CN105316243A

CN105316243A - 一种农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN105316243A
Application number: CN201510808455.0A
Authority: CN
Inventors: 程仕伟; 解孝满; 张萍; 孙虎山; 刘丹; 解卫海; 陈国忠
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: CN105316243B

Abstract

本发明涉及一种农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法及其应用，该菌剂是由保藏号为CGMCC？No.10026的淡紫拟青霉YT08经固体发酵获得的，其对农业根结线虫病害具有强抑制效果。本发明的固态发酵涉及优选的培养基：干啤酒糟17～30%，麸皮4～8%，花生壳粉碎物3～6%，大豆蛋白胨2～5%，粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度）2.55～7.5%，蟹壳粉1～2.25%，NaCl？0.2～0.5%，CaCl₂？0.1～0.3%，MgSO₄？0.1～0.3%，FeSO₄？0.05～0.15%，含水量为40～70%。本发明中的制备方法具有原料成本低、易于操作控制、产品功效强和适合工业化生产等特点。

Description

一种农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法，及其在农业根结线虫生物防治中的应用，属于农业微生物技术领域。

背景技术

植物病虫害是造成农作物减产的重要原因，每年因病虫害减产的损失巨大，其种植者为减少病虫害的发生而使用大量化学农药，进而造成病源生物对化学药物的抗药性增加，形成恶性循环。与此同时，大量使用化学农药造成农作物的品质下降，很多人谈食色变。在此背景下，高效低毒的生物农药逐渐受到广大农民、生产企业及政府的重视，发展有机种植业大势所趋，生物农药存在巨大的市场空间。

植物线虫病是农作物、蔬菜、果树、林木、花卉及药材种植的四大病源生物之一，每年造成世界农业生产的损失约1000亿美元，全球农业上最重要的危害线虫是根结线虫和胞囊线虫，我国较为严重的线虫有根结线虫、大豆胞囊线虫、小麦粒线虫、甘薯茎线虫、水稻干尖线虫、栗线虫、松材线虫等，仅我国农作物种植业线虫病损失就达600亿元。

淡紫拟青霉能广泛寄生于线虫卵，杀虫效果高效，被认为是最具有应用前景的根结线虫生防真菌，该菌具有功效高、寄生广、易培养等特点，特别是在控制植物病源线虫方面功效显著。淡紫拟青霉除了具有杀线虫效果外，还可以寄生半翅目、同翅目、等翅目和鞘翅目及鳞翅目等昆虫，另外对植物病原菌（如玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水稻恶苗病等）具有拮抗作用。淡紫拟青霉的次级代谢物也有一定的生理效能，如产生类似吲哚乙酸产物，促进植物根系和植株生长，对种子萌发和生长具有促进作用，还能产生多种功能酶，并具有一定的化学农药降解效应。

淡紫拟青霉作为一种生物制剂，在杀线虫过程中具有安全、高效、持效期长等特点，其杀线虫的活性并不比化学杀线虫剂差，并有促进植物生长的作用。目前研究资料表明，淡紫拟青霉菌剂可用于玉米等十几种经济作物、茄子等多种蔬菜、菊花等大量花卉药材及葡萄等多种果树线虫病的预防和治疗。淡紫拟青霉菌剂与进口的化学杀虫剂相比，杀线虫效果相当或接近，而其生产成本较低且有后效，并具有不污染农产品和环境的优点。淡紫拟青霉类环境友好的杀虫菌剂的研发成功对于我国的食品与农作物安全、农业的可持续发展均具有重要意义。

发明内容

本发明针对上述技术背景及其存在的不足，提供一种农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法，及其在农作物根结线虫生物防治中的应用。以淡紫拟青霉YT08CGMCCNo.10026为出发菌株，经固态发酵的方法生产农业根结线虫复合生防菌剂，在培养过程中添加壳聚糖和蟹壳粉等多种诱导因子，激活该菌株的根结线虫侵染因子的生成量，通过多生防功能因子联合协同作用，提高根结线虫的防治效果。

