CN110042072A - 一种降解黄曲霉毒素b1的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，尤其涉及一种降解黄曲霉毒素B1的菌株及其应用。本发明的菌株具有高效降解黄曲霉毒素B1的作用，将其应用于发霉花生粕中，发酵3‑4天，降解率可达到90％以上，脱毒的花生粕中黄曲霉毒素B1含量低于国家限量标准。该菌株作为降解黄曲霉毒素B1的生物材料，可开发成生物脱毒剂，对饲料、养殖工业具有很好的应用前景。

Description

一种降解黄曲霉毒素B1的菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种降解黄曲霉毒素B1的菌株及其应 用。
背景技术
黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉、寄生曲霉等曲霉产生的次级代谢产 物，具有极强的致癌、致畸、致突变性。目前已鉴定出的黄曲霉毒素种类有 20多种，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强，1993年被国际癌症研究机 构(International Agency for Researchon Cancer,IARC)归为一级致 癌物。其危害的靶器官主要是肝脏，长期摄入会引起肝癌，并引发肾脏、胃 肠器官的癌变。
花生粕是提取花生油后的副产品，蛋白质含量达48％，是我国重要的植 物来源蛋白饲料。然而，花生粕在储存过程中极易污染黄曲霉毒素，在很大 程度上限制了其在饲料领域的应用。我国饲料卫生标准(GB13078-2017)规 定花生粕中黄曲霉毒素B1的限量标准为≤50μg/kg。传统的去除花生粕中黄 曲霉毒素的方法主要有物理法和化学法，包括吸附法、紫外线照射法、碱处 理法、臭氧法、氨化法等，但都存在效果差、营养损失大、适口性差等缺点。 近几年，生物脱毒法由于具有条件温和、提高产品营养和适口性好等特点逐 渐得到业内广泛认可。
目前用于花生粕生物脱毒的微生物主要有乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆 菌等。乳酸菌和酵母菌主要通过菌体对毒素的吸附作用，使毒素在通过胃肠 道时不被吸收，直接排出体外。这种吸附作用存在可逆性，在一定条件下会 解吸附，不是根本意义上的脱毒。枯草芽孢杆菌产生的酶对黄曲霉毒素有一 定的降解作用，但是脱毒效果不稳定且发酵产物适口性差，很难大规模应用。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种降解黄曲霉毒素B1的菌 株及其应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种降解黄曲霉毒素B1的菌株，其保藏编号为CGMCC No.17142。
本发明的第二个目的在于提供上述菌株CGMCC No.17142在降低发霉花 生粕中黄曲霉毒素B1的应用。
本发明的第三个目的在于提供上述菌株的分离方法，步骤如下：
(1)将采集自山东省莱阳市花生种植基地的土壤在无菌生理盐水中摇 床震荡10-20min，制备菌悬液；其中，土壤与无菌生理盐水的用量比为10g： (80-120)mL；
(2)将步骤(1)的菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释后，涂布在酵 母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，在35-40℃条件下培养24h；
(3)挑取平板上形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化，纯化后的 菌株采用黄曲霉毒素降解实验筛选，得到高效降解黄曲霉毒素B1的菌株 CGMCC No.17142。
其中，步骤(2)中所述的梯度稀释具体操作为：步骤(2)中所述的梯 度稀释具体操作为：取步骤(1)的菌悬液静置5min，取上层清液1mL，用 无菌生理盐水进行逐级稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取不同稀释 度的菌悬液，分别吸取100μL均匀涂布于培养基平板上。
本发明的第四个目的在于提供一种降解黄曲霉毒素B1的方法，将菌株 CGMCCNo.17142的培养液、菌悬液、发酵液或代谢产物，与含有黄曲霉毒素 B1的物料混合。
进一步，菌株CGMCC No.17142用于降低发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的 方法，步骤如下：
(1)将污染有黄曲霉毒素B1的花生粕粉碎，与麸皮按照重量比1: (0.1-0.15)混合，高压蒸汽灭菌；
(2)将菌株CGMCC No.17142接种于液体YPD培养基中，在35-40℃条 件下培养24h，作为菌种培养液；
(3)将步骤(2)的菌种培养液按照1-10％的接种量接入冷却后的花生 粕麸皮混合物料，调整料水比为1:(0.5-1)，混合均匀；在32-37℃条件 下发酵24h，在40-45℃条件下继续发酵24h，在48-53℃条件下继续发酵 24-36h；将发酵后的物料烘干、粉碎。
【生物保藏说明】
本发明所用的菌株，其保藏编号为CGMCC No.17142；生物材料：LH-F001； 分类命名：鲁梅利杆菌(Rummeliibacillus stabekisii)；已于2019年01 月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的有益效果是：
本发明的菌株具有高效降解黄曲霉毒素B1的作用，将其应用于发霉花生 粕中，发酵3-4天，降解率可达到90％以上，脱毒的花生粕中黄曲霉毒素B1含量低于国家限量标准。该菌株作为降解黄曲霉毒素B1的生物材料，可开发 成生物脱毒剂，对饲料、养殖工业具有很好的应用前景。
附图说明
图1示菌株LH-F001的平板培养性状；
图2示黄曲霉毒素标准品(5μg/kg)的高效液相图谱；
图3示发霉花生粕发酵前(上图)、后(下图)黄曲霉毒素B1的高效液 相图谱；
图4示不同发酵时间黄曲霉毒素B1的降解率。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1菌株LH-F001的分离与鉴定
一、菌株的分离纯化
(1)将采集自山东省莱阳市花生种植基地的土壤10g在100mL无菌生 理盐水中摇床震荡10-20min，制备菌悬液；
