CN116064332B - 一株降解黄曲霉毒素b1的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株降解黄曲霉毒素B1的菌株及其应用，属于黄曲霉毒素生物降解技术领域。本发明降解黄曲霉毒素B1的菌株为稻不动杆菌（Acinetobacter oryzae）J15，该菌株的保藏编号为CGMCC NO.26431。该菌株在37℃下对黄曲霉毒素B1的降解率为92.2%，在黄曲霉毒素的生物降解中具有较好的应用前景。

Description

一株降解黄曲霉毒素B1的菌株及其应用
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素生物降解技术领域，具体涉及一株降解黄曲霉毒素B1的菌株及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素（Aflatoxin）是一类主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（A. parasiticus）等真菌产生的次级代谢物。从分子结构上分析，该类毒素是由二呋喃环和香豆素组成的结构类似物。曲霉毒素具有极强的致畸、致癌、致突变性，广泛污染花生、玉米、棉籽、稻谷、干果、牛奶等农产品和食品。现在已鉴定出二十多种黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）分布范围最广，并且毒性最强，1993年AFB1被世界卫生组织癌症研究机构（IARC）归为IA类致癌物。
目前常用的脱除AFB1方法主要是物理法和化学法。物理法包括有挑拣、漂洗、高温加热、辐射法、溶剂萃取等方法，这些方法或者耗费大量人力物力效率不高，或者会破坏农产品的营养成分。化学法是利用一些氧化剂、氢氧化钠等化学试剂与毒素反应造成毒素降低，但有很大的局限性，很多试剂对操作人员的皮肤、眼睛、呼吸道造成伤害，并且化学试剂残留不易去除，影响农产品和食品的质量安全。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的去毒方法。微生物不同，脱毒效率明显不同，很多微生物能去除的AFB1效率低，需要寻找脱毒效率较高的菌株。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株降解黄曲霉毒素B1的菌株。
为了达到上述目的，采用如下技术方案：
一株降解黄曲霉毒素B1的菌株，所述菌株为稻不动杆菌（Acinetobacter oryzae）J15，该菌于2023年1月9日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26431，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
保藏编号为CGMCC NO.26431的稻不动杆菌J15在黄曲霉毒素B1降解中的应用。
保藏编号为CGMCC NO.26431的稻不动杆菌J15在制备黄曲霉毒素B1降解制剂中的应用。
一种降解黄曲霉毒素B1的制剂，所述制剂包含保藏编号为CGMCC NO.26431的稻不动杆菌J15的发酵液或发酵上清液。
在上述方案的基础上，所述稻不动杆菌J15的发酵液中菌浓度≥3.1×108 cfu/mL。
在一个具体的实施例中，所述稻不动杆菌J15的发酵液的制备方法为：将稻不动杆菌J15接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.1×108 cfu/mL。
在一个具体的实施例中，所述稻不动杆菌J15的发酵上清液的制备方法为：将稻不动杆菌J15接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.1×108 cfu/mL，经过5000 g离心后获得发酵上清液。
一种降解黄曲霉毒素B1的方法，将保藏编号为CGMCC NO.26431的稻不动杆菌J15的发酵液或发酵上清液添加到待降解的样品中，37℃孵育48 h-72h。
在上述方案的基础上，所述待降解样品为花生粕等样品。
本发明技术方案的优点
本发明分离获得一株能够高效降解黄曲霉毒素B1的菌株，该菌株在37℃下对黄曲霉毒素B1的降解率为92.2%，在黄曲霉毒素的生物降解中具有较好的应用前景。
附图说明
图1菌株J15 的菌落形态；
图2菌株J15降解AFB1的图谱。
实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
菌株J15的分离纯化和鉴定
1、菌株的分离纯化
2017年4月采集青岛地区的土壤样品，在超净台中取1 g土壤悬浮在10mL无菌水中，震荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取100 μL悬浮液涂布在LB固体平板上，放置于28℃进行培养，3天后平板上长出多个菌落，根据颜色和形态不同，经过3次划线纯化后，分析降解AFB1的效率，筛选到对AFB1降解效率高的菌株J15。
