CN103525748B - 哈茨木霉厚垣孢子的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高产哈茨木霉厚垣孢子的方法，所述哈茨木霉经菌种活化，一级液体种子液的制备和二级液体种子液的制备，再采用固体发酵方法发酵产生厚垣孢子。所述固体发酵使用的固体发酵培养基由玉米秸秆粉、豆粕粉和无机盐组成。采用本发明提供的哈茨木霉厚垣孢子的生产方法，可产生大量的厚垣孢子，基质厚垣孢子量最高可达1.81×10⁹cfu/g，发酵单位高，生产过程不产生废料，环保无污染。发酵所获得的孢子—基质混合物经干燥后可直接用于农作物的生防。

Description

哈茨木霉厚垣孢子的生产方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及哈茨木霉厚垣孢子的生产方法。

背景技术

木霉菌（Trichoderma spp.）属真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落。木霉属真菌广泛分布于自然界，广泛存在于腐木、种籽、植物残体、空气中，可从中分离得到。

木霉菌具有重要的经济意义，被广泛地应用到农业的各个方面，如防治植物病害、促进植物生长、生物修复土壤和环境、应用于生物有机肥等。近些年，木霉菌的研究与应用得到了快速发展。结合遗传学、分子生物学、生物化学及生态学等研究方法，木霉菌及其代谢产物在促进植物生长，增加营养物质的吸收利用率，提高农作物的产量，以及增强对病害的防御性方面有着广阔的应用前景。特别是在倡导绿色农业的背景下，木霉菌的大面积推广应用已成为构建现代和高效的生物防治病虫害体系中不可或缺的一部分。

随着社会的进步，人们越来越深刻地认识到长期大量使用化学农药对生态环境和人类健康的危害。生物防治可以有效地克服这些弊端,因而生物农药逐渐受到人们的重视。其中拮抗微生物在植病生防中的应用倍受人们关注。在2013年已发现的拮抗微生物中，木霉菌具有很好的生防活性。

木霉属中应用最多的是哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。目前，木霉真菌应用于农业方面大都是采用分生孢子制剂，但分生孢子制剂存在自身的缺陷。分生孢子货架期比较短，一般只有2到3个月左右，夏季更短，而且分生孢子抗逆能力低，这不利于哈茨木霉应用于农业方面。厚垣孢子具有耐干燥、耐低温、存活期长等优点，可使孢子易于加工和贮存，有利于在土壤中存活。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产哈茨木霉厚垣孢子的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种哈茨木霉厚垣孢子的生产方法，包括哈茨木霉菌种活化、一级液体种子液的制备、二级液体种子液的制备以及固体发酵的步骤。

其中，用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基，包括如下重量份的各组分：玉米秸秆粉3-4.5、豆粕粉0.75-1.5和无机盐离子溶液4-6.25。其中，所述无机盐离子溶液中各成分的质量百分数为：硫酸铵0.5%-2%、氯化钠0.01%-1.5%、磷酸二氢钾0.1%-1.5%、硫酸镁0.1%-1.5%、硫酸锰0.1%-1.5%、硫酸亚铁0.01%-0.1%、蛋白胨0.05%-1.5%、葡萄糖0.05%-1.5%，余量为水。

优选地，用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基，包括如下重量份的各组分：玉米秸秆粉3.4-4.2、豆粕粉0.85-1.2和无机盐离子溶液4.2-5.8。其中，所述无机盐离子溶液中各成分的质量百分数为：硫酸铵0.7%-1.5%、氯化钠0.5%-1.2%、磷酸二氢钾0.3%-0.9%、硫酸镁0.2%-1.2%、硫酸锰0.2%-1.2%、硫酸亚铁0.04%-0.08%、蛋白胨0.2%-1.2%、葡萄糖0.5%-1.2%，余量为水。

更优选地，用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基，包括如下重量份的各组分：玉米秸秆粉3.6、豆粕粉1和无机盐离子溶液5.4。其中，所述无机盐离子溶液中各成分的质量百分数为：硫酸铵1.2%、氯化钠1%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁1%、硫酸锰1%、硫酸亚铁0.05%、蛋白胨1%、葡萄糖1%，余量为水。

固体发酵的方法为：将二级液体种子液按10%-15%（优选15%）的接种量接种至上述用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基中，于25℃-35℃，通气量2.5L/min，相对湿度保持在80%以上的条件下，进行暗培养10-15天，每隔2-3天翻动1次培养基。

前述方法中，一级液体种子液的制备方法为：将活化后的哈茨木霉接种于斜面种子液体活化培养基中，于28℃发酵培养4天，即得一级液体种子液。其中，所述斜面种子液体活化培养基中各成分的质量百分数为：硫酸铵1.5%、葡萄糖1.2%和吐温800.2%，余量为水。

