CN102321555B - 一株产杀/抗白蚁化合物的内生菌 - Google Patents
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Abstract
一株产杀/抗白蚁化合物的内生菌，涉及一株产杀/抗白蚁化合物的内生菌。本发明提供了一株产杀/抗白蚁化合物的内生菌，可以产杀/抗白蚁化合物，增加了能够发酵生产杀/抗白蚁化合物的微生物的数量，为利用内生菌生物发酵合成的代谢产物防治白蚁奠定了物质基础。本发明产杀/抗白蚁化合物的内生菌为枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 209162。本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47能够产杀/抗白蚁化合物，可以杀死或抑制白蚁。
Description
技术领域
本发明涉及一株产杀/抗白蚁化合物的内生菌。
背景技术
白蚁Termite属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫，是较为古老的社会性害虫。每年因白蚁危害建筑物和农作物所造成的经济损失达千亿美元以上。现有的杀灭白蚁的药剂均为化学药剂，故都有很大的毒副作用，造成严重的环境污染。利用生物技术开发具有高效、无毒、残效期长、对环境影响小的白蚁生物防治剂成为未来白蚁防治剂的主要方向。
白蚁等昆虫能消化木材中的木质纤维素，不是它们自身的本领，而是靠其后肠内的微生物的作用。白蚁若丧失了肠道中消化木质素和纤维素的微生物的作用，就会因为不能消化木材而死。研究者已经发现，美国路易斯安纳州的Juniperus virginiana和美国俄勒冈州的Chamaecyparis lawsoniana具有抗白蚁、抗腐蚀等特性，且从这两种树中分离到香榧醇、香柏酮等十多种具有抗白蚁作用的生物活性物质。据推测内生菌的基因可以和其寄生的树木基因相互传递，生活在植物体这一特殊环境中的内生菌能产生与宿主相同或相似的代谢产物，所以推测这类树的抗白蚁化合物可能由内生菌产生。另外，国外的研究也表明了植物内生菌的代谢产物对防治植物虫害具有潜在的应用和开发价值，所以从天然抗白蚁植物中筛选出可产生抗白蚁化合物的植物内生菌切实可行。目前，利用树木内生菌生物发酵合成的代谢产物防治白蚁在国内外尚未见有报道。
发明内容
本发明提供了一株产杀/抗白蚁化合物的内生菌，可以产杀/抗白蚁化合物，增加了能够发酵生产杀/抗白蚁化合物的微生物的数量，为利用内生菌生物发酵合成的代谢产物防治白蚁奠定了物质基础。
本发明产杀/抗白蚁化合物的内生菌为枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47(Bacillussubtilis subsp.virginiana subsp.nov HUB-I-47)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 209162；本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47革兰氏染色阳性，杆状，多呈单个存在或呈链状排列，菌体大小为(0.6μm～0.9μm)×(1.4μm～1.7μm)，无荚膜，产芽孢，芽孢椭圆中生，孢囊无明显膨胀，周生鞭毛，可运动，无伴孢晶体。枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈白色，近圆形，不透明，表面干燥、无光泽，无明显皱褶状突起，边缘不整齐，中心略突出。
本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47可厌氧生长，具有运动性，过氧化酶试验呈阳性，V.P试验呈阳性，吲哚试验呈阴性，硝酸盐还原试验呈阳性，明胶水解试验呈阳性，酪蛋白水解呈阳性，淀粉水解试验呈阳性，可利用柠檬酸盐，不可利用丙酸盐、尿素，不能水解酪氨酸和精氨酸，能够分解葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇产酸。可在含有20g/LNaCl、50g/L NaCl或70g/L NaCl的培养基中生长，可在含有0.001％(质量)溶解酵素的培养基中生长。
本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47(Bacillus subtilis subsp.virginiana subsp.novHUB-I-47)通过16S rDNA序列比对分析，与芽孢杆菌属(Bacillus)内各种之间有极高的同源性，同源性为99％以上。与参考菌株枯草芽孢杆菌AS1.1098(B.subtilis AS1.1098)和枯草芽孢杆菌Ki-2-132(B.subtilis Ki-2-132)相比，本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47的菌体大小明显小于参考菌株(参考菌株菌体大小为0.7μm～0.8μm×2.0μm～3.0μm，呈链状排列)，且枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47在培养过程中不产色素，而参考菌株在培养后期能够产生色素。本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47与参考菌株相比生长温度不同(参考菌株的最低生长温度为15℃、最高生长温度为50～55℃，最适生长温度为37℃)。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化试验和分子生物学鉴定结果确定枯草芽孢杆菌新亚种菌株HUB-I-47属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilissubsp.virginiana D.P.Zhou，K.Zhao，J.Liu et W.X.Ping，subsp.nov)。
本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47可在牛肉膏蛋白胨培养基上生长。枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47的最低生长温度为12℃、最高生长温度为47℃，最适生长温度为31℃。
本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47能够产杀/抗白蚁化合物，可以杀死或抑制白蚁。将枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养2～3d，取上清浓缩制得发酵液，发酵液能够很好的抑制白蚁体内共生菌，将浸泡发酵液的滤纸片喂食白蚁，可以杀死白蚁或抑制白蚁的活动。
