CN109112086B - 一株暹罗芽孢杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株暹罗芽孢杆菌及其用途，属于微生物技术领域。本发明的暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。本发明分离获得的暹罗芽孢杆菌A2025能够显著抑制黄曲霉的生长，并且能够高效的降解黄曲霉毒素。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株暹罗芽孢杆菌及其用途。
背景技术
黄曲霉属于半知菌类，是一种常见腐生真菌。黄曲霉能产生黄曲霉毒素，不仅能引起禽畜中毒致死，亦有致癌作用。目前常用的脱除黄曲霉毒素的方法主要是物理法和化学法。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的去毒方法。微生物不同，脱毒效率明显不同，很多微生物能去除的AFB1效率低，需要寻找脱毒效率高的菌株。
暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)首次分离自泰国腌制的螃蟹中，是2010年报道的一个新种。截至目前属于该种的菌株报道仍然不多，且相当一部分菌株仅仅依据16SrRNA基因序列同源性分析和形态学特征而被鉴定，因此在芽孢杆菌复杂的分类学上具有较大的不确定。据查询，在GenBank数据库中只有KCTC 13613T(AJVF00000000)，XY18(LAGT00000000)，SRCM100169(LYUE01000000)几株暹罗芽孢杆菌的在分类学获得了全基因组数据的支持，其核心基因的同源性较高，可作为其他菌株是否是暹罗芽孢杆菌的最重要依据。
目前，对于暹罗芽孢杆菌的研究较少，大多数研究集中在农作物病害防治和动物饲料领域；对于其活性成分的研究不多。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高效降解黄曲霉毒素的菌株及其应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
暹罗芽孢杆菌，所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
在上述方案的基础上，所述的暹罗芽孢杆菌，分离于青岛市莱西市望城镇山东省花生研究所试验基地的花生地土壤。
在上述方案的基础上，所述的暹罗芽孢杆菌菌落形态为：在LB培养基上单菌落凸起，乳白色，不透明，培养3天后出现皱褶。
在上述方案的基础上，所述的暹罗芽孢杆菌具有如下菌学性质：氧化酶活性为阴性，能在4-54℃生长，革兰氏染色为阳性，能水解利用酪蛋白、明胶和淀粉，不能利用吐温40和吐温80。
在上述方案的基础上，所述的暹罗芽孢杆菌的16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。
上述暹罗芽孢杆菌的菌悬液或全培养液培养物或芽孢或粗提物或胞外代谢物在黄曲霉生物防控中的应用。
在上述方案的基础上，所述暹罗芽孢杆菌的菌悬液或全培养液培养物或芽孢或粗提物或胞外代谢物应用于拮抗黄曲霉的生长或抑制黄曲霉毒素的生物合成或降解黄曲霉毒素。
本发明技术方案的优点
本发明分离获得的暹罗芽孢杆菌A2025能够显著抑制黄曲霉的生长，并且能够高效的降解黄曲霉毒素。
本发明的暹罗芽孢杆菌A2025与黄曲霉对峙培养，能够显著抑制黄曲霉的生长；此外，暹罗芽孢杆菌A2025对花生中的黄曲霉也具有较好的拮抗作用；将暹罗芽孢杆菌A2025处理花生，还能显著的降低黄曲霉对花生的侵染，延长花生的贮存期。
本发明的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素具有高效的降解作用，并且对黄曲霉毒素的降解率随着孵育时间的增加而提高，其中，在37℃孵育72h时降解效果最好。本发明的暹罗芽孢杆菌A2025不仅能够高效降解黄曲霉毒素B1，降解率97.1％；还对黄曲霉毒素G1具有很好的降解作用，降解率95.9％。而且，本发明的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素的降解作用是细菌分泌至胞外的活性代谢物质主导的生物降解作用，不是细菌细胞壁的吸附作用。用本发明的暹罗芽孢杆菌A2025的胞外代谢物处理被黄曲霉毒素污染的花生，可显著降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。
附图说明
图1 A2025菌落形态图；
图2 A2025菌株16S rRNA琼脂糖凝胶电泳图，左边是Marker，右边两个是A2025的16SrRNA电泳图；
图3暹罗芽孢杆菌A2025与黄曲霉对峙培养(A中间是黄曲霉NRRL 3357，四周的四个菌落是暹罗芽孢杆菌A2025；B左边是暹罗芽孢杆菌A2025，右边是黄曲霉NRRL 3357)；
图4海假单胞菌JCM15562T与黄曲霉对峙培养(中间是黄曲霉NRRL 3357，四周的四个菌落是海假单胞菌JCM15562T)；
图5暹罗芽孢杆菌A2025对花生中黄曲霉的拮抗，其中A为对照组，B为添加暹罗芽孢杆菌A2025组；
图6暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解图谱(A是对照组，B是试验组)；
图7不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况。
图8暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解图谱(A是试验组，B是对照组)；
图9暹罗芽孢杆菌A2025不同组分对AFB1的降解分析。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
实施例1样品采集、菌株分离及筛选
1、样品采集时间和地点
2017年5月5日上午从山东省花生研究所试验基地(青岛市莱西市望城镇)采集花生地土壤样品。
2、样品的处理、菌株的分离和筛选
在超净台中取1g采集的土壤样品悬浮在10mL无菌水中，震荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取100μL悬浮液涂布在LB固体平板上，放置于37摄氏度进行培养，3天后将长出的菌落在LB固体平板上进行划线纯化，经过3次划线纯化后，得到一个菌株，编号A2025。
实施例2菌株A2025的鉴定
按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株A2025进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：
1、形态特征：菌株A2025在LB培养基上单菌落凸起，乳白色，不透明(图1)，在37℃培养2天后，菌落约为4-6mm，培养3天后菌落表面出现皱褶。
2、生理生化特征：氧化酶活性为阴性，能在4-54℃生长，革兰氏染色为阳性，能水解利用酪蛋白、明胶和淀粉，不能利用吐温40和吐温80。
3、16S rRNA基因分析
提取A2025的细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示；扩增产物连接到pMD19-T载体，转化重组质粒到大肠杆菌，测序得到的1508bp基因序列。根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较，菌株A2025的16S rRNA基因与标准菌株Bacillus siamensis KCTC 13613T的16S rRNA基因同源性为100％，基因分析表明该菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。
综合形态特点、生理生化鉴定和16S rDNA测序和同源性分析的结果，鉴定菌株A2025为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏单位为山东省花生研究所，保藏编号为CGMCC NO:15611。
