CN110591987B

CN110591987B - 唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料

Info

Publication number: CN110591987B
Application number: CN201911058478.9A
Authority: CN
Inventors: 张新全; 关皓; 闫艳红; 李小铃; 帅杨; 冉启凡; 杨忠富; 聂刚; 汪霞; 黄婷; 李丹丹; 周冀琼; 马啸
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2039-11-01
Also published as: CN110591987A

Abstract

本发明公开了一种唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料；所述所述唾液乳杆菌358保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18232；所述唾液乳杆菌358可提高高温高湿地区青贮饲料的质量，所述唾液乳杆菌358处理的青贮饲料有氧稳定性较好，可降低pH、黄曲霉毒素B1和干物质损失，高温条件培养下，本发明唾液乳杆菌358生长和产酸无明显的迟缓期，能达到快速产酸以实现较低pH的效果。

Description

唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料

技术领域

本发明涉及农业技术领域，具体涉及唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料。

背景技术

青贮是在乳酸菌的厌氧发酵作用下将碳水化合物转化为有机酸，从而使pH降低达到长期贮存的目的。乳酸菌和温度是青贮饲料发酵品质好坏的决定性因素。

自然青贮就是利用自然界植物上存在的乳酸菌进行发酵，由于自然界植物上的乳酸菌含量少，仅占细菌总数的0.01～1％。所以在发酵过程中，乳酸菌很难迅速的形成优势菌群，不能在短时间内降低pH值。其结果：一是各种细菌都在生长繁殖使温度迅速上升，造成预备发酵期延长。二是预备发酵过程中，青贮料因发热造成大量的营养成分和能量的损失，还造成气味刺鼻、适口性差的状况。三是在发酵过程中霉菌和腐败菌的大量繁殖，造成青贮料局部发霉和腐烂，特别是顶部、底部和边沿霉变、腐烂情况严重。四是由于有大量的杂菌存在，在青贮料开窖时，很容易形成二次发酵，在取食截面上新发生霉斑或者成片发霉，情况不好时会造成彻底霉变、腐烂。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料；所述唾液乳杆菌358可提高高温高湿地区青贮饲料的质量，所述唾液乳杆菌358处理的青贮饲料有氧稳定性较好，可降低pH、黄曲霉毒素B1和干物质损失，高温条件培养下，本发明唾液乳杆菌358生长和产酸无明显的迟缓期，能达到快速产酸以实现较低pH的效果。

为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种唾液乳杆菌358，所述唾液乳杆菌358(Lactobacillus salivarius)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.18232，保藏日期为2019年07月16日。

上述唾液乳杆菌358的16srDNA如SEQ ID NO.1所示:

GGGTGCTATACATGCAGTCGAACGAAACTTTCTTACACCGAATGCTTGCATTCACCGTAAGAAGTTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTAAAAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATATCTCTAAGGATCGCATGATCCTTAGATGAAAGATGGTTCTGCTATCGCTTTTAGATGGACCCGCGGCGTATTAACTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGTGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACACGAGTGAGAGTAACTGTTCATTCGATGACGGTATCTAACCAGCAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGTAGTGCATTGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACCTAAGAGATTAGGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTGTCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCGCAAGGAGCTCAGCCGTC。

本发明还提供了一种青贮饲料添加剂，所述青贮饲料添加剂的活性成分为上述的唾液乳杆菌358。

优选的，所述青贮饲料添加剂为玉米青贮添加剂。

优选的，所述青贮饲料添加剂为降低青贮饲料pH值的青贮饲料添加剂。

优选的，所述青贮饲料添加剂为高温条件下，快速降低青贮饲料pH值的青贮饲料添加剂。

本发明还提供了一种青贮饲料，所述青贮饲料中含有上述的贮饲料添加剂。

优选的，所述青贮饲料为玉米青贮饲料。

优选的，所述青贮饲料由包括以下步骤的制备方法制备得到：

将权利要求1所述的唾液乳杆菌358和玉米混合，发酵，得到所述青贮饲料。

优选的，所述发酵过程发酵温度为20℃～45℃。

优选的，所述发酵过程发酵条件为温度20℃～45℃，湿度80-85％的黑暗环境中。

本发明还提供了上述唾液乳杆菌358在如下任意一种中的应用：

(a1)制备青贮添加剂；

(a2)制备青贮饲料。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：

本发明选择了从玉米中分离得到的唾液乳杆菌358可有效地提高高温高湿地区青贮饲料的质量。在中国四川地区研究了它们对全株玉米发酵、有氧稳定性和黄曲霉素B1生产的影响。根据生理、生化特征和16S rRNA测序分析，鉴定为唾液乳杆菌。

