CN105362301A

CN105362301A - 一种食线虫性真菌颗粒制剂及其制备方法与应用

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Publication number: CN105362301A
Application number: CN201510767584.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡葵蒸; 王波波; 韩元; 许强; 刘俊林; 薛宇佳; 马忠仁; 彭建伟; 胡黔林; 刘伟; 王逢会; 冯若飞; 秦鸽鸽; 王康英; 张涛杰; 王明明; 孙龙杰; 陈明月; 吴佳严; 杨静
Original assignee: Northwest Minzu University
Current assignee: Northwest Minzu University
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2016-03-02

Abstract

一种食线虫性真菌颗粒制剂及其制备方法与应用，所述食线虫性真菌颗粒制剂是将捕食线虫性真菌分离株进行厚垣孢子批量培养，然后0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱、过滤制成0.3～0.6×10⁶个/ml的孢子液，接着将孢子液与海藻酸钠水溶液制成0.8％～1.2％海藻酸钠-菌液混合液；然后滴入到钙盐溶液中反应时间1～2分钟，最后经真空干燥后制成。本发明还包括食线虫性真菌颗粒制剂及其制备方法与应用。本发明海藻酸钠价格低廉，钙液体可循环利用，不需保护剂，从而大大降低成本；并且真空干燥能很好地降低在干燥时的对厚垣孢子的损伤；同时具有易于保存和运输、易于规模化生产、能在生产中方便应用的特点。

Description

一种食线虫性真菌颗粒制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种颗粒制剂及其制备方法与应用，具体涉及一种食线虫性真菌颗粒制剂及其制备方法与应用。

背景技术

胃肠道线虫病是家畜最常见的寄生蠕虫病，呈全世界性分布，给畜牧产业造成严重的经济损失。长期以来主要依赖化学驱虫药来控制家畜胃肠道线虫，随着驱虫药的不断使用，线虫对驱虫药的抗药性不断地增强，以及造成环境污染、畜产品中化药的残留等问题。

捕食线虫性真菌是一类由营养菌丝特化形成捕食器捕捉线虫的真菌，它们是线虫的自然天敌，对线虫具有独特的捕获和致死能力，因此，利用食线虫真菌对家畜寄生线虫自由生活阶段的幼虫进行生物防治来替代化学驱虫剂是非常有潜力的防治手段。Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans是世界公认且经广泛研究的能够用于家畜寄生线虫病的最有希望的菌种之一，该菌由于在培养的中后期能够产生大量的厚垣孢子，其双层壁的厚垣孢子对酸碱和消化酶有耐受性，可在通过动物的胃肠道时存活下来。正是由于这个特性，厚垣孢子可通过口服给家畜，然后与产生的虫卵随粪便一起排出体外，温度适宜时虫卵发育孵化出幼虫，厚垣孢子也随之萌发成菌丝，进而由线虫的刺激产生三维粘性网杀死线虫。Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans已从我国6个省(自治区)得到分离，经对11株纯培养物的研究，发现我国分离株在形态和生物学特性与欧洲有差异，主要是表现为厚垣孢子产生快、而且量也大，最适生长温度为28℃，是优良的生物防治菌株。

目前，Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans在动物线虫寄生的生物防治上均进行了许多的研究，国内外已对捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans的菌丝团块或菌厚垣孢子制备成冻干制剂，但这些研究均处于实验室试验阶段，在临床应用中所面临的重要问题成本高、难以在将来规模化生产，且至今研究尚未解决生防制剂的批量化生产、规格化和有效含量的标准化问题。因此，在食线虫性真菌在动物寄生虫病防治中所面临的重要问题是，如何制备一种既能让家畜随草料口服，不被消化酶破坏；又能够在保存、运输等环节保持良好活性的、易于规模化生产、能在生产中方便应用、成本低的食线虫性真菌颗粒生物制剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种易于保存和运输、易于规模化生产、能在生产中方便应用、成本低的食线虫性真菌颗粒包裹食型生物制剂及其制备方法与应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种食线虫性真菌颗粒制剂，是将捕食线虫性真菌分离株进行厚垣孢子批量培养，然后0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱、过滤制成0.3～0.6×10⁶个/ml的孢子液，接着将孢子液与海藻酸钠水溶液制成0.8％～1.2％海藻酸钠-菌液混合液；然后滴入到钙盐溶液中反应时间1～2分钟，最后经真空干燥后制成。

进一步，所述捕食线虫性真菌分离株SDH035,属于鞭式节丛孢(Arthrobotrysflagrans)，保藏编号为CGMCCNO.11210，保藏日期为2015年8月31日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其简称为CGMCC；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种食线虫性真菌颗粒制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)孢子液的制备：将捕食线虫性真菌分离株在培养基(优选玉米-小麦联合谷粒培养基)上进行厚垣孢子批量培养15～45天，然后用0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱厚垣孢子，过滤(优选双层灭菌纱布过滤)，制成含厚垣孢子浓度为0.3～0.6×10⁶个/ml的孢子液；

