CN101305739A - 微孢子制剂及其生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包含有分离自车蝗体内的8年微孢子(P8)和9年微孢子(P9)的制剂及其制造方法。本发明的分离自车蝗体内的微孢子制剂可用于防治农田飞蝗、草原蝗虫、车蝗、竹蝗、稻蝗等的数十种蝗虫，本发明的制剂能显著提高防治蝗虫效果，防效稳定。
Description
技术领域
本发明涉及微孢子产品领域，具体涉及一种车蝗体内分离出来的微孢子的制剂以及其生产工艺。
背景技术
蝗灾是世界性的自然灾害，对农业生产造成了很大的影响。多年来，蝗灾曾发生过大面积的频繁暴发，包括农田飞蝗，草原蝗虫，稻蝗和林业棉蝗，竹蝗。仅农田飞蝗和草原蝗虫每年分别发生2000万亩次和6000万亩次，严重影响了农林业生产。从20世纪80年代美国采用双带蚱蜢和黑蝗作为繁殖宿主来培养蝗虫微孢子虫以外，国内外都陆续开展了蝗虫微孢子虫的研究。但是现有的蝗虫微孢子虫是从美国引进的，属于外来物种，应用后生态风险较大；此外，现有的蝗虫微孢子虫产品对蝗虫的专一性较低，防治效果不稳定，抗逆性较差，抗高温和紫外线能力弱，而且生产成本较高。因此有必要开发一种适用于本土使用且对草原蝗虫和农田飞蝗专一性强的品系，能显著提高防治蝗虫效果且防效稳定，同时又能低成本的生产和应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种包含有分离自车蝗体内的微孢子虫株系(Paranosema(Nosema)locustae)的制剂及其制备方法，该株系具有很强的特异性，分别对草原蝗虫和农田飞蝗具有特异性致死作用，致死效果较好。该微孢子制剂是从本土蝗虫体内分离出来，并且筛选出了分别对草原蝗虫和农田飞蝗专一性强的品系，能显著提高防治蝗虫效果，防效稳定。
本发明的分离自车蝗体内的微孢子虫株系(Paranosema(Nosema)locustae)，该株系孢子为裂殖生殖，大小约为2-7微米，抗逆性强，保藏号为CGMCC No.2282，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点在中国.北京.中关村，保藏时间2007年12月5日。
本发明的防治蝗虫的微孢子制剂，包含有上述分离自车蝗体内的8年微孢子(P8)和/或9年微孢子(P9)。
进一步地，所述制剂为水剂或饵剂。其中水剂中的微孢子浓度为5×108～2×1011孢子/毫升。
进一步地，所述饵剂中含有麸皮，海藻糖，比例为5×106～2×107孢子/克麦麸，0.01～0.1克海藻糖/公斤麦麸。
本发明的防治蝗虫的微孢子制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)孢子增殖
在飞蝗3龄期接种分离自车蝗体内的8年微孢子P8或分离自车蝗体内的9年微孢子P9，接种浓度为5×105，连续接种两次，再放入养虫室正常饲养，让孢子在蝗虫体内增殖；
2)孢子分离纯化
将感病蝗虫放入匀浆器内匀浆，用医用尼龙纱网过滤，用1500-2000转/分的速度离心15-20分钟，得到纯化的孢子；
3)制剂加工
按制剂配比配制制剂。
其中，制剂为水剂时，步骤3)中的配制制剂是将孢子液与蒸馏水充分混合，微孢子的浓度为5×108～2×1011孢子/毫升。
其中，制剂为饵剂时，步骤3)中的配制制剂是将孢子液与2mm大麸皮充分混合，搅匀，加入海藻糖配成，比例为5×106～2×107孢子/克麦麸，0.01～0.1克海藻糖/公斤麦麸。
与现有技术相比，本发明的微孢子制剂具有如下优点：
a.本发明的微孢子制剂是从本土的蝗虫体内跟踪比较筛选出来的，应用后对生态系统较少有干预作用。
b.本发明的微孢子具有很强的特异性，分别对草原蝗虫和农田飞蝗具有特异性致死作用，致死效果较好，如接种5×106孢子3周后草原蝗虫和农田飞蝗的死亡率分别达到95.27％和91.38％，远远大于现有的蝗虫微孢子虫的致病性。
