每2d检查1次，结果金龟子2龄幼虫在第3d出现死亡，第5～7d死亡虫数快速增加，第11d死亡率达到88％，死亡虫体保湿后有70％能够生长出菌丝并产生孢子(图3)。由此证明，本发明制造的金龟子绿僵菌颗粒剂不仅能够很好地恢复生长，并能够有效地侵染目标害虫，达到防治害虫的目的。

效果实施例6

颗粒剂的用途

现有技术的颗粒剂产品用于控制田间的病害或杂草，本发明产品用于控制害虫。

用实施例3制备的蜡蚧轮枝孢的颗粒剂，接种到2％琼脂培养基上，于25℃培养15天，待颗粒表面生长出菌丝体并形成分生孢子，用灭菌的吐温80水溶液将颗粒表面的孢子洗脱下来，配制成5x10⁷孢子/mL真菌孢子悬浮液。用气流喷雾塔将孢子喷布到蚜虫体表上，饲养观察，可见3d内有一定比例蚜虫死亡，5～7d死亡率达95％，保湿后有74％的虫体表面长出菌丝并产生分生孢子(图4)。由此证明，本发明制造的蜡蚧轮枝孢颗粒剂能够很好地恢复生长，并能够有效地侵染目标害虫，达到防治害虫的目的。

Claims (9)

1.一种通过以下方法制备得到的颗粒剂，所述方法包括：

1)通过生物发酵培养昆虫病原真菌，获得干燥均匀的昆虫病原真菌分生孢子粉；

2)将上述孢子粉与载体物、营养物预混均匀，形成混合物I，其中所述载体物为有粘性或无粘性的无机矿粉，所述营养物为谷物粉；

3)将混合物I与海藻酸钠水溶液混合均匀，形成混合物II；

4)将混合物II滴加到氯化钙水溶液中，固化形成颗粒；

5)将颗粒移出，转投到海藻酸钠与聚乙烯醇混合的水溶液中，固化后再移出转到含有氯化钙、硼酸和的混合水溶液中，在颗粒上形成外膜；

6)将颗粒移出，分别用灭菌水和含苯甲酸钠或水杨酸钠的灭菌水溶液漂洗，干燥，得到颗粒剂。

2.根据权利要求1的颗粒剂，其中在步骤2)中，载体物是有粘性或无粘性的无机矿粉，营养物是谷物粉，孢子粉与载体物、营养物的预混比例为2～20∶70～96∶2～10(w∶w∶w)。

3.根据权利要求2的颗粒剂，其中载体物是硅藻土、白炭黑、凹凸棒土或者高岭土，营养物是可溶性淀粉、普通淀粉、米粉或者玉米粉。

4.根据权利要求1的颗粒剂，其中步骤3)中的海藻酸钠水溶液浓度为1～5％，混合物I与海藻酸钠水溶液的比例是5～40∶100(w∶v)。

5.根据权利要求1的颗粒剂，其中在步骤4)中，用滴管、注射器或至少有1个漏孔使溶液可以滴落的容器滴加混合物II。

6.根据权利要求1的颗粒剂，其中步骤4)中的氯化钙水溶液的浓度为0.2～0.3M，将混合物II滴加到氯化钙水溶液中的固化反应时间为15～30分钟。

7.根据权利要求1的颗粒剂，其中在步骤5)中，海藻酸钠与聚乙烯醇混合水溶液中海藻酸钠的终浓度为1～5％、聚乙烯醇的终浓度为5～8％，氯化钙、硼酸的混合水溶液中氯化钙的终浓度为0.2～0.3M、硼酸为饱和浓度，成膜反应时间为5～10分钟。

8.根据权利要求1制得的颗粒剂用于农林田间防治害虫的用途。

9.一种制备防治害虫的真菌颗粒剂的方法，包括：

1)通过生物发酵培养昆虫病原真菌，获得干燥均匀的昆虫病原真菌分生孢子粉；

2)将上述孢子粉与载体物、营养物预混均匀，形成混合物I，其中所述载体物为有粘性或无粘性的无机矿粉，所述营养物为谷物粉；

3)将混合物I与海藻酸钠水溶液混匀，形成混合物II；

4)将混合物II滴加到氯化钙水溶液中，固化形成颗粒；

5)将颗粒移出，转投到海藻酸钠与聚乙烯醇混合的水溶液中，再移出转到含有氯化钙、硼酸和的混合水溶液中固化，在颗粒上形成外膜；

6)将颗粒移出，分别用灭菌水和含苯甲酸钠或水杨酸钠的灭菌水溶液漂洗，干燥，得到颗粒剂。

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