(2)取步骤(1)的菌悬液静置5min，取上层清液1mL，用无菌生理盐 水进行逐级稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取不同稀释度的菌悬液， 分别吸取100μL均匀涂布于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，在37℃条 件下培养24h；
(3)挑取平板上形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化，纯化后的 菌株采用黄曲霉毒素降解实验筛选，得到高效降解黄曲霉毒素B1的菌株，命 名为LH-F001。
将所得菌株LH-F001在YPD培养基上、在37℃条件下培养24h，见图1， 菌落呈圆形、半透明、边缘整齐。革兰氏染色镜检阳性，菌体有芽孢。
二、菌株的鉴定
提取LH-F001的总DNA，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将 扩增产物测序，经NCBI数据库同源序列比对分析，菌株LH-F001与Rummeliibacillus stabekisiistrain PP9(2016)(GenBank登录号为 CP014806.1)同源性为100％，判定该菌株为鲁梅利杆菌Rummeliibacillus stabekisii。
实施例2菌株LH-F001在降解黄曲霉毒素B1中的应用
一、菌种培养液
菌株LH-F001接种于液体YPD培养基中，在37℃条件下培养24h，作为 菌种培养液，用于后续黄曲霉毒素B1的降解实验。
二、菌株LH-F001用于降低发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的方法，步骤如 下：
(1)取180g污染有黄曲霉毒素B1的花生粕粉碎，加入20g麸皮，混合 均匀后置于1L烧杯中，高压蒸汽灭菌；
(2)将菌株LH-F001接种于液体YPD培养基中，在37℃条件下培养24h， 作为菌种培养液；
(3)将步骤(2)的菌种培养液以10％(v/w)的接种量接入冷却后的花 生粕麸皮混合物料，调整料水比为1:0.6，混合均匀，用8层纱布包裹烧杯 口；将烧杯置于培养箱中，在37℃条件下发酵24h，45℃条件下继续发酵24h， 在50℃条件下继续发酵36h；将发酵后的花生粕烘干、粉碎。
三、检测黄曲霉毒素B1
1、检测方法：称取样品20.00g，使用甲醇：水(体积比6:4)溶液进 行萃取，萃取液经免疫亲和柱净化提取后，用高效液相色谱(柱后碘液衍生) 对样品进行检测。
样品为黄曲霉毒素标准品(5μg/kg)、上述步骤(1)的污染有黄曲霉 毒素B1的花生粕、步骤(3)发酵后的花生粕、对照样品；其中，对照样品 为上述步骤(1)的污染有黄曲霉毒素B1的花生粕不接种菌株LH-F001，调 整料水比为1:0.6，混合均匀，用8层纱布包裹烧杯口；将烧杯置于培养箱 中，在37℃条件下发酵24h，45℃条件下继续发酵24h，在50℃条件下继续 发酵36h所得。
2、检测结果：
步骤(1)的污染有黄曲霉毒素B1的花生粕中黄曲霉毒素B1含量为 219.87μg/kg；步骤(3)发酵后的花生粕中黄曲霉毒素B1含量降低至 15.17μg/kg，降解率达93.1％；对照样品中黄曲霉毒素B1的含量为 197.88μg/kg。
高效液相色谱检测图谱及降解效果见图2、图3。
可见，脱毒后发酵花生粕中黄曲霉毒素B1含量远低于国家对饲料的限量 要求(≤50μg/kg)，适合应用于对发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的工业化脱 毒处理。
AFB1降解率(％)＝(发酵前原料AFB1含量-发酵后残留AFB1含量)/发酵 前原料AFB1含量×100。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种降解黄曲霉毒素B1的菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.17142。
2.一种权利要求1所述的菌株在降低发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的应用。
3.一种权利要求1所述菌株的分离方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将采集自山东省莱阳市花生种植基地的土壤在无菌生理盐水中摇床震荡10-20min，制备菌悬液；其中，土壤与无菌生理盐水的用量比为10g：(80-120)mL；
(2)将步骤(1)的菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释后，涂布在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，在35-40℃条件下培养24h；
(3)挑取平板上形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化，纯化后的菌株采用黄曲霉毒素降解实验筛选，得到权利要求1所述的高效降解黄曲霉毒素B1的菌株。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的梯度稀释具体操作为：取步骤(1)的菌悬液静置5min，取上层清液1mL，用无菌生理盐水进行逐级稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取不同稀释度的菌悬液，分别吸取100μL均匀涂布于培养基平板上。
5.一种降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的菌株的培养液、菌悬液、发酵液或代谢产物，与含有黄曲霉毒素B1的物料混合。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将污染有黄曲霉毒素B1的花生粕粉碎，与麸皮按照重量比1:(0.1-0.15)混合，高压蒸汽灭菌；
(2)将如权利要求1所述的菌株接种于液体YPD培养基中，在35-40℃条件下培养24h，作为菌种培养液；
(3)将步骤(2)的菌种培养液按照1-10％的接种量接入冷却后的花生粕麸皮混合物料，调整料水比为1:(0.5-1)，混合均匀；在32-37℃条件下发酵24h，在40-45℃条件下继续发酵24h，在48-53℃条件下继续发酵24-36h；将发酵后的物料烘干、粉碎。
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