c.本发明涉及的微孢子分别针对草原蝗虫和农田飞蝗的防治。草原蝗虫专用型微孢子具有抗紫外线、适合飞机防治和对草原蝗虫具有吸引作用等特点，对草原蝗虫防治效果较好；农田飞蝗专用型微孢子具有耐高温和对飞蝗具有吸引作用等特点，对飞蝗防治效果较好。
d.本发明的微孢子从车蝗体内分离出来，而非现有蝗虫微孢子虫是从黑蝗体内分离的
e.本发明的微孢子生产技术简单，匀浆后，2000转/分分离即可。本发明的微孢子制剂是从本土蝗虫体内分离出来，并且筛选出了分别对草原蝗虫和农田飞蝗专一性强的品系，能显著提高防治蝗虫效果，防效稳定；本发明的微孢子品系，经过抗逆性筛选和处理，显著提高了其抗逆性，特别是抗高温和抗紫外线能力大大提高；本发明微孢子生产技术要求简单，繁殖寄主容易得到，有助于大量生产和应用。
附图说明
图1是防后不同年份处理样区内飞蝗的感染情况。
图2是防后不同年份处理样区内云斑车蝗自然种群的感染情况。
图3是本发明的微孢子的培育工艺图。
图4是微孢子在1.5×1010/ha浓度时处理区的治理效果。
图5是微孢子7.5×1010/ha浓度时处理区的治理效果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
一、微孢子虫(Paranosema locustae)筛选：
1.供试品系
采用孢子分离接种法，对野外采集到的感病蝗虫进行分离、纯化，得到10个不同来源的微孢子品系，再分别接种到不同种类的蝗虫体内，蝗虫在合适条件下饲养。
2.虫源
虫源主要是飞蝗Locusta Migratoria和车蝗Gastrimargusmarmoratus。
3.实验种群
3.1实验室种群
采集于田间，并在实验室内饲养建立实验种群。饲养条件为温度28-35℃，相对湿度60-80％，光照12∶12。每天喂新鲜玉米苗。
3.2田间种群
在自然条件下，自然生长发育的种群。
4.接种
室内采用5×106浓度接种，田间采用2×109浓度喷施。
5.孢子分离纯化
将感病蝗虫匀浆，过滤后离心分离，得到孢子液，储藏备用
6.筛选
6.1孢子采集
其中，图1是防后不同年份处理样区内飞蝗的感染情况。图2是防后不同年份处理样区内云斑车蝗自然种群的感染情况。每年从田间采集感病蝗虫，并分离出其体内的微孢子，浓缩后储藏，作为室内实验接种孢子，测定其对蝗虫的毒性。
6.2毒力测定
6.2.1车蝗体内孢子毒力变异情况
从车蝗体内分离出的孢子对蝗虫的毒力分析结果如下的表1中。
表1
| 孢子类型(几年孢) | 1年孢 | 2年孢 | 4年孢 | 7年孢 | 8年孢 | 9年孢 | 10年孢 |
| 飞蝗 | 68.21fg | 65.49de | 78.37b | 69.21cd | 91.38a | 65.88ef | 71.28bc |
| 车蝗 | 58.39g | 71.22de | 81.21bc | 71.25cd | 81.78b | 95.27a | 69.32ef |
注：表内数据为接种微孢子后3周的死亡率，字母相同表示差异不显著，字母不同表示差异显著。
从表1可以看出第8年分离出的孢子对飞蝗具有较高的毒性，第9年分离出的孢子对车蝗有较好的控制作用。
6.2.2飞蝗体内孢子毒力变异情况
从飞蝗体内分离出的孢子对蝗虫的毒力分析结果示于如下表2中。
表2
| 孢子类型(几年孢) | 1年孢 | 2年孢 | 4年孢 | 7年孢 | 8年孢 | 9年孢 | 10年孢 |
| 飞蝗 | 88.31a | 85.24a | 88.55a | 89.49a | 91.08a | 87.64a | 91.25a |
| 车蝗 | 88.51a | 87.27a | 89.38a | 91.87a | 91.17a | 92.31a | 89.38a |
注：表内数据为接种微孢子后3周的死亡力，字母相同表示差异不显著，字母不同表示差异显著。
从表可以看出不同年份分离出的孢子对蝗虫毒性没有显著差异，孢子在飞蝗体内比较稳定。