发酵60天后，唾液乳杆菌358处理青贮饲料中可降低pH和LA/AA，减少DM损失，提高粗蛋白含量。与唾液乳杆菌标准菌株相比，青贮60天时本发明唾液乳杆菌358AFB1浓度更低，暴露于空气5天后，与副干酪乳杆菌标准菌株相比，本发明唾液乳杆菌358AFB1浓度也更低。在高温高湿的条件下有氧暴露5天后对酵母，细菌和大肠杆菌计数结果较优，因此，在青贮料开窖时，采用唾液乳杆菌358AFB1处理的青贮饲料可一定程度上避免二次发酵。

本发明唾液乳杆菌358耐高温性和耐酸性佳，对环境的适应性佳。

在高温(45℃)条件培养下，本发明唾液乳杆菌3588h时生长速率达到最大，产酸速率达到最大，从10h开始进入稳定期，无明显的迟缓期，唾液乳杆菌358能达到快速产酸以实现较低pH的效果。

本发明唾液乳杆菌358可作为热带和亚热带地区青贮饲料的候选菌株，应用于制备青贮添加剂、制备青贮饲料。

附图说明

图1为本发明唾液乳杆菌358的光学显微镜图；

图2为实施例2构建的系统发育树；

图3为实施例4接种菌株的玉米青贮饲料的有氧稳定性情况；

图4为实施例4中青贮60天和有氧暴露5天后黄曲霉毒素(AF)B1浓度情况；

图5为实施例4中37℃培养条件下乳酸菌生长曲线；

图6为实施例4中45℃培养条件下乳酸菌生长曲线；

图7为实施例4中37℃培养条件下乳酸菌产酸曲线曲线；

图8为实施例4中45℃培养条件下乳酸菌生长曲线。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种唾液乳杆菌358，所述唾液乳杆菌358(Lactobacillus salivarius)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.18232，保藏日期为2019年07月16日。

实施例1

一、菌株的分离筛选

1、原料：

玉米：乳熟期的全株玉米(来自三个品种：雅玉8号、中单808号和多玉3号)；

杂交狼尾草：在高度大于1.5m时收获的杂交狼尾草(桂牧一号)

MRS液体培养基:将原料(表1)溶解于1L蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，冷却后备用。

MRS固体培养基:将原料(表1)溶解于1L蒸馏水中，添加15g琼脂，倒在一次性使用培养皿中，121℃高压灭菌15min，冷却后备用。

表1培养基原料

2、青贮样品：

玉米青贮样品：乳熟期的全株玉米(来自三个品种：雅玉8号、中单808号和多玉3号)在大窖中发酵(按青贮条件：温度35-45℃，湿度80-85％，来模拟中国西南高温高湿地区)确认两个月后取样；

杂交狼尾草青贮样品：在高度大于1.5m时收获的杂交狼尾草(桂牧一号)裹包青贮(按青贮条件：温度35-45℃，湿度80-85％，来模拟中国西南高温高湿地区)确认三个月后取样。

3、菌种的稀释：

青贮样品中分别称取20g于180mL无菌蒸馏水中在4℃下震荡1h，再在无菌蒸馏水中连续稀释10^-1至10^-7，分别取10^-3，10^-5，10^-7倍样品稀释液涂布在固体MRS培养基上。

4、菌株的初筛：

在液体MRS培养基(陆桥科技有限公司，北京，中国)中37℃培养48h后，对乳酸菌进行分离，为了确保更真实的反应原料和青贮中乳酸菌群落结构，从每种样品固体MRS培养基中随机抽取20-40株菌株，共收集251株菌。通过革兰氏染色和过氧化氢酶试验确定其中227株为乳酸菌，将227株乳酸菌放入加有甘油的保藏管中-20℃保存。