前述方法中，二级液体种子液的制备方法为：将一级液体种子液按9%的接种量接种至哈茨木霉的液体发酵培养基中，于30℃，通气量2.5L/min，转速150r/min，pH值6.0的条件下，发酵培养3天，即得二级液体种子液。其中，哈茨木霉的液体发酵培养基的配方为：麸皮15g/L、玉米粉7g/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁4g/L、磷酸二氢钠4g/L、磷酸氢二钠4g/L和泡敌0.3g/L，以水配制。

本发明还提供一种制备哈茨木霉厚垣孢子粉的方法，按照上述哈茨木霉厚垣孢子的生产方法，固体发酵培养结束后，将发酵基质于40℃烘干，干燥后粉碎，即得哈茨木霉厚垣孢子粉。

本发明中用于发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的哈茨木霉菌株购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC），保藏编号为30371。

本发明提供了一种哈茨木霉液体制种固体发酵生产厚垣孢子的方法。所述哈茨木霉经菌种活化，一级液体种子液的制备和二级液体种子液的制备，再采用固体发酵方法发酵产生厚垣孢子。所述固体发酵使用的固体发酵培养基由玉米秸秆粉、豆粕粉和无机盐构成。采用本发明提供的哈茨木霉厚垣孢子的生产方法，可产生大量的厚垣孢子，基质厚垣孢子量最高可达1.81×10⁹cfu/g，发酵单位高，生产过程不产生废料，环保无污染。发酵所获得的孢子—基质混合物经干燥后可直接用于农作物的生防。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子

包括以下步骤：

1、液体发酵所需种子制作方法

将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）的保藏编号为31707的哈茨木霉菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后转接至PDA的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。

配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1.2%、吐温80含量为0.2%、余量为水。按上述比例配制培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后在超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下置于该液体培养基中，在恒温摇床中培养18小时，培养温度为28℃。

检测悬浮液菌落数为1.5×10⁸cfu/mL。检测方法采用梯度稀释法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。

2、固体发酵所需种子制备

以100L发酵罐计，按麸皮15g/L、玉米粉7g/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁4g/L、磷酸二氢钠4g/L、磷酸氢二钠4g/L、泡敌0.3g/L的比例，按70L的量分别称取上述组分于发酵罐中，加水至70L，高温高压（121℃、0.1Mpa）蒸气灭菌处理30min，并将所需管道消毒灭菌。培养基冷却后接种步骤1所制得的液体种子，接种量9%，发酵条件为：pH6.0，温度30℃，通气量2.5L/min，转速150r/min，发酵时间3天。

3、固体发酵产厚垣孢子

按玉米秸秆粉3.6Kg、豆粕粉1Kg、无机盐离子溶液5.4Kg的比例配制固体发酵培养基。无机盐离子溶液的成分为硫酸铵64.8g、氯化钠54g、磷酸二氢钾27g、硫酸镁54g、硫酸锰54g、硫酸亚铁2.7g、葡萄糖54g、蛋白胨54g，余量为水。配好后分装至面粉袋灭菌，每袋的装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃，灭菌时间30分钟。

将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且用过氧乙酸对环境进行消毒处理。

在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基1Kg/盘，接种培养好的液体种子150mL，用铲子将种子和固体发酵培养基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，黑暗条件下培养，培养温度为30℃，通入无菌空气，通入量为2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度在80%以上，在发酵过程中每隔2-3天翻动1次培养基，培养时间13天。

4、后处理

培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为40℃，干燥粉碎后即得哈茨木霉厚垣孢子粉，对厚垣孢子进行检测。检测哈茨木霉厚垣孢子量达到1.81×10⁹cfu/g。检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。

实施例2固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子

包括以下步骤：

1、液体发酵所需种子制作方法

将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）的保藏编号为31707的哈茨木霉菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后转接至PDA的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。

配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1.2%、吐温80含量为0.2%、余量为水。按上述比例配制培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后在超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下置于该液体培养基中，在恒温摇床中培养18小时，培养温度为28℃。

检测悬浮液菌落数为1.5×10⁸cfu/mL。检测方法采用梯度稀释法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。

2、固体发酵所需种子制备

以100L发酵罐计，按麸皮15g/L、玉米粉7g/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁4g/L、磷酸二氢钠4g/L、磷酸氢二钠4g/L、泡敌0.3g/L的比例，按70L的量分别称取上述组分于发酵罐中，加水至70L，高温高压（121℃、0.1Mpa）蒸气灭菌处理30min，并将所需管道消毒灭菌。培养基冷却后接种步骤1所制得的液体种子，接种量9%，发酵条件为：pH6.0，温度28℃，通气量2.5L/min，转速150r/min，发酵时间3天。