所以采用车蝗体内分离出的8年孢子(P8)作为优势品系，防治飞蝗；采用车蝗体内分离出的9年孢子(P9)优势品系，防治土蝗(车蝗只是土蝗的一种)。经过美国微孢子专家Leellen鉴定，认为是微孢子(Paranosema(Nosema)locustae)新品系。孢子在飞蝗体内比较稳定，我们采用飞蝗作为繁殖这两种优势品系的寄主。该微孢子株系的孕育工艺流程图参见图3。
二、两种优势品系8年孢子(P8)和9年孢子(P9)的微孢子(Paranosema locustae)的生产工艺：
1.孢子增殖
在飞蝗3龄期接种P8或P9，接种浓度为5×105，连续接种两次，再放入养虫室正常饲养，让孢子在蝗虫体内增殖。
2.孢子分离纯化
将感病蝗虫放入匀浆器内匀浆，用医用尼龙纱网过滤，用2000转/分的速度离心20分钟，得到纯化的孢子。
3.孢子含量检验
采用医用血细胞计数板，在显微镜下计算出孢子数量和浓度，公式如下：
1mL孢子液中的总孢子数＝A/5×25×10000×B
A：5个中格的总孢子数
B：稀释倍数
4.制剂加工
将孢子液与水或者2mm大麸皮充分混合，搅匀，加入海藻糖，配成制剂，比例为5×106～2×107孢子/克麦麸，0.01～0.1克海藻糖/公斤麦麸。该用于防治蝗虫。
5.使用技术
蝗虫密度低时，直接施用微孢子制剂，蝗虫密度高时，微孢子制剂与昆虫生长调节剂卡死克交叉喷施，均可控制蝗害。在海南蝗区施用P8微孢子60ml/ha后4周，校正虫口减退率达95％以上，平均校正虫口减退率达到63.87％，单用微孢子，感染率最高的仍然是东亚飞蝗。具体数据参见表3。
表3
在草原蝗区施用P9微孢子后3周，校正虫口减退率达到70％以上，存活蝗虫的感病率最高达到60％以上。具体数据参见表4。且微孢子浓度在1.5×1010/ha和7.5×1010/ha时的治理效果图分别示于图4和图5中。
表4
尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书及附图所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1、一种防治蝗虫的微孢子制剂，包含有分离自车蝗体内的微孢子株系(Paranosema(Nosema)locustae)，该株系孢子为裂殖生殖，大小为2-7微米，保藏号为CGMCC No.2282，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点在中国.北京.中关村，保藏时间2007年12月5日。
2、如权利要求1所述的微孢子制剂，其特征在于，所述制剂为水剂或饵剂。
3、如权利要求2所述的微孢子制剂，其特征在于，水剂中的微孢子浓度为5×108～2×1011孢子/毫升。
4、如权利要求2所述的微孢子制剂，其特征在于，饵剂中含有麸皮，海藻糖，比例为5×106～2×107孢子/克麦麸，0.01～0.1克海藻糖/公斤麦麸。
5、一种防治蝗虫的权利要求1-4任一项所述微孢子制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)孢子增殖
在飞蝗3龄期接种分离自车蝗体内的8年微孢子(P8)或9年微孢子(P9)，接种浓度为5×105，连续接种两次，再放入养虫室正常饲养，让孢子在蝗虫体内增殖；
2)孢子分离纯化
将感病蝗虫放入匀浆器内匀浆，用医用尼龙纱网过滤，用1500-2000转/分的速度离心15-20分钟，得到纯化的孢子；；
3)制剂加工
按制剂配比配制制剂。
6、如权利要求5所述的方法，其中，制剂为水剂时，步骤3)中的配制制剂是将孢子液与蒸馏水充分混合，微孢子的浓度为5×108～2×1011孢子/毫升。
7、如权利要求5所述的方法，其中，制剂为饵剂时，制剂是将孢子液与2mm大麸皮充分混合，搅匀，加入海藻糖配成，比例为5×106～2×107孢子/克麦麸，0.01～0.1克海藻糖/公斤麦麸。
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