5、菌种的复筛：

初筛得到的227株乳酸菌首先放置于MRS液体培养基中37℃培养，在12h和24h时测其OD(600nm)及pH，筛选出生长效率最高、产酸能力最强的30株菌。

6、最优菌种的筛选：

再将初筛出的30株菌放置于液体MRS培养基中45℃培养，在12h和24h测其OD及pH。

7、筛选结果：

12h:

b.唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius358(XH358)：OD＝0.794，pH＝4.02的一株乳酸菌；

c.鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus753(XH753)：OD＝1.241(生长效率最高)、pH＝3.62(产酸能力最强)的一株乳酸菌；

d.副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei761(XH761)：OD＝1.034，pH＝4.4的一株乳酸菌。

24h:

b.唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius358(XH358)：OD＝1.164，pH＝3.78的一株乳酸菌；

c.鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus753(XH753)：OD＝1.587(生长效率最高)、pH＝3.69(产酸能力最强)的一株乳酸菌；

d.副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei761(XH761)：OD＝1.222，pH＝3.88的一株乳酸菌。

实施例2

二、菌株的鉴定

DNA的提取

唾液乳杆菌358于37℃MRS培养基5mL中过夜培养，10000g下离心5min，用TE缓冲液(10mmol L-1tri-hcl,0.1mmol L-1EDTA,pH8.0)在干净的15mL微离心管中洗涤细胞2次，并再离心。DNA提取采用TIANamp细菌DNA试剂盒(DP302-02,Tiangen Biotech Co.,Ltd.,Beijing,China)按照制造商的说明书进行。采用紫外-可见分光光度计(上海阳光恒平科学仪器有限公司，上海)在260nm处测定菌株的DNA浓度。菌株提取的DNA在使用前保存在-20℃。

16S rRNA物种鉴定

对16S rDNA编码区进行PCR扩增。1μL稀释的DNA作为模板的PCR反应。PCR引物为27f(5'-AGAGTTTGA TCC TGG CTCAG-3')和1492r(5'-tacggctac CTT GTT ACG ACT-3')。PCR反应是在装有25μL反应混合物的0.2mL微型离心机管中进行的，所有PCR试剂均来自天根生化科技有限公司。用无菌蒸馏水将引物27f(0.4mmolL^-1)和引物1492r(0.4mmol L^-1)填充到25μL。PCR方法如下:95℃下处理5分钟,紧随其后的是30次的94℃变性30秒,引物在55℃下退火1分钟,72℃延伸15分钟，72℃保温10分钟。用1.5％琼脂糖凝胶电泳在1×TBE缓冲液中分析1mL反应混合物样品。用溴化乙锭对凝胶进行染色，在紫外照射下条带可见。PCR产物按照制造商的说明(Promega,Madison,WI,USA)使用DNA纯化系统进行纯化。使用3730xlDNA分析仪(美国旧金山应用生物系统公司)对产品进行1.5kb 16S rDNA(唾液乳杆菌358的16S rRNA基因序列已存入GenBank，序列号为MH33326)序列分析。

利用BLAST分析方法，将16S rDNA序列与GenBank的16SrRNA序列进行比对，鉴定有机体。来自代表性有机体的序列信息被引入CLUSTALW程序。将分离株的16S rRNA基因序列与GenBank LAB类型菌株的序列进行比较。

计算核苷酸取代率，通过邻接法构建系统发育树(Nei和Saitou,1987)。使用CLUSTALW软件对1000个随机重采样的序列数据进行bootstrap分析，评估系统发育树的拓扑结构。以枯草芽孢杆菌NCDO1769为外群。

图2系统发育树显示了唾液乳杆菌358的相对位置，由完整16S rDNA序列的邻接法推断得到。1000次复制的引导值显示在树的节点上。枯草芽孢杆菌用作外群。通过系统发育树可以看出唾液乳杆菌358和唾液乳杆菌358亲缘关系最近。

唾液乳杆菌358(Lactobacillus salivarius)6SrDNA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，存入GenBank，序列号为MH33326。

实施例3

三、唾液乳杆菌358(Lactobacillus salivarius)(青贮玉米，青贮饲料添加剂、青贮饲料的制备

青贮原料：四川农业大学试验农场(中国四川崇州)试验田收获处于乳熟期的全株玉米

试验材料:试验材料包括3株筛选出的乳酸菌菌株、4株乳酸菌标准菌株、1株商业植物乳杆菌(LPC)和1株商业鼠李糖乳杆菌(LRC)，2株商业菌株购自四川高福记生物科技有限公司。