2、菌株J15的鉴定
（一）形态特征：菌株J15在LB培养基上单菌落圆形，光滑，凸起，不透明（图1）。
（二）生物学特征：革兰氏染色为阴性，具有明胶酶和过氧化氢酶。
（三）16S rRNA基因分析
提取J15的细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，测序得到的1451 bp基因序列（SEQ ID NO:1）。根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较，菌株J15的16S rRNA基因与标准菌株Acinetobacter oryzae B23T的16S rRNA基因同源性为99.7%，基因分析表明该菌为稻不动杆菌（Acinetobacter oryzae）。
基于形态特征、生物学生理生化特征和基因序列特征，将菌株J15鉴定为稻不动杆菌（Acinetobacter oryzae）。该菌已于2023年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC NO.26431。
实施例2
稻不动杆菌J15在37℃条件下孵育48 h对黄曲霉毒素B1的降解作用
一、黄曲霉毒素B1的配制
将1 mg黄曲霉毒素B1（AFB1）标准品溶解于20 mL色谱级甲醇中，配制浓度为50 ppm的AFB1贮存溶液。取0.5 mL 50 ppm的AFB1，加入4.5 mL色谱级甲醇，配制浓度为5000 ppb的AFB1工作母液。
二、稻不动杆菌J15对AFB1的降解
取1.96 mL的J15菌液（菌浓度为3.1×108 cfu/mL）置于10 mL样品管中，加入40 μL 5000 ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100 ppb，颠倒混匀后37℃孵育48 h，然后8000rpm离心5 min获得上清，记作试验组溶液；以1.96 mL不接菌的培养基加入40 μL 5000 ppb的AFB1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
其中所述J15菌液的制备方法为：将菌株J15接种于LB液体发酵培养基（g/L）：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl， pH 7.0，在37℃的摇床上振荡培养2天，至菌浓度为3.1×108 cfu/mL。
三、37℃孵育48h条件下稻不动杆菌J15对AFB1的降解能力分析
首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取，最后使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得到的样品进行检测。
HPLC检测条件为流动相甲醇：水=1:1（体积比）；流速0.8 mL/min；色谱柱C18（150mm×4.6 mm，0.5 μm）；激发波长350 nm，检测波长450 nm；进样量20 μL；柱温30 ℃。
AFB1降解率（%）=（对照组AFB1含量 – 试验组AFB1含量）/对照组AFB1含量×100%
结果如图2所示。图2中，A：对照组；B试验组。结果表明，37℃条件下孵育48h菌株J15对AFB1降解率为75.3%。
实施例3
稻不动杆菌J15在37 ℃条件下孵育72 h对黄曲霉毒素B1的降解作用
一、黄曲霉毒素B1的配制
将1 mg黄曲霉毒素B1（AFB1）标准品溶解于20 mL色谱级甲醇中，配制浓度为50 ppm的AFB1贮存溶液。取0.5 mL 50 ppm的AFB1，加入4.5 mL色谱级甲醇，配制浓度为5000 ppb的AFB1工作母液。
二、稻不动杆菌J15对AFB1的降解
取1.96 mL的J15菌液 （菌浓度为3.1×108 cfu/mL）置于10 mL样品管中，加入40μL 5000 ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100 ppb，颠倒混匀后37℃孵育72 h，然后8000rpm离心5 min获得上清，记作试验组溶液；以1.96 mL不接菌的培养基加入40 μL 5000 ppb的AFB1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
其中所述J15菌液的制备方法为：将菌株J15接种于LB液体发酵培养基（g/L）：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，pH 7.0，在37℃的摇床上振荡培养2天，至菌浓度为3.1×108 cfu/mL。
三、37 ℃、72 h条件下稻不动杆菌J15对AFB1的降解能力分析