本发明的目的可以通过如下措施来达到：

1.一株具有防治番茄与葡萄根结线虫病害的淡紫拟青霉，该菌株具有高产壳聚糖酶的特性，其保藏名称为：YT08，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年11月26日，保藏号为CGMCCNo.10026，分类命名：淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）。

2.菌种活化

从试管斜面保藏菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28～30℃、200rpm下培养36～48h至菌体浑浊，制得活化种子液；所述的活化培养基（g/L）：蛋白胨5～10，酵母粉3～5，甘油20～25，粉末壳聚糖1～2，磷酸二氢钾2～3，硫酸镁2～3,磷酸氢二钠2～3，pH6.5。

3.固态发酵

固体发酵培养基：干啤酒糟17～30%，麸皮4～8%，花生壳粉碎物3～6%，大豆蛋白胨2～5%，粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度）2.55～7.5%，蟹壳粉1～2.25%，NaCl0.2～0.5%，CaCl₂0.1～0.3%，MgSO₄0.1～0.3%，FeSO₄0.05～0.15%，含水量为40～70%。配制方法：先用水将NaCl、CaCl₂、MgSO₄、FeSO₄、MnSO₄和大豆蛋白胨溶解，搅拌均匀，再与其他物质混匀，pH自然。将上述固体发酵培养基装入固体发酵容器中，121℃下蒸汽灭菌15～25分钟。

按照5～10%（体积百分比）接种量，将淡紫拟青霉YT08的活化种子液倒入固体发酵培养基中，机械搅拌使菌种与发酵培养基混匀。在30～32℃下静态培养，每隔3～5h时通入无菌空气1次。培养3～5d后至培养基表层长满菌丝，再次机械搅拌将培养基料捣碎混匀，在28～30℃下静态培养，每隔5～8小时通入无菌空气1次，继续培养3～4d后至培养基上长满淡紫色孢子后终止发酵。

4.产品成型

发酵终止后通过机械搅拌使培养物打散混匀，置于阴凉通风处晾干，然后用粉碎机粉碎，即得淡紫拟青霉YT08的农业根结线虫复合生防菌剂。制备的农业根结线虫复合生防菌剂经平板培养法确定其活菌数，高效液相色谱法测定其壳寡糖含量。

所用的活菌数测定方法：称取1g农业根结线虫复合生防菌剂，加到含有50mL无菌水的三角烧瓶中，在旋转摇床中振摇10min使其充分混匀，然后吸取1mL样液稀释到适当梯度。取0.1mL稀释的样液均匀涂布于孟加拉红（虎红）显色培养基中，在28℃的恒温培养箱中培养3d至长出单菌落，计数菌落个数并换算为单位质量的农业根结线虫复合生防菌剂的总活菌数。

所用的壳寡糖含量的测定方法：采用高效液相色谱仪测定，HYPERSILHSAPS柱，洗脱液为乙腈：双蒸水=3：2，流速0.8mL/min，柱温40℃，水解产物0.05%，上样量20μL，不同聚合度的壳寡糖及氨基葡萄糖单体作为标准对照品。

本发明内容的有益效果在于：

1.淡紫拟青霉YT08CGMCCNo.10026是一株对农作物根结线虫具有强防治效果的丝状真菌，在其固体发酵培养过程中产生大量的壳聚糖酶及部分的几丁质酶等水解蛋白酶类，作为侵染因子进入根结线虫内部，起到杀灭根结线虫的效果。

2.利用淡紫拟青霉YT08高产壳聚糖酶的特性，在菌体发酵过程中添加粉末壳聚糖诱导产生壳聚糖酶，同时生成的壳聚糖酶又将培养基中壳聚糖降解转化为高生理活性的低分子量壳寡糖，其对根结线虫有一定的抑制效应，也对多种植物病原虫菌具有抑制作用，。