(1)筛选出的3株乳酸菌

b.唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius358(XH358)；

c.鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus753(XH753)；

d.副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei761(XH761)。

(2)4株乳酸菌标准菌株

a'.植物乳杆菌Lactobacillus plantarum(LP)；

b'.唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius(LS)；

c'.鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus(LR)；

d'.副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei(LPA)。

分别采用上述XH753(鼠李糖乳杆菌753，保藏编号CGMCCNo.18233)；XH358(唾液乳杆菌358，保藏编号CGMCCNo.18232)、XH761(副干酪乳杆菌761，保藏编号CGMCCNo.18234)；LP(保藏编号CGMCC1.2437)；LS(保藏编号CGMCC1.1881)；LR(保藏编号CGMCC1.120)；LPA(保藏编号CGMCC1.2435)；市售乳酸菌LAB接种剂LPC(中国四川成都高福集)作为青贮饲料接种剂。

每种接种剂溶解在无菌蒸馏水中，得到青贮饲料添加剂，使每克鲜样(FM，青贮原料)有10⁸有效活菌(cfu)，玉米(青贮原料)切碎后(1-2cm)统一将青贮饲料添加剂喷洒在上面，得到青贮饲料；每100g青贮饲料中需要加入3mL青贮饲料添加剂。并喷洒等量的蒸馏水作为对照。将1公斤玉米装入真空密封聚乙烯塑料袋中。每种处理方法重复三次，储存模拟高温高湿的黑暗环境中(温度35-45℃，湿度80-85％)，经过60天青贮后，打开各处理样品，分析其化学成分、发酵质量、微生物群落和有氧稳定性。

实施例4

四、青贮饲料的检测

1、化学和发酵分析

将青贮前和青贮后的全株玉米在65℃的烘箱中干燥72h，以测定干物质(DM)的含量。干燥后的样品经过1mm威利研磨筛进行化学分析。粗蛋白(Avila等，2009)含量采用凯氏定氮法(AOAC,1990)测定。中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)按照制造商的说明(美国纽约州费尔波特市Ankom技术公司)使用Ankom200系统进行分析，并使用亚硫酸钠和α-淀粉酶进行NDF分析，水溶性碳水化合物(WSC)采用色雷斯酮硫酸法(AOAC，1990年)测定。以20克青贮饲料为原料，在工业搅拌机中加入180mL蒸馏水，匀浆1分钟，制得青贮饲料水提液。用便携式pH仪(PHSJ-5；中国上海LEICI)。滤液在4℃下12000×g离心10min,上清液通过0.22μm膜过滤器过滤后使用配有紫外检测器(210nm)和色谱柱(KC-811,日本岛津公司有限公司,京都,日本)的高效液相色谱法(HPLC)进行有机酸分析。流动相为0.1％H₃PO₄，流速为0.5mL/min，温度为55℃。为测定NH₃-N含量，在4mL滤液中加入1mL三氯乙酸(TCA)，4℃过夜以沉淀蛋白。然后以12,000×g离心15min，用上清液进行NH₃-N分析(Weatherburn,1967)。测定在37℃和45℃时，对不同糖源的利用能力。

2、微生物分析

以青贮60天打开袋子得到的青贮饲料为样品，采用平板计数法对青贮饲料微生物组成进行了分析。取20g样品，用180mL无菌生理盐水(0.85％NaCl)在搅拌机中匀浆1min。对部分进行从10^-1到10^-10的连续稀释。用LAB专用的MRS琼脂(中国北京陆桥CM 188)对LAB数量进行了计数，在厌氧条件下37℃培养48小时。在37℃有氧条件下培养24小时，用结晶紫中性红胆盐琼脂(中国北京陆桥CM 115)对大肠菌群进行计数。霉菌和酵母菌在马铃薯葡萄糖琼脂(中国北京陆桥CM 123)上计数，在25℃下培养4天。