实施例3暹罗芽孢杆菌A2025的培养
暹罗芽孢杆菌A2025的培养基为LB培养基：10g蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母提取物，水1000mL；能在4-54℃生长，最优培养温度为26-37℃，能在pH 5-9生长，最优pH为7-8。也可以在GY培养基生长，GY液体培养基：葡萄糖20g，酵母粉5g，水1000mL；GY固体培养基：葡萄糖20g，酵母粉5g，琼脂20g，水1000mL。
从-80℃冰箱中取出冻存的暹罗芽孢杆菌A2025，在超净工作台中取50μL暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株。向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
实施例4暹罗芽孢杆菌A2025与黄曲霉对峙培养
将50μL暹罗芽孢杆菌A2025菌液(浓度1.6×108cfu/mL)和10μL黄曲霉NRRL 3357(黄曲霉NRRL 3357(Aspergillusflavus NRRL 3357)标准菌株，由中山大学贺竹梅教授友情提供)的孢子液(孢子液浓度为6.1×105个/mL)接种在GY培养基固体平板上；将50μL海假单胞菌JCM15562T(浓度1.6×108cfu/mL)和10μL黄曲霉NRRL 3357孢子液(孢子液浓度为6.1×105个/mL)接种在GY培养基固体平板上，在28℃培养6天后，观察暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉的拮抗作用。
所述对照菌：海假单胞菌JCM15562T，购自日本JCM菌种库的标准菌株。
结果如图3、4所示：在图3A中，中间是黄曲霉，四周的四个菌落是暹罗芽孢杆菌A2025；图3B中，左边是暹罗芽孢杆菌A2025，右边是黄曲霉NRRL 3357，由图3可看出：暹罗芽孢杆菌A2025菌落表面呈现皱褶，靠近暹罗芽孢杆菌A2025的黄曲霉落明显被抑制。
图4中，中间是黄曲霉，四周的四个菌落是海假单胞菌JCM15562T；由图知对照菌不能抑制黄曲霉的生长。
实施例5暹罗芽孢杆菌A2025对花生中黄曲霉的拮抗
取25粒花生分别放进2个三角瓶中，瓶子编号为A和B。取灭过菌的3mL GY培养基，加入10μL的6.1×105个/mL黄曲霉NRRL 3357孢子，充分混匀后加入A瓶，作为对照组；取3mL培养48h的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(浓度1.6×108cfu/mL)，加入10μL的6.1×105个/mL黄曲霉NRRL 3357孢子，充分混匀后加入B瓶。放置于28℃，培养6天后，如图5，A瓶花生表面长满了黄曲霉，B瓶花生表面没有长黄曲霉，表明暹罗芽孢杆菌A2025能显著抑制花生中黄曲霉的生长。
实施例6暹罗芽孢杆菌A2025防止黄曲霉侵染贮存花生
取120g新收获、籽粒饱满、未被黄曲霉污染的花生，每60g一组，随机分为2组，每组设3个平行；向第一组花生表面喷洒灭过菌的LB培养基，喷洒量为3mL/20g，记为对照组；向第二组的花生表面喷洒培养48h的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(浓度1.6×108cfu/mL)，喷洒量为3mL/20g，记为试验组；上述各组花生于阴凉晾干后，置于室温下，通风干燥贮存。每30天取样检测花生中黄曲霉的含量，共计90天，各组黄曲霉含量情况如表1所示。
表1黄曲霉含量(cfu/g)
| 天数 | 30d | 60d | 90d |
| 对照组 | 3.8×10<sup>2</sup> | 8.1×10<sup>3</sup> | 5.7×10<sup>4</sup> |
| 试验组 | 未检出 | 47 | 1.5×10<sup>2</sup> |
由表1可知，随着时间的增加，试验组中黄曲霉的含量远远少于对照组中的含量；喷洒培养暹罗芽孢杆菌A2025菌液能够有效的防止花生中黄曲霉的污染，延长花生贮存期。
实施例7暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素B1的降解
1、黄曲霉毒素B1的配置
将1mg黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB1贮存溶液。取0.5mL 50ppm的AFB1，加入4.5mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB1工作母液。
2、暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解
取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.6×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作试验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL5000ppb的AFB1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
3、37℃条件下暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解能力分析
首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFB1降解率(％)＝(对照组AFB1含量–试验组AFB1含量)/对照组AFB1含量×100％
结果如图6所示。图6中，A：对照组；B试验组。结果表明，37℃条件下A2025对AFB1降解效果较好，降解率为97.1％。
实施例8不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况
取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.6×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，共12管，每3管为一个平行；颠倒混匀后分别于37℃孵育12h、24h、48h、72h，检测不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况，如图7所示：
由图7可知，随着孵育时间的增加，黄曲霉毒素B1的降解率逐渐增加，在孵育12h、24h、48h和72h时间，AFB1的降解率分别为16.3％、41.7％、73.2％和97.1％。
实施例9暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素G1的降解
1、黄曲霉毒素G1的配置
将1mg黄曲霉毒素G1(AFG1)标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFG1贮存溶液。取0.5mL 50ppm的AFG1，加入4.5mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFG1工作母液。
2、暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解
取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.6×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFG1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后8000rpm离心5min获得上清，记作试验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL5000ppb的AFG1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