3.发酵培养基中中添加的粉末壳聚糖和蟹壳粉，除一部分转化为壳寡糖外，还有部分未降解的壳聚糖、几丁质作为根结线虫生物防治的辅助因子，另外其还可以抑制多种植物病原菌，与菌体孢子一起形成对根结线虫生物防治的协同效应。

4.淡紫拟青霉YT08在发酵过程中还会产生许多的次生代谢产物，其可以促进农作物生长且对根结线虫及植物病原菌的抑制具有一定的增效作用，这些组分与生成的壳寡糖以及淡紫拟青霉菌体孢子形成协同效应，提高其对根结线虫的防治效果。

本发明的突出优势在于：

1.以啤酒糟、麸皮、花生壳等这些工农业有机废弃物为培养基主要基料，发酵过程中使用的原料成本较低，产品的市场竞争力明显。

2.相对液态发酵来说，固态发酵培养容易，操作方法简单高效，对从业技术人员的要求不高，且由于淡紫拟青霉YT08对多数病原菌具有抑制作用使其培养过程中不易染菌。

3.本发明中的农业根结线虫复合生防菌剂中以淡紫拟青霉YT08作为杀灭根结线虫的主要功能组分，培养过程中产生的壳寡糖、壳聚糖酶、几丁质酶以及其它众多的次生代谢产物也对根结线虫具有一定抑制作用，从而具有协同防治的效果。

4.本发明中的农业根结线虫复合生防菌剂除了具有杀灭根结线虫的作用外，还能促进作物生长，抑制植物病原菌，增强作物根系的健康。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。

实施例1浅盘培养制备农业根结线虫复合生防菌剂

从试管斜面保藏菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在30℃、200rpm下培养36h至菌体浑浊，制得活化种子液；所述的活化培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，甘油25，粉末壳聚糖2，磷酸二氢钾3，硫酸镁3,磷酸氢二钠3，pH6.5。

采用的固体发酵培养基：干啤酒糟30%，麸皮8%，花生壳粉碎物6%，大豆蛋白胨5%，粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度）7.5%，蟹壳粉2.25%，NaCl0.5%，CaCl₂0.3%，MgSO₄0.3%，FeSO₄0.15%，按照培养基组分总质量换算添加纯净水至含水量为40%。配制方法：先用水将NaCl、CaCl₂、MgSO₄、FeSO₄、MnSO₄和大豆蛋白胨溶解，搅拌均匀，再与其他物质混匀，pH自然。将上述固体发酵培养基装入固体发酵容器中，121℃下蒸汽灭菌15分钟。

按照10%（体积百分比）接种量，将淡紫拟青霉YT08的种子活化液倒入固体发酵培养基中，通过搅拌使菌种与发酵培养基混匀，放置于霉菌培养箱中培养，表层用事先灭菌的8层纱布覆盖，在32℃下静态培养，每隔5h时通入无菌空气1次。培养4d后至培养基表层长满菌丝，然后将培养基物料和菌丝体再次搅拌混匀，在30℃下静态培养，每隔8小时通入无菌空气1次，当其含水量低于20%时要淋加适当无菌水至含水量40%以上，继续培养3d后至培养基上长满淡紫色孢子后终止发酵。

发酵终止后的固体发酵产物，一起收集后放入阴凉通风处晾干，然后用粉碎机粉碎，即得淡紫拟青霉YT08的农业根结线虫复合生防菌剂。经测定，制备的农业根结线虫复合生防菌剂中，淡紫拟青霉YT08的活菌总数为2.4×10⁹cfu/g，壳寡糖含量的质量分数为1.36%。

实施例2固体发酵罐制备农业根结线虫复合生防菌剂

从试管斜面保藏菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28℃、200rpm下培养48h至菌体浑浊，制得活化种子液；所述的活化培养基（g/L）：蛋白胨5，酵母粉3，甘油20，粉末壳聚糖1，磷酸二氢钾2，硫酸镁2,磷酸氢二钠2，pH6.5。