(2)湿颗粒的制备：将孢子液与海藻酸钠水溶液按照体积比1:6～10混合均匀，制成0.8％～1.2％海藻酸钠-菌液混合液；然后滴入到钙盐溶液(优选葡萄糖酸钙、食品级CaCl₂或分析纯级CaCl₂，更优选葡萄糖酸钙)中反应时间1～2分钟；其中，每150ml海藻酸钠-菌液混合液滴完需8.5～11.5分钟；

(3)真空干燥：在室温至50℃(优选40℃)，真空度为0.082～0.085MPa条件才，真空干燥6～10小时，即得食线虫性真菌颗粒制剂。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种食线虫性真菌颗粒制剂在动物寄生线虫生物防治中的应用。

本发明海藻酸钠价格低廉，葡萄糖酸钙液体可循环利用，不需保护剂，从而大大降低成本；并且真空干燥能很好地降低在干燥时的对厚垣孢子的损伤；同时具有易于保存和运输、易于规模化生产、能在生产中方便应用的特点。

实验证明，本发明之食线虫性真菌颗粒制剂在体外对三期幼虫的杀虫率可达99.83％。

附图说明

图1为自制滴定装置。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：食线虫性真菌颗粒生物制剂的制备

(1)捕食线虫性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans分离株SDH035的分离、纯化、分离鉴定

SDH035于2014年8月，从来源于宁夏吴忠地区羊粪堆所采的5份样品中采用改良的平板撒布法分离，分离时在平皿中加入绵羊线虫第三期幼虫作诱饵25℃孵化，每天或隔天在倒置显微镜下检查一次，持续3周，挑出单个的捕食结构或被捕食的线虫，转接入0.2％麸皮琼脂25℃培养3～14天，待有分生孢子长出后，挑取单个的分生孢子于另一个0.2％麸皮琼脂平皿中直至获得纯培养物。通过玻片插入法获得该菌株分生孢子的形态和数据测量，并提取该菌种的DNA，用引物ITS1和ITS4(white等1990和campos等2010)进行扩增rDNA中5.8S、ITS-1和ITS-2序列。其结果从5份样品15份平皿中分离纯化获得SDH035菌种一株，形态学和分子学鉴定该菌与A.flagrans相一致。SDH035的形态特征为：在2％玉米粉琼脂中菌落为白色，菌丝较为稀疏，菌丝透明、分隔、分枝，当培养至7天时就可产生大量的厚垣孢子，而分生孢子相对很少；分生孢子梗透明、直立、分隔，长117.5～387.5(平均为241.59)μm，基部宽5～7.5μm，端部宽2.5～5μm；分生孢子呈卵圆形、长卵圆形和椭圆形，以1个分隔为主，偶有2个分隔或3～4个分隔，0个分隔的也时常可见；分生孢子长20～57.5(平均为38.89)μm、宽10～17(平均为12.87)μm。此外，当28℃培养在玉米与小麦粒联合培养基，3天即可产生大量的圆形性、椭圆形的厚垣孢子(可达到6×10⁴个/克)，直径15～30(平均25.8)μm。

SDH035的主要生理、生物学特征为：该菌在12℃～35℃范围内能生长，最佳生长温度为28℃；在pH为2～13范围内能够生长，最佳生长pH值为9～10；生长的相对湿度在90％～100％为最佳；该菌在水琼脂上产生厚垣孢子而不产生分生孢子；厚垣孢子能够耐受紫外线照射12小时；干燥能引起厚垣孢子的萌发率快速下降；厚垣孢子能够耐受40～50℃水浴处理1小时，但60℃水浴作用30分钟后仅个别萌发，60℃以上作用30分钟后不能萌发。该菌与绵羊三期幼虫和秀丽新杆线虫互作后，产生三维粘性网并捕捉线虫。

(2)将捕食线虫性真菌分离株SDH035在玉米-小麦联合谷粒培养基上进行批量培养15～45d，然后用0.05％灭菌吐温-80洗脱厚垣孢子，并用双层灭菌纱布过滤以除去一部分菌丝及大的杂质，制成的菌液用血细胞计数板计数，厚垣孢子浓度约为0.5×10⁶个/ml。