3、37℃条件下暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解能力分析
首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
AFG1降解率(％)＝(对照组AFG1含量–试验组AFG1含量)/对照组AFG1含量×100％
结果如图8所示。A：试验组；B对照组。结果表明，37℃条件下A2025对AFG1降解效果较好，降解率为95.9％。
实施例10暹罗芽孢杆菌A2025降解黄曲霉毒素的机理
取10mL实施例3中的暹罗芽孢杆菌A2025发酵菌液(菌液浓度1.6×108cfu/mL)，经10000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液(胞外代谢物)。制备的菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液经低温超声破碎后，10000r/min离心10min得到的液体经0.22μm滤膜过滤制备暹罗芽孢杆菌A2025的胞内液(粗提物)。将暹罗芽孢杆菌A2025上清液、菌悬液、胞内液三种组分分别加入AFB1，使AFB1终浓度为100μg/kg，在37℃孵育72h后，检测分析各组分的AFB1降解率。
比较暹罗芽孢杆菌A2025不同组分的降解能力，发现其上清液、菌悬液、胞内液能分别降解97.1％、16.6％和9.3％的AFB1(图9)。这表明暹罗芽孢杆菌A2025降解AFB1是细菌分泌至胞外的活性物质主导的生物降解作用，而不是细菌细胞壁的吸附作用。
实施例11暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素污染的花生的脱毒
取50μL冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中，培养12h活性菌株，向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡发酵培养48h，菌液浓度为1.6×108cfu/mL。
取上述在LB液体培养基中37℃震荡培养48h的暹罗芽孢杆菌A2025发酵菌液(菌液浓度为1.6×108cfu/mL)，经10000r/min离心10min后，分离得到上清液。
黄曲霉毒素污染的花生样品经研磨后分为2份，每份1g，编号分别为1号和2号。1号样品经121℃灭菌15min，加入5mL灭过菌的LB培养基；2号样品经121℃灭菌15min处理后降温，接入5mL暹罗芽孢杆菌A2025的发酵上清液，两份样品都做37℃孵育处理72h。
加入甲醇到1号或2号样品分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对1号组和2号组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到样品的AFB1进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水＝1:1(体积比)；流速0.8mL/min；色谱柱C18(150mm×4.6mm，0.5μm)；激发波长350nm，检测波长450nm；进样量20μL；柱温30℃。
检测到经过脱毒处理后2号样品中AFB1浓度为7.8μg/kg，而对照的1号样品中AFB1浓度为43.5μg/kg，由此可见，AFB1降解率为82.1％，结果表明暹罗芽孢杆菌A2025上清液可显著降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 一株暹罗芽孢杆菌及其用途
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1508
<212> DNA
<213> 16S rRNA(Bacillus siamensis)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120
cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180
accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240
cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300
ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420
cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480
gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540
gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600
gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660
gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720
agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840
tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900
aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960
ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020
gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080
agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140
tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200
atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg 1260
aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320
tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440
gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500
acaaggta 1508
Claims (3)
1.暹罗芽孢杆菌，其特征在于：所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025，于2018年04月12日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:15611，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为山东省花生研究所。
2.权利要求1所述暹罗芽孢杆菌的菌悬液或全培养液培养物在黄曲霉生物防控中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述暹罗芽孢杆菌的菌悬液或全培养液培养物应用于拮抗黄曲霉菌的生长或降解黄曲霉毒素；所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素G1中的至少一种。
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