采用的固体发酵培养基：干啤酒糟17%，麸皮4%，花生壳粉碎物3%，大豆蛋白胨2%，粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度）2.55%，蟹壳粉1%，NaCl0.2%，CaCl₂0.1%，MgSO₄0.1%，FeSO₄0.055%，按照培养基组分总质量换算添加纯净水至含水量为70%。配制方法：先用水将NaCl、CaCl₂、MgSO₄、FeSO₄、MnSO₄和大豆蛋白胨溶解，搅拌均匀，再与其他物质混匀，pH自然。将上述固体发酵培养基装入50L的固体发酵罐中，121℃下蒸汽灭菌20分钟。

按照5%（体积百分比）接种量，将淡紫拟青霉YT08的种子培养产物倒入固体发酵培养基中，启动发酵罐的机械搅拌使菌种与发酵培养基混匀。在30℃下静态培养，每隔3h时通入无菌空气1次。培养3d后至培养基表层长满菌丝，再次启动机械搅拌将发酵罐中培养基料捣碎混匀，在28℃下静态培养，每隔5小时通入无菌空气1次，继续培养4d后至培养基上长满淡紫色孢子后终止发酵。

发酵终止后启动机械搅拌装置，将培养物打散混匀，从出料口取出，放入阴凉通风处晾干，然后用粉碎机粉碎，即得淡紫拟青霉YT08的农业根结线虫复合生防菌剂。经测定，制备的农业根结线虫复合生防菌剂中，淡紫拟青霉YT08的活菌总数为3.7×10¹⁰cfu/g，壳寡糖含量的质量分数为3.22%。

实施例3通风发酵池制备农业根结线虫复合生防菌剂

从试管斜面保藏菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28～30℃、200rpm下培养36～48h至菌体浑浊，制得活化种子液；所述的活化培养基（g/L）：蛋白胨8，酵母粉4，甘油22，粉末壳聚糖2，磷酸二氢钾2，硫酸镁2,磷酸氢二钠3，pH6.5。

采用的固体发酵培养基：干啤酒糟30%，麸皮6%，花生壳粉碎物5%，大豆蛋白胨5%，粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度）6%，蟹壳粉2%，NaCl0.5%，CaCl₂0.3%，MgSO₄0.3%，FeSO₄0.15%，按照培养基组分总质量换算添加自来水至含水量为44.75%。配制方法：先用水将NaCl、CaCl₂、MgSO₄、FeSO₄、MnSO₄和大豆蛋白胨溶解，搅拌均匀，再与其他物质混匀，pH自然。将上述固体发酵培养基装入1m³的固体发酵池中，121℃下蒸汽灭菌25分钟。

按照8%（体积百分比）接种量，将淡紫拟青霉YT08的种子培养产物倒入固体发酵培养基中，机械搅拌使菌种与发酵培养基混匀。在30℃下静态培养，每隔4h时通入无菌空气1次。培养4d后至培养基表层长满菌丝，再次启动机械搅拌将发酵池中培养基料捣碎混匀，在28℃下静态培养，每隔6小时通入无菌空气1次，继续培养4d后至培养基上长满淡紫色孢子后终止发酵。

发酵终止后启动机械搅拌装置，将培养物打散混匀，放入阴凉通风处晾干，然后用粉碎机粉碎，即得淡紫拟青霉YT08的农业根结线虫复合生防菌剂。经测定，制备的农业根结线虫复合生防菌剂中，淡紫拟青霉YT08的活菌总数为8.2×10⁹cfu/g，壳寡糖含量的质量分数为2.59%。

实施例4农业根结线虫复合生防菌剂的使用效果评价

实施例1中制备的农业根结线虫复合生防菌剂命名为CMPL-1，实施例2中制备的根施农业复合生防制剂命名为CMPL-2，实施例3中制备的根施农业复合生防制剂命名为CMPL-3。