3、有氧稳定性

以青贮60天打开袋子得到的青贮饲料为样品，将约800g样品放入单独的2L绝缘容器中(每种处理三个重复)，覆盖2层粗棉布，并存放在温度35-45℃、湿度80-85％的黑暗环境中5天。用数据记录器(中国深圳神华科技有限公司，MT-X)插入青贮饲料中10cm处，每隔5分钟测量温度。用有氧暴露前后青贮饲料的重量计算DM的损失。同时监测环境温度和每个容器中的温度5天。每个容器的内容物在5天的有氧暴露后充分混合和取样，以分析发酵质量(20g)和微生物(20g)。根据Ranjit和Kung(2000)计算有氧稳定性，以有氧暴露青贮饲料的温度超过基准环境温度2℃前的小时数为准。

4、黄曲霉毒素B1化验

根据Dogi等人(2013年)和Shimsoni等人(2013年)的方法将总共2g研磨样品称重至50ml聚丙烯管中，并用10ml溶剂混合物覆盖，该溶剂混合物包含乙腈/水/乙酸(79:20:1，v/v/v)。样品放置5分钟，以10000×g离心10分钟，通过0.22μm膜过滤器过滤上清液，通过高效液相色谱柱(Cloversil ODS-C18，150×4.6mm，5μm粒径)进行AFB1分析。流动相(水：乙腈：甲醇，4:1:1)以1.5ml min^-1泵送，柱温30℃，注入量20μl，滞留时间约5min，检测器为荧光检测器，激发波波长360nm，发射波波长440nm。

5、菌株在不同温度的生长特性测定

将活化好的各菌株制备菌液，利用U-2910紫外可见光分光光度计定菌数至10⁸cfu·ml^-1，每组设置3个重复。

耐温性试验：将菌液接种入MRS液体培养基中，接种比例按照体积分数3％为标准，分别置于4、10、20、30、40、45、50℃培养箱中培养72h，测定其液体培养基OD值。

6、耐盐试验与耐酸碱试验

耐盐试验：

MRS液体培养基中加入NaCl，将菌液分别接种入NaCl体积分数不同的MRS液体培养基中，其NaCl体积分数为3.0％和6.5％，按照温度分为两组，分别在37℃和45℃的培养箱中培养72h后，测定液体培养基OD值。

耐酸碱试验：

将HCl溶液和NaOH溶液进行无菌处理，以此调整MRS液体培养基的pH，将菌株分别接种入pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的MRS液体培养基中，分为两组，分别放置在37℃和45℃的培养箱中，培养72h后测定液体培养基OD值。

OD值与生长状况对应情况如表2所示。

表2 OD值与生长状况

7、数据分析

采用社会科学统计软件包(SPSS Version 19.0,SPSS Inc.，Chicago,IL,USA)的GLM程序进行统计分析。采用单因素方差分析法(ANOVA)，对发酵过程中的化学成分、发酵特性、微生物计数、a-曲霉毒素b1和好氧稳定性进行了分析。采用Turkey诚实显著性差异(HSD)检验对不同的样本均值进行检验，p<0.05为显著。

7.1青贮饲料中乳酸菌的特性

表3

表中，+，90％及以上菌株有活性或显阳性；-，90％及以上菌株无活性或显阴性；W.有微弱活性；Homo，同型发酵菌株；Hetero，异型发酵菌株；LPC，植物乳杆菌商业品系；

XH：宣汉黄津肉牛农场，四川达州。

6.2青贮饲料中分离的乳酸菌菌株的碳水化合物发酵结果

在37℃时糖发酵特征见表4。

表4 37℃培养乳酸菌糖发酵特性

在45℃时糖发酵特征见表5。

表5 45℃培养乳酸菌糖发酵特性

表中+，90％及以上菌株可发酵该物质；-，90％及以上菌株不可发酵该物质；W.可发酵少量该物质；LP，植物乳杆菌CGMCC 1.2437T；LS，唾液乳杆菌CGMCC1.1881T；LR，鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.120T；LPA，副干酪乳杆菌CGMCC 1.2435T；LPC，植物乳杆菌商业品系；T＝菌株类型。

由表4和表5，可知，本发明唾液乳杆菌358(Lactobacillussalivarius)和标准唾液乳杆菌LS相比，株对不同糖源的利用能力有所差异，且在45℃培养时，本发明相对于标准菌株副干酪乳杆菌LPA可实现对阿拉伯糖和木糖的发酵。

7.3玉米青贮前的化学成分、微生物组成及黄曲霉毒素B1含量

青贮原料，鲜切整粒玉米含有28.38％的DM，CP、NDF、ADF和WSC的浓度分别为5.93％、52.15％、30.53％和17.77％。AFB1的浓度为1.03μg/kg DM。LAB、大肠杆菌、酵母菌和霉菌的数量分别为饲料的4.37、7.34、5.13和1.27log₁₀ cfu g^-1。具体见表6。