3、固体发酵产厚垣孢子

按玉米秸秆粉3Kg、豆粕粉1.5Kg、无机盐离子溶液5.5Kg的比例配制固体发酵培养基。无机盐离子溶液的成分为硫酸铵110g、氯化钠82.5g、磷酸二氢钾82.5g、硫酸镁82.5g、硫酸锰82.5g、硫酸亚铁5.5g、葡萄糖82.5g、蛋白胨82.5g，余量为水。配好后分装至面粉袋灭菌，每袋的装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃，灭菌时间30分钟。

将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且用过氧乙酸对环境进行消毒处理。

在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基1Kg/盘，接种培养好的液体种子120mL，用铲子将种子和固体发酵培养基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，黑暗条件下培养，培养温度为26℃，通入无菌空气，通入量为2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度在80%以上，在发酵过程中每隔2-3天翻动1次培养基，培养时间15天。

4、后处理

培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为40℃，干燥粉碎后即得哈茨木霉厚垣孢子粉，对厚垣孢子进行检测。检测哈茨木霉厚垣孢子量达到1.05×10⁹cfu/g。检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。

实施例3固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子

包括以下步骤：

1、液体发酵所需种子制作方法

将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）的保藏编号为31707的哈茨木霉菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后转接至PDA的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。

配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1.2%、吐温80含量为0.2%、余量为水。按上述比例配制培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后在超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下置于该液体培养基中，在恒温摇床中培养18小时，培养温度为28℃。

检测悬浮液菌落数为1.5×10⁸cfu/mL。检测方法采用梯度稀释法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。

2、固体发酵所需种子制备

以100L发酵罐计，按麸皮15g/L、玉米粉7g/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁4g/L、磷酸二氢钠4g/L、磷酸氢二钠4g/L、泡敌0.3g/L的比例，按70L的量分别称取上述组分于发酵罐中，加水至70L，高温高压（121℃、0.1Mpa）蒸气灭菌处理30min，并将所需管道消毒灭菌。培养基冷却后接种步骤1所制得的液体种子，接种量9%，发酵条件为：pH6.0，温度28℃，通气量2.5L/min，转速150r/min，发酵时间3天。

3、固体发酵产厚垣孢子

按玉米秸秆粉4.5Kg、豆粕粉1.5Kg、无机盐离子溶液4Kg的比例配制固体发酵培养基。无机盐离子溶液的成分为硫酸铵20g、氯化钠0.4g、磷酸二氢钾4g、硫酸镁4g、硫酸锰4g、硫酸亚铁0.4g、葡萄糖2g、蛋白胨2g，余量为水。配好后分装至面粉袋灭菌，每袋的装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃，灭菌时间30分钟。

将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且用过氧乙酸对环境进行消毒处理。

在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基1Kg/盘，接种培养好的液体种子100mL，用铲子将种子和固体发酵培养基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，黑暗条件下培养，培养温度为35℃，通入无菌空气，通入量为2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度在80%以上，在发酵过程中每隔2-3天翻动1次培养基，培养时间10天。

4、后处理

培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为40℃，干燥粉碎后即得哈茨木霉厚垣孢子粉，对哈茨木霉进行检测。检测哈茨木霉厚垣孢子量达到8.92×10⁸cfu/g。检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。

实施例4固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子

包括以下步骤：

1、液体发酵所需种子制作方法

将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）的保藏编号为31707的哈茨木霉菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后转接至PDA的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。

配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1.2%、吐温80含量为0.2%、余量为水。按上述比例配培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后在超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下置于该液体培养基中，在恒温摇床中培养18小时，培养温度为28℃。

检测悬浮液菌落数为1.5×10⁸cfu/mL。检测方法采用梯度稀释法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。

2、固体发酵所需种子制备

以100L发酵罐计，按麸皮15g/L、玉米粉7g/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁4g/L、磷酸二氢钠4g/L、磷酸氢二钠4g/L、泡敌0.3g/L的比例，按70L的量分别称取上述组分于发酵罐中，加水至70L，高温高压（121℃、0.1Mpa）蒸气灭菌处理30min，并将所需管道消毒灭菌。培养基冷却后接种1步骤所制得的液体种子，接种量9%，发酵条件为：pH6.0，温度28℃，通气量2.5L/min，转速150r/min，发酵时间3天。

3、固体发酵产厚垣孢子

按玉米秸秆粉3.4Kg、豆粕粉0.8Kg、无机盐离子溶液5.8Kg的比例配制固体发酵培养基。无机盐离子溶液的成分为硫酸铵40.6g、氯化钠29g、磷酸二氢钾17.4g、硫酸镁11.6g、硫酸锰11.6g、硫酸亚铁2.32g、葡萄糖29g、蛋白胨11.6g，余量为水。配好后分装至面粉袋灭菌，每袋的装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃，灭菌时间30分钟。