(3)利用海藻酸钠与Ca²⁺形成的凝集原理，将食品级海藻酸钠溶于蒸馏水中配成1.25％的溶液，然后按1:8的比例将含孢子的菌液加入1.25％海藻酸钠中，搅拌均匀，最终制成含有1％海藻酸钠的菌液混合液。用一个自行设计的装置(见图1)，将搅拌均匀的菌液混合液装入上面的漏斗中，漏斗用乳胶管连接一个“Y”型玻璃叉管，下接两个玻璃滴管，操作时将漏斗中的混合液一滴一滴地滴入到盛放葡萄糖酸钙(葡萄糖酸钙：分析纯，浓度0.1mol/L)的容器中(本试验用烧杯500～1000mL的烧杯)，在滴的过程中滴入的液滴立即变成了一颗颗大小均匀的小球(d≈0.34cm)；本装置150ml海藻酸钠-菌液混合液滴完需8.5～11.5分钟，生产量大时也可安装一个以上的该种装置。操作时在一杯葡萄糖酸钙中滴1～2分钟，然后立即用下一杯葡萄糖酸钙将上一杯替换掉，待上一杯葡萄糖酸钙静止1分钟，用不锈钢网勺将小球捞出，随之用蒸馏水冲洗，再倒入大的不锈钢网中，依次轮流作业，葡萄糖酸钙溶液可重复利用。湿颗粒制备完成后，将装有小球的不锈钢网放在报纸上，轻压，将其多余水尽可能吸掉，然后倒在过滤布上，最后转移到真空箱内，打开真空泵(真空度为0.082～0.085MPa)，调节温度至40℃，真空干燥6～10小时，干燥后的小球直经约为2mm。

实施例2：正交试验一

将海藻酸钠-菌液混合液滴入到Ca²⁺中的反应时间2min，5min，10min，Ca²⁺种类可选0.1mol/L葡萄糖酸钙，0.25mol/L食品级CaCl₂和0.25mol/L分析纯级CaCl₂)，海藻酸钠的用量为0.8％，1％，1.2％，吐温-80的量为0.05％，0.3％，1％，小球颗粒室温自然晾干的时间(氯化钙颗粒12h，16h，20h，葡萄糖酸钙颗粒最快晾干需16h，因此设计为16h，20h，24h)，这五个因素用L₁₈(3⁷)正交表做了五因素三水平的正交试验。干燥后的颗粒用8.7×10^-3mol/LKH₂PO₄和3.0×10^-3mol/LNa₂HPO₄缓冲液(pH7.7)溶解5～7h，将其稀释到1.5×10⁴个/ml厚垣孢子，吸取0.35～0.4ml涂布于水琼脂(WA)平板上25～26℃孵化，在孵化24h用打孔器取琼脂培养物置载玻片上用棉蓝染液染色逐一在光镜下观察计其厚垣孢子发芽数和不发芽数(直接将平皿置倒置显微镜观察，经试验很难得到较准确的计数结果)，根据预测样本容量大小公式：来预测样本容量，计数孢子总数要大于>2000个。另外经反复试验刚洗下的厚垣孢子24h时的发芽率一般在10％～20％，此后发芽率随时间延长而增加，但3d后由于菌丝交织，很难计数准确，5d发芽率也超不过60％，故试验中一律采用孢子孵化24h计算其发芽率。

L₁₈(3⁷)正交表、实验数据和发芽率见表1。实验结果用方差分析表明：Ca²⁺种类和晾干时间有极显著差异，海藻酸钠-菌液混合液滴入到Ca²⁺中的反应时间有显著差异。Ca²⁺种类方面，其发芽率：葡萄糖酸钙>食品级CaCl₂>分析纯级CaCl₂；晾干时间：越短越好(即CaCl₂最低需12h干燥，葡萄糖酸钙最低需16h干燥)；海藻酸钠-菌液混合液滴入到Ca²⁺中的反应时间：2min最好。

表1-L₁₈(3⁷)正交表和实验数据

注：钙离子时间：1：2min，2：5min，3：10min。钙离子种类：1：葡萄糖酸钙，2：食品级CaCl₂，3：分析纯级CaCl₂。海藻酸钠用量：1：0.8％，2：1％，3：1.2％。吐温80用量：1：0.05％，2：0.3％，3：1％。晾干时间：氯化钙颗粒，1：12h，2：16h，3：20h；葡萄糖酸钙颗粒，16h，20h，24h。

实施例3：正交试验二

将Ca²⁺种类为葡萄糖酸钙，食品级CaCl₂、海藻酸钠-菌液混合液滴入到Ca²⁺中的反应时间为2分钟，10分钟和小球颗粒室温自然晾干的时间为12小时，20小时，这三个因素用L₈(2⁷)正交表做了三因素三个互作二水平的正交试验，试验中孢子处理、孵化和发芽率计算方法同试验一。实验结果表明：这三因素之间互作效应不显著。因此，Ca²⁺种类选择葡萄糖酸钙，海藻酸钠-菌液混合液滴入到Ca²⁺中的反应时间选择2min。