表6

条目	玉米
		DM含量(％)	28.38
pH值	5.78
		粗蛋白(％DM)	5.93
中性洗涤纤维(％DM)	52.15
		酸性洗涤纤维(％DM)	30.53
水溶性碳水化合物(％DM)	17.77
		黄曲霉毒素B1(μgkg<sup>-1</sup>DM)	1.03
乳酸菌(log<sub>10</sub>cfug<sup>-1</sup>FM)	4.37
		大肠杆菌log<sub>10</sub>cfug<sup>-1</sup>FM)	7.34
酵母(log<sub>10</sub>cfug<sup>-1</sup>FM)	5.13
		霉菌(log<sub>10</sub>cfug<sup>-1</sup>FM)	1.27

DM,干物质；FM,鲜料；cfu,活菌落数.

7.4高温高湿条件下青贮60天打开袋子得到的玉米青贮饲料的化学成分、发酵特性及微生物计数结果

结果见表7。

高温高湿条件为：温度35-45℃，湿度80-85％，来模拟中国西南高温高湿地区。

表7

表中^a-f数据均为三个样本的均值，均值在同一列后不同字母有差异(P<0.05)。

FM,鲜料；DM,干物质，NDF:中性洗涤纤维，ADF:酸性洗涤纤维，WSC:水溶性碳水化合物，LA/AA：乳酸/乙酸，LAB，乳酸菌；ND:未测得，NA:不可测；LP，植物乳杆菌CGMCC1.2437T；LS，唾液乳杆菌CGMCC 1.1881T；LR，鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.120T；LPA，副干酪乳杆菌CGMCC 1.2435T；LPC，商业植物乳杆菌；T＝菌株类型；SEM(标准误差)。

由表7可知，本发明唾液乳杆菌358可降低pH和LA/AA，减少DW损失，提高粗蛋白含量。

7.5高温高湿条件下5天的有氧暴露后的玉米青贮饲料pH值、DM损失及微生物计数结果。

结果见表8。

高温高湿条件下5天的有氧暴露是在高温高湿条件下青贮60天后进行。

表8

DM,干物质；LAB，乳酸菌；LP，植物乳杆菌CGMCC 1.2437T；LS，唾液乳杆菌CGMCC1.1881T；LR，鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.120T；LPA，副干酪乳杆菌CGMCC 1.2435T；LPC，植物乳杆菌商业品系；T＝菌株类型；SEM(标准误差)。

所有青贮饲料的霉菌、酵母和大肠杆菌菌落在青贮后急剧减少。LAB菌株在发酵中为优势种，范围从6到7log₁₀ cfu g^-1 FM。酵母保持在FM的2log₁₀ cfu g^-1以下，所有青贮饲料中的霉菌和大肠菌群均未检测到。

7.6高温高湿条件下接种菌株的玉米青贮饲料的有氧稳定性

结果见图3

图3中，^a-e数据均为三个样本的均值，均值在同一列后不同字母有差异(P<0.05)。LP，植物乳杆菌CGMCC 1.2437T；LS，唾液乳杆菌CGMCC 1.1881T；LR，鼠李糖乳杆菌CGMCC1.120T；LPA，副干酪乳杆菌CGMCC 1.2435T；LPC，植物乳杆菌商业品系；T＝类型菌株。

分析表7、8和图3，本发明唾液乳杆菌358处理的青贮饲料表现出较好的有氧稳定性，有氧稳定性明显优于唾液乳杆菌标准菌株；且唾液乳杆菌标准菌株相比，青贮饲料中具有最更高的LAB和最更的酵母和大肠菌群数量。

6.7高温高湿条件下青贮60天和青贮60天后有氧暴露5天后黄曲霉毒素(AF)B1浓度

结果见图4

图4^a-g数据均为三个样本的均值，均值在同一列后不同字母有差异(P<0.05)。LP，植物乳杆菌CGMCC 1.2437T；LS，唾液乳杆菌CGMCC 1.1881T；LR，鼠李糖乳杆菌CGMCC1.120T；LPA，副干酪乳杆菌CGMCC 1.2435T；LPC，植物乳杆菌商业品系；T＝类型菌株。