将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且用过氧乙酸对环境进行消毒处理。

在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基1Kg/盘，接种培养好的液体种子150mL，用铲子将种子和固体发酵培养基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，黑暗条件下培养，培养温度为32℃，通入无菌空气，通入量为2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度在80%以上，在发酵过程中每隔2-3天翻动1次培养基，培养时间13天。

4、后处理

培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为40℃，干燥粉碎后即得哈茨木霉厚垣孢子粉，对厚垣孢子进行检测。检测哈茨木霉厚垣孢子量达到1.55×10⁹cfu/g。检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。

实施例5固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子（对照）

本实施例为对照例，按ZL200410025682中公开的方法进行。

1、斜面母菌种制备

将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）的保藏编号为31707的第一代种子在无菌条件下转接至PDA培养基（马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL）斜面。

2、二级菌种制备

二级菌种液体发酵培养液配方为马铃薯150g、蔗糖20g、水1000mL。制作方法：将马铃薯去皮后切成1cm见方的小块，加1000mL水煮沸20分钟、用纱布滤去马铃薯块，加水补足至1000mL，调pH值为6.5，装入500mL三角瓶中，装液量为200mL，在121℃下灭菌分钟，在无菌室内将斜面母菌种接入摇瓶，摇床转速为170转/分，发酵温度26℃，发酵时间为4天，得到二级菌种。

3、生产罐发酵

所采用的厚垣孢子培养基配方为：马铃薯150g、葡萄糖15g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、色氨酸2g、果糖4g、植物油2g、水1000mL。发酵罐为10L发酵罐，装液量为7L。将马铃薯去皮后切成1cm见方的小块，加7L水煮沸20分钟、用纱布滤去马铃薯块，倒入发酵罐中。然后加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、色氨酸、果糖等，使之完全融化，加水补足至7L，调pH值为6，在121℃下灭菌30分钟，接重量为3%，发酵温度为25℃，供氧量150kpa，搅拌速度为120转/分，发酵时间6天。可使得95%以上的菌丝形成厚垣孢子。

4、后处理

将所得的木霉菌厚垣孢子悬浮液按1:4的比例与硅藻土吸附后制成孢子粉，干燥温度为40℃，干燥粉碎后即得哈茨木霉厚垣孢子粉，对厚垣孢子进行检测。检测哈茨木霉厚垣孢子量为3.2×10⁸cfu/g。检测方法采用涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。

结果表明，采用本发明方法生产的厚垣孢子数远高于对照例产生的厚垣孢子数。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.哈茨木霉厚垣孢子的生产方法，其特征在于，包括哈茨木霉菌种活化、一级液体种子液的制备、二级液体种子液的制备以及固体发酵的步骤；

其中，固体发酵步骤中使用用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基；所述用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基包括如下重量份的各组分：玉米秸秆粉3.6、豆粕粉1和无机盐离子溶液5.4；其中，所述无机盐离子溶液中各成分的质量百分数为：硫酸铵1.2％、氯化钠1％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁1％、硫酸锰1％、硫酸亚铁0.05％、蛋白胨1％、葡萄糖1％，余量为水；

一级液体种子液的制备方法为：将活化后的哈茨木霉接种于斜面种子液体活化培养基中，于28℃发酵培养4天，即得一级液体种子液；其中，所述斜面种子液体活化培养基中各成分的质量百分数为：硫酸铵1.5％、葡萄糖1.2％和吐温800.2％，余量为水；

二级液体种子液的制备方法为：将一级液体种子液按9％的接种量接种至哈茨木霉液体发酵培养基中，于30℃，通气量2.5L/min，转速150r/min，pH值6.0的条件下，发酵培养3天，即得二级液体种子液；其中，哈茨木霉液体发酵培养基的配方为：麸皮15g/L、玉米粉7g/L、硫酸铵4g/L、硫酸镁4g/L、磷酸二氢钠4g/L、磷酸氢二钠4g/L和泡敌0.3g/L，以水配制；

固体发酵的方法为：将二级液体种子液按10％-15％的接种量接种至所述用于固体发酵生产哈茨木霉厚垣孢子的培养基中，于25℃-35℃，通气量2.5L/min，相对湿度保持在80％以上的条件下，进行暗培养10-15天。

2.哈茨木霉厚垣孢子粉的制备方法，其特征在于，根据权利要求1所述的方法，固体发酵培养结束后，将发酵基质于40℃烘干，干燥后粉碎，即得哈茨木霉厚垣孢子粉。