本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47(Bacillus subtilis subsp.virginiana subsp.novHUB-I-47)属于枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilis subsp.virginiana D.P.Zhou，K.Zhao，J.Liu et W.X.Ping，subsp.nov)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 209162。
附图说明
图1为本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47放大20500倍的透射电镜照片；图2为本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47与GenBank中收录的相近菌株的16S rDNA所构建的系统发育树；图3为枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液提取物的GC-MS图谱。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式产杀/抗白蚁化合物的内生菌为枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47(Bacillus subtilis subsp.virginiana subsp.nov HUB-I-47)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 209162。
本实施方式枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47(Bacillus subtilis subsp.virginiana subsp.nov HUB-I-47)革兰氏染色阳性，杆状，多呈单个存在或呈链状排列，菌体大小为(0.6μm～0.9μm)×(1.4μm～1.7μm)，无荚膜，产芽孢，芽孢椭圆中生，孢囊无明显膨胀，周生鞭毛，可运动，无伴孢晶体。枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47放大20500倍的透射电镜照片如图1所示。枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈白色，近圆形，不透明，表面干燥、无光泽，无明显皱褶状突起，边缘不整齐，中心略突出。
参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47(Bacillus subtilis subsp.virginiana subsp.nov HUB-I-47)进行生理生化鉴定：枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47可厌氧生长，具有运动性，过氧化氢酶试验呈阳性，V.P试验呈阳性，吲哚实验呈阴性，硝酸盐还原试验呈阳性，明胶水解试验呈阳性，酪蛋白水解呈阳性，淀粉水解试验呈阳性，可利用柠檬酸盐，不可利用丙酸盐、尿素，不能水解酪氨酸和精氨酸，能够分解葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇产酸。
本实施方式枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47可在牛肉膏蛋白胨培养基上生长。其中牛肉膏蛋白胨培养基(1000mL)由3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g NaCl和余量的蒸馏水组成，调节pH值至7.0～7.2，于121℃灭菌30min。
本实施方式枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47的最低生长温度为12℃、最高生长温度为47℃，最适生长温度为31℃。
具体实施方式二：本实施方式枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47(Bacillus subtilis subsp.virginiana subsp.nov HUB-I-47)为北美圆柏(Juniperus virginiana)树皮中的内生细菌菌株，由北美圆柏Eastern-red-cedar(Juniperus virginiana)树皮中分离得到。分离方法按以下步骤进行：一、将Juniperus virginiana树皮先用无菌水冲洗(去掉树皮表面的尘土等杂质)，用无菌剪刀剪成1.5cm×1.0cm×0.5cm的小段，再用0.1％的升汞处理树木小段1～2min，倒掉升汞，用蒸馏水清洗3次除去残留的升汞；或者用75％乙醇处理树木小段3～4min，用蒸馏水清洗3次；二、把处理过的小木块接入水琼脂浸汁培养基中，3～5d分离培养基上长出菌；三、采用三区划线法把长出菌接种于含有制霉菌素的牛肉膏蛋白胨培养基平板上后在37℃条件下恒温培养2～3d；四、采用现有常规发酵方法和发酵条件进行发酵，通过对发酵液的抗菌活性和杀/抗白蚁活性分析，选取产杀/抗白蚁化合物的微生物，即得到本实施方式的枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47。
本实施方式所述水琼脂浸汁培养基的制备过程为：用灭过菌的解剖刀将5g红柏木材切成小块，加入100mL水煮沸30min，取20mL树木浸汁，加入15～20g琼脂，加水至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30min后，分装到培养皿内备用。
对分离得到的枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的总DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒(购自于大连宝生物工程有限公司)回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托上海生工生物技术有限公司测序。
枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47的16S rDNA序列长度为1468bp，其序列提交至GenBank获得的登录号为GQ892930，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，构建的系统发育树如图2所示，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与芽孢杆菌属(Bacillus)内各种之间有极高的同源性，同源性为99％以上。与参考菌株枯草芽孢杆菌AS1.1098(B.subtilisAS11098)和枯草芽孢杆菌Ki-2-132(B.subtilisKi-2-132)相比，本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47的菌体大小明显小于参考菌株(参考菌株菌体大小为0.7μm～0.8μm×2.0μm～3.0μm，呈链状排列)，且枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47在培养过程中不产色素，而参考菌株在培养后期能够产生色素。本发明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47与参考菌株相比生长温度不同(参考菌株的最低生长温度为15℃、最高生长温度为50～55℃，最适生长温度为37℃)。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilis subsp.virginiana D.P.Zhou，K.Zhao，J.Liu et W.X.Ping，subsp.nov)。
所述枯草芽孢杆菌AS1.1098(B.subtilis AS1.1098)购买自中国普通微生物菌种保藏中心，枯草芽孢杆菌Ki-2-132(B.subtilis Ki-2-132)来源于中国科学研究院遗传与发育生物学研究所。
PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其它试剂均购自于大连宝生物工程有限公司。
本实施方式枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液的制备方法为：将分离纯化所得的树木内生菌——枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃、100r/min的条件下细菌培养2～3d；将培养液以3500r/min离心分离10～15min，取上清液，倾入无菌锥形瓶，在无菌条件下，用旋转蒸发仪在40℃恒温水浴、150r/min条件下浓缩至其体积的十分之一，放入4℃冰箱中保存，即得到发酵液。
采用琼脂扩散法评价枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液对白蚁体内共生菌(指示菌)的抗菌活性，具体是参照Okeke et al.2001报道的方法进行，记载于Okeke，M.I.，C.U.Iroegbu，E N.Eze，A.S.Okoli，and C.O.Esimone.2001.Evaluation of extracts of the root ofLandolphia owerrience for antibacterial activity.J Ethnopharmacol.78：119-127(Okeke，M.I.，C.U.Iroegbu，E.N.Eze，A.S.Okoli，and C.O.Esimone.Landolphia owerrience根提取物的抗菌活性的评价.民族药物学杂志.2001，78：119-127)。实验结果表明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液对白蚁体内共生菌具有较好的抑制作用。
本实施方式枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液的杀/抗白蚁活性评价采用的白蚁饲喂试验，按如下方法进行：将枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液按0、2、10倍进行浓缩，用不同浓缩倍数发酵液分别浸泡滤纸(Whatman No.3，)，滤纸重量为1g、直径为8.5cm；同时，以用蒸馏水处理的滤纸作为对照。之后，将每片处理过的滤纸平铺在直径为9cm、高度为1.5cm的培养皿内，向滤纸片上放300只活白蚁，盖上培养皿盖。然后，将培养皿放在温度为26.5℃、相对湿度80％的培养箱内。定期向每个培养皿内滴水。通过计算白蚁死亡率分析菌株HUB-I-47发酵液抗白蚁活性，观察14d。试验结果(如表1所示)表明：菌株HUB-I-47发酵液能够杀死白蚁，菌株HUB-I-47发酵液的0、2、10倍浓缩液组白蚁死亡率均显著高于对照组白蚁死亡率(p＜0.05)，且菌株HUB-I-47发酵液的2、10倍浓缩液组在14d时白蚁死亡率为100％。菌株HUB-I-47发酵液的0、2、10倍浓缩液组第14d时白蚁死亡率差异不显著(p＞0.05)。本试验结果说明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液中含有杀/抗白蚁的化合物。
表1枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液抗白蚁活性
对枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液进行提取，具体过程为：枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液先经大孔树脂层析处理，得到粗提物；然后粗提物再用乙酸乙酯萃取(萃取方法为：25g粗提物加入500ml乙酸乙酯置于摇床上，150-180rpm/min，48h)；之后减压回收乙酸乙酯，得到浓缩物即为提取物，4℃保存。将提取物进行气相色谱-质谱联用，得到的GC-MS图谱如图3所示。由图3可知，枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47发酵液中含有化合物α-松油醇，目前已有研究报道证明α-松油醇能够杀死白蚁(McDaniel，C.A.1989.Major termiticidal components of heartwood of Port-Orford-Cedar，Chamaecyparis lawsoniana(A.Murr.)Parl.Material und Organismen.24：1-15美国扁柏心材的主要抗白蚁成分，物质与生物组织.McDaniel，C.A.，J.A.Klocke，and M.F.Balandrin.1989.Major antitermitic woodextractive components of Eastern Red Cedar，Juniperus virginiana.Material und Organismen.24：301-313.北美圆柏的主要抗白蚁树木提取物成分，物质与生物组织)，说明枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47能够产杀/抗白蚁的化合物。
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1.一株产杀/抗白蚁化合物的内生菌，其特征在于产杀/抗白蚁化合物的内生菌为枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 209162。
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