图4显示了60天青贮和5天暴露于空气后的AFB1浓度。与新鲜饲料(1.03μg kg^-1DM)相比，所有样品的AFB1在青贮期间和空气暴露期间均增加，在空气暴露5天后观察到更高的值。与唾液乳杆菌标准菌株相比，青贮60天时本发明唾液乳杆菌358浓度更低，暴露于空气5天后，与唾液乳杆菌标准菌株相比，本发明唾液乳杆菌358AFB1浓度也更低。

7.8耐温性特征

表9 耐温性特征

本发明唾液乳杆菌358在20℃～45℃培养条件下生长良好，有较好的耐温性。

7.9耐盐性和耐酸碱性

37℃培养条件下耐盐性和耐酸碱性特征见表10

表10 耐盐性和耐酸碱性特征(37℃)

37℃培养条件下，本发明唾液乳杆菌358可在NaCl浓度为3.0％和pH3.5-7.5之间的液体培养基生长良好，本发明唾液乳杆菌358耐酸性佳，明显优于标准菌株唾液乳杆菌LS。

45℃培养条件下耐盐性和耐酸碱性特征见表11

表11 耐盐性和耐酸碱性特征(45℃)

与37℃相比，45℃培养条件下，乳酸菌菌株表现出对环境不同的耐性特征，而本发明唾液乳杆菌358在NaCl浓度为3.0％和pH3.5-7.5之间的液体培养基任生长良好，45℃培养条件下，本发明副干酪乳杆菌761耐高温性较好，耐酸性佳。

7.10菌株生长速度

测定37℃、45℃培养条件下乳酸菌菌株OD值，结果见图5、6。

图5为37℃培养条件下乳酸菌生长曲线，图6为45℃培养条件下乳酸菌生长曲线。

从图5和图6可知，与标准菌株相比较，筛选得到的3株乳酸菌菌株，唾液乳杆菌358，鼠李糖乳杆菌753，副干酪乳杆菌761的生长曲线在37℃和45℃有着不同的表现。在37℃时，3株乳酸菌从培养10h开始生长速度达到最大，约20h生长进入稳定期。菌株XH358、XH753和XH761发酵20h的OD值分别为0.904、1.438和1.373。24h内XH753的生长速度最快且较稳定，XH761生长速度较快，XH358的生长速度最慢。在45℃时，与标准菌株相比，3株菌株的生长情况均更加良好。XH358在8h时生长速率最大，从10h开始OD值较稳定上升；XH753在12h时生长最快，从16h开始进入较稳定的时期；XH761在8h时生长速率达到最大，从10h开始进入稳定期，XH753前期生长较慢。因此，20h内XH358和XH761生长速度最快。在45℃培养下本发明唾液乳杆菌358无明显的迟缓期，能达到快速产酸的效果。

7.11菌株产酸能力

测定37℃、45℃培养条件下液体培养基的pH值，结果见图7、8。

图7为37℃培养条件下乳酸菌产酸曲线曲线，图8为45℃培养条件下乳酸菌产酸曲线。

由图7和图8可知，在37℃时和45℃所有液体培养基的pH值均从5.5开始总体呈下降的趋势，在4.3左右达到稳定。XH358和XH753在14h时产酸速率最大，在20h左右进入稳定期；XH761在10h时pH值下降最快，在20h时进入稳定时期。45℃时，XH358、XH761在8h左右产酸速率达到最大，12h左右进入稳定时期；XH753在14h时pH值下降最快，24h左右达到稳定期。因此，本发明唾液乳杆菌358的产酸速率最大。在45℃培养下，本发明唾液乳杆菌358无明显的迟缓期，副干酪乳杆菌761能达到快速产酸以实现较低pH的效果。

五、结果分析

LAB菌株部分16S rDNA序列的系统发育树如图2所示。XH358菌株的序列与唾液乳杆菌完全吻合。菌株XH753与鼠李糖乳杆菌关系最密切，其16S rDNA基因序列具有100％的相似性。此外，XH761与副干酪乳杆菌关系最密切，其16S rDNA基因序列具有100％的相似性。