栽培基质为无病土、有机肥和沙按照9:1:3比例混合配制，所用的栽培基质经检测均无线虫存在。挑取12cm左右长度的番茄幼苗栽培在30×30cm的花盆中，每盆1株，共60株。上述的60盆番茄苗的栽培基质中均施入200条2龄番茄根结线虫，其中30盆分别施入5g根施农业生防制剂，标记为CMPL-1、CMPL-2和CMPL-3根施农业生防制剂各占10盆；另外30盆再施入3g干酒糟作为空白对照。常规管理60天后，计算防治效果。

所用的番茄根结线虫获得途径如下：采集温室大棚中根结线虫病株番茄的根系，首先用水冲洗干净，剪成小段后加入次氯酸钠溶液中，封口摇动3分钟后，先过200目筛并用蒸馏水冲洗，再过500目筛，用蒸馏水反复冲洗后，收集于无菌小烧杯。将收集的根结线虫卵于26℃下孵化3天，即得到番茄根结线虫的2龄幼虫。

根据根结着生的多少将病情严重程度分为5级：无根结的为0级，根结占全根系的1%—25%的为1级，根结占全根系的26%—50%的为2级，根结占全根系的51%—75%的为3级，根结占全根系的76%—100%的为4级。病情指数和防治效果的计算公式如下：

盆栽试验结果如表1所示，标记为CMPL-1、CMPL-2和CMPL-3根施农业生防制剂防治番茄根结线虫的防治效果为分别为82.7%、88.1%和85.4%。此外，处理组番茄的根重增长率、株高增长率和地上部分重量增长率均显著高于对照组。

表1农业根结线虫复合生防菌剂对番茄根结线虫的防治效果

综上所述，本发明的优点在于农业根结线虫复合生防菌剂对根结线虫具有高抑制率，采用固态发酵的制备方法相对简单，对操作技术人员要求不高，容易控制工艺条件，适合大规模工厂化生产，其在经济作物根结线虫病的防治方面具有广阔的应用前景。

Claims

1.一种农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法及其应用，其特征在于，是由保藏号为CGMCCNo.10026的淡紫拟青霉YT08经固态发酵后获得的，该菌剂对农业根结线虫病害具有强抑制效果，其制备方法包括如下步骤：

（1）菌种活化：从试管斜面保藏菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28～30℃、200rpm下培养36～48h至菌体浑浊，制得活化种子液；所述的活化培养基（g/L）：蛋白胨5～10，酵母粉3～5，甘油20～25，粉末壳聚糖1～2，磷酸二氢钾2～3，硫酸镁2～3,磷酸氢二钠2～3，pH6.5；

（2）固态发酵：按照5～10%（v/v）的接种量，将淡紫拟青霉YT08的活化种子液倒入固体发酵培养基中，机械搅拌使活化菌种与发酵培养基混匀；在30～32℃下静态培养，每隔3～5h时通入无菌空气1次；培养3～5d后至培养基表层长满菌丝，再次经过机械搅拌将培养基料捣碎混匀，在28～30℃下静态培养，每隔5～8小时通入无菌空气1次，继续培养3～4d后至培养基上长满淡紫色孢子后终止发酵；发酵终止后将固体培养物打散混匀，置于阴凉通风处晾干，然后用粉碎机粉碎，即得农业根结线虫复合生防菌剂。

2.如权利要求1所述的农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法及其应用，其特征在于，采用的优选发酵培养基（g/L）为：干啤酒糟17～30%，麸皮4～8%，花生壳粉碎物3～6%，大豆蛋白胨2～5%，粉末壳聚糖（90%以上的脱乙酰度）2.55～7.5%，蟹壳粉1～2.25%，NaCl0.2～0.5%，CaCl₂0.1～0.3%，MgSO₄0.1～0.3%，FeSO₄0.05～0.15%，含水量为40～70%。

3.如权利要求1所述的农业根结线虫复合生防菌剂的制备方法及其应用，其特征在于，发酵初期菌体生长阶段的培养温度为30～32℃，发酵后期产孢子阶段的培养温度为28～30℃。