采用黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒（北京华安麦科生物技术有限公司，批号20210609）检测试验组和对照组的AFB1含量，并计算菌株J15对AFB1降解效果。结果表明，试验组中AFB1含量为3.9 ppb，对照组中AFB1含量为49.8 ppb。经计算，37 ℃，72 h条件下菌株J15对AFB1降解效果较好，降解率为92.2%。
实施例4
稻不动杆菌J15对花生样品中黄曲霉毒素的降解作用
以黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品为对象，检测稻不动杆菌J15对花生粕中黄曲霉毒素的降解情况，具体步骤为：
对照组：取黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品25 g，经过灭菌处理后，加入10 mL的灭菌的LB培养基。
试验组1：取黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品25 g，经过灭菌处理后，加入10 mL的LB培养基发酵培养的J15菌液（菌浓度为4.1×108 cfu/mL）。J15菌液制备方法：将稻不动杆菌J15接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥4.1×108 cfu/mL。
试验组2：取黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品25 g，经过灭菌处理后，加入10 mL的J15发酵上清液。J15发酵上清液制备方法：将稻不动杆菌J15接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥4.1×108 cfu/mL，经过5000 g离心后获得发酵上清液。
将上述三组避光37℃孵育72 h后，采用黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒（北京华安麦科生物技术有限公司，批号20210609）检测三者样品中黄曲霉毒素含量。结果显示，对照组：花生粕样品中黄曲霉毒素B1的含量为152 ppb；试验组1：加入菌株J15菌液孵育后，黄曲霉毒素B1含量明显降至16 ppb；试验组2：加入菌株J15发酵上清液孵育后，黄曲霉毒素B1含量明显降至18 ppb。经过菌株J15菌液孵育处理，花生粕中的黄曲霉毒素B1可显著降低89.5%；经过菌株J15菌液或发酵上清液孵育处理，花生粕中的黄曲霉毒素B1可显著降低88.2%。因而，本发明的菌株J15菌液或发酵上清液能显著降解黄曲霉毒素超标的花生样品中的黄曲霉毒素B1。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一株降解黄曲霉毒素B1的菌株，其特征在于，所述菌株为稻不动杆菌（Acinetobacter oryzae）J15，该菌株的保藏编号为CGMCC NO.26431。
2.保藏编号为CGMCC NO.26431的稻不动杆菌J15在黄曲霉毒素B1降解中的应用。
3.保藏编号为CGMCC NO.26431的稻不动杆菌J15在制备黄曲霉毒素B1降解制剂中的应用。
4.一种降解黄曲霉毒素B1的制剂，其特征在于，所述制剂包含保藏编号为CGMCCNO.26431的稻不动杆菌J15的发酵液或发酵上清液。
5.根据权利要求4所述降解黄曲霉毒素B1的制剂，其特征在于，所述稻不动杆菌J15的发酵液中菌浓度≥3.1×108 cfu/mL。
6.根据权利要求5所述降解黄曲霉毒素B1的制剂，其特征在于，所述稻不动杆菌J15的发酵液的制备方法为：将稻不动杆菌J15接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.1×108 cfu/mL。
7.根据权利要求4-6任一项所述降解黄曲霉毒素B1的制剂，其特征在于，所述稻不动杆菌J15的发酵上清液的制备方法为：将稻不动杆菌J15接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.1×108 cfu/mL，经过5000 g离心后获得发酵上清液。
8.一种降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC NO.26431的稻不动杆菌J15的发酵液或发酵上清液添加到待降解的样品中，37℃孵育48 h-72h。
9.根据权利要求8所述降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述稻不动杆菌J15的发酵液中菌浓度≥3.1×108 cfu/mL；所述稻不动杆菌J15的发酵上清液为发酵液经过5000 g离心后获得。
10.根据权利要求8或9所述降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述待降解样品为花生粕。
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