通过对青贮饲料发酵及化学成分的分析，未发现接种物与玉米青贮饲料品质有显著关系。然而，在高温高湿条件下，植物乳杆菌在玉米青贮饲料中的有氧稳定性较差，而本发明唾液乳杆菌358耐高温性，耐酸性佳，对环境的适应性好，处理的青贮饲料以能降低的pH值、DM损失、酵母和大肠杆菌数量，提高有氧稳定性。

自然状况下，玉米被AFB1污染，青贮后未发生浓度变化。本发明唾液乳杆菌358在有氧暴露后，其AFB1浓度升高，但与唾液乳杆菌标准菌株相比，本发明唾液乳杆菌358AFB1浓度也更低。显示出潜在的抑制真菌生长和AFB1产生的作用。

产酸速率和生长速率是评定乳酸菌活性与是否优良的重要指标，不同菌株间具有一定程度的差异，微生物的生长曲线一般分为四个阶段：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期，与在37℃培养下的菌株相比，在45℃培养下的本发明唾液乳杆菌358无明显的迟缓期，唾液乳杆菌358能达到快速产酸以实现较低pH的效果，唾液乳杆菌358能够利用糖源的种类更多，对环境的适应性更强。

综上所述，本发明唾液乳杆菌358的生长速度快，产酸能力强，对糖源利用范围广，对酸性环境有较好的适应性，在高温高湿的热带或亚热带地区，不推荐植物乳杆菌作为全植物玉米青贮添加剂，但唾液乳杆菌358可以作为一个候选菌株，提高玉米的有氧稳定性，降低青贮饲料pH值。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gggtgctata catgcagtcg aacgaaactt tcttacaccg aatgcttgca ttcaccgtaa 60

gaagttgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctaaaag aaggggataa 120

cacttggaaa caggtgctaa taccgtatat ctctaaggat cgcatgatcc ttagatgaaa 180

gatggttctg ctatcgcttt tagatggacc cgcggcgtat taactagttg gtggggtaac 240

ggcctaccaa ggtgatgata cgtagccgaa ctgagaggtt gatcggccac attgggactg 300

agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgcaag 360

tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga aggtcttcgg atcgtaaaac tctgttgtta 420

gagaagaaca cgagtgagag taactgttca ttcgatgacg gtatctaacc agcaagtcac 480

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat 540

tgggcgtaaa gggaacgcag gcggtctttt aagtctgatg tgaaagcctt cggcttaacc 600

ggagtagtgc attggaaact ggaagacttg agtgcagaag aggagagtgg aactccatgt 660

gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaagcgg ctctctggtc 720

tgtaactgac gctgaggttc gaaagcgtgg gtagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgaat gctaggtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgccgcagct 840

aacgcaataa gcattccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960

ccaggtcttg acatcctttg accacctaag agattaggct ttcccttcgg ggacaaagtg 1020

acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080

gagcgcaacc cttgttgtca gttgccagca ttaagttggg cactctggcg agactgccgg 1140

tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat gacctgggct 1200

acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga gtcgcgagac cgcgaggttt agctaatctc 1260

ttaaagccgt tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc 1320

tagtaatcgc gaatcagcat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gccggtgggg taaccgcaag gagctcagcc 1440

gtc 1443

Claims

1.一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)358，其特征在于，所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)358保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18232。

2.一种青贮饲料添加剂，其特征在于，所述青贮饲料添加剂的活性成分为权利要求1所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)358。

3.根据权利要求2所述的青贮饲料添加剂，其特征在于，所述青贮饲料添加剂为玉米青贮添加剂。

4.根据权利要求2所述的青贮饲料添加剂，其特征在于，所述青贮饲料添加剂为降低青贮饲料pH值的青贮饲料添加剂。

5.一种青贮饲料，其特征在于，所述青贮饲料中含有权利要求2所述的青贮饲料添加剂。

6.权利要求5所述的青贮饲料，其特征在于，所述青贮饲料为玉米青贮饲料。

7.权利要求5所述的青贮饲料，其特征在于，所述青贮饲料由包括以下步骤的制备方法制备得到：

将权利要求1所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)358和玉米混合，发酵，得到所述青贮饲料。

8.权利要求7所述的青贮饲料，其特征在于，所述发酵过程发酵温度为20℃～45℃。

9.权利要求1所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)358的应用，其特征在于，所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)358在如下任意一种中的应用：

(a1)制备青贮添加剂；

(a2)制备青贮饲料。