实施例4：干燥方法试验

干燥条件为室温自然晾干，40℃温箱鼓风干燥，40℃真空干燥(真空度为0.082～0.085MPa)，含5％甘油的室温自然晾干，含15％β-环状糊精(AR)冷冻干燥和自然干燥，并用刚洗下的厚垣孢子为空白对照组，干燥结果见表2。由表2可知，40℃真空干燥和15％β-环状糊精冷冻干燥的发芽率相近，并和对照组相近；其它干燥方法均在6％以下，然而真空冷冻干燥成本高、干燥需要的时间长。因此，真空干燥(室温至50℃均可以)能够降低成本、节约干燥时间，可有利于今后规模生产。

表2不同干燥方法对发芽率的影响

	发芽数	不发芽数	总数	发芽率
					空白对照	324	2648	2972	10.90％
室温自然晾干	136	2527	2663	5.11％
					40℃温箱鼓风干燥	112	2307	2419	4.63％
40℃真空干燥	367	2738	3105	11.82％
					含5％甘油的室温自然晾干	45	3138	3183	1.41％
含15％β-环状糊精冷冻干燥	326	2587	2913	11.19％
					含15％β-环状糊精自然干燥	117	2644	2761	4.24％

实施例5：食线虫性真菌颗粒生物制剂的效果

将食线虫性真菌颗粒生物制剂加入到粉碎的玉米中空腹喂羊，羊的采食性很好。具体方法为，3-4月龄的当地绵羊，试验前驱虫，一周后用实验室先前分离保存的蛇形毛圆线虫三期幼虫(L3)人工感染，21d后以供试验。试验时将颗粒生物制剂拌入粉碎的玉米中，试验选用绵羊3只，每只羊大约食入2g颗粒制剂(即每千克体重5×105个厚垣孢子)，饲喂当天(约饲喂前后30分钟)收集粪便样品培养L3(记为t1),然后于饲喂后24h(记为t2)和96h(记为t3)收集粪便样品培养L3，每次取样时3个平行，按文献记载的方法进行粪便培养、分离L3和计算杀虫率，另据文献记载t1和t3由于粪便中无已服真菌可作为对照。

t1、t3代表对照组L3数量，t2代表试验组L3数量。试验重复2次，结果见表3。

表3颗粒制剂饲喂绵羊后对蛇形毛圆线虫L₃的捕杀效果

由表3可知，该菌制成颗粒后，杀虫性能良好，而且能够方便饲喂羊，成本低，易于保存运输，优于冻干制剂。

Claims

1.一种食线虫性真菌颗粒制剂，其特征在于，是将捕食线虫性真菌分离株进行厚垣孢子批量培养，然后0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱、过滤制成0.3～0.6×10⁶个/ml的孢子液，接着将孢子液与海藻酸钠水溶液制成0.8％～1.2％海藻酸钠-菌液混合液；然后滴入到钙盐溶液中反应时间1～2分钟，最后经真空干燥后制成。

2.根据权利要求1所述的捕食线虫性真菌冻干制剂，其特征在于，所述捕食线虫性真菌分离株SDH035的保藏编号为CGMCCNO.11210。

3.一种如权利要求1或2所述的食线虫性真菌颗粒制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)孢子液的制备：将捕食线虫性真菌分离株在培养基上进行厚垣孢子批量培养15～45天，然后用0.04％～0.06％的灭菌吐温-80洗脱厚垣孢子，过滤，制成含厚垣孢子浓度为0.3～0.6×10⁶个/ml的孢子液；

(2)湿颗粒的制备：将孢子液与海藻酸钠水溶液按照体积比1:6～10混合均匀，制成0.8％～1.2％海藻酸钠-菌液混合液；然后滴入到钙盐溶液中反应时间1～2分钟；其中，每150ml海藻酸钠-菌液混合液滴完需8.5～11.5分钟；

(3)真空干燥：在室温至50℃，真空度为0.082～0.085MPa条件下，真空干燥6～10小时，即得食线虫性真菌颗粒制剂。

4.根据权利要求3所述的食线虫性真菌颗粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养基为玉米-小麦联合谷粒培养基；所述过滤采用双层灭菌纱布过滤。

5.根据权利要求3或4所述的食线虫性真菌颗粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述钙盐溶液为葡萄糖酸钙、食品级CaCl₂或分析纯级CaCl₂。

6.根据权利要求5所述的食线虫性真菌颗粒制剂的制备方法，其特征在于，所述钙盐溶液为葡萄糖酸钙。

7.根据权利要求3～5之一所述的食线虫性真菌颗粒制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述真空干燥温度为40℃。

8.根据权利要求1或2所述的食线虫性真菌颗粒制剂在动物寄生线虫生物防治中的应用。