CN111808765A - 一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用，属于有益微生物降解技术领域，解决现阶段可降解DON的微生物不适合实际生产且降解率较低的技术问题，该枯草芽孢杆菌ASAG216，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19219。最佳降解效果的条件为：枯草芽孢杆菌ASAG216的初始浓度为109 CFU/mL，pH值为7.2~7.6，培养温度为35~40℃，转速为120 rpm~180 rpm。当呕吐初始浓度为100μg/mL时，12 h后枯草芽孢杆菌对其降解率达80%以上。本发明还提供了含有该菌株的降解DON的菌剂、菌剂的制备方法及运用。本发明能够提高DON降解率，从自然界中分离筛选能高效降解饲料中DON的有益微生物，为开发出高效、安全、环保的降解饲料DON的微生态制剂奠定基础。

Description

一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于有益微生物降解技术领域，具体涉及的是一株能够高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又名脱氧瓜萎镰刀菌烯醇或呕吐毒素，是一类主要由镰刀菌属的真菌，尤其是禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和黄色镰刀菌（Fusarium culmorum），呕吐毒素（DON）具有强毒性、致癌性和诱变性，严重威胁动物生产和人类的健康，被国际癌症研究机构划分为（IARC）第三类致癌物质。DON的污染广泛存在于全球各国，中国、日本、美国、前苏联、南非等均有发现。DON主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，如面包、饼干、麦制点心等。畜禽摄入污染DON的饲料可引起动物生产性能下降，对动物机体造成氧化损伤，并降低动物免疫力，使动物易被传染病原感染。同时，DON还可残留在肉、蛋以及奶制品等畜产品中，通过食物链，对人类健康造成巨大威胁。
近年来，研究报道了大量有关DON的去毒方法。主要有物理法、化学法和生物法。物理法和化学法是传统的DON去毒法，但这些方法由于去毒不彻底、影响饲料适口性、造成营养成分损失、难以规模化生产等缺点，没有被广泛运用。饲料生产中应用较多的是使用吸附剂吸附DON，虽然吸附剂在一定程度上可降低毒素含量，但并不能降解毒素，被吸附而排出动物体外的毒素会对环境造成二次污染。而微生物及其生物酶降解法因具有安全环保、解毒彻底、特异性强等优点而备受研究者关注。目前虽有研究报道，真菌、细菌及其代谢酶能降解DON，但一方面出于安全性考虑，一些具有较高降解DON活性的微生物菌株不能直接应用于食品或饲料中；另一方面微生物降解酶由于分离纯化过程复杂、活性不稳定等问题，尚较难应用于实际生产中。
总而言之，为解决农产品、饲料原料及饲料中DON污染问题，急需从自然资源中分离筛选安全、高效降解DON的益生菌，特别是可以作为饲料添加剂的菌种，并进一步研究其生物特性及降解产物毒性，研发适用于饲料行业的微生物菌制剂，减少养殖业的经济损失。现有技术中，公布号CN110055186A的发明专利公开了一种用于降解DON的暹罗芽孢杆菌A2025，该菌株反应24 h对DON的降解率达70%；专利申请CN103243047A中公开了一株高效降解DON的枯草芽孢杆菌及其应用，将900 µL枯草芽孢杆菌ANSB471发酵液与100 µL DON（100μg/mL）反应，反应2小时对DON的降解率为25%，反应24小时对DON的降解率为56%；专利申请CN109136143A中公开了一株可降解DON的地衣芽胞杆菌FMM-hx，接种72h后降解率为60.98%。现有技术中，对DON的降解率较低，降解时间较长，无法在动物体内高效降解DON，限制了实际生产应用。
发明内容
基于DON污染谷物和饲料的范围广、危害大，现阶段可降解DON的微生物不适合实际生产且降解率较低。本发明提出：为了克服现有技术的不足，提高DON降解率，从自然界中分离筛选能高效降解饲料中DON的有益微生物，为开发出高效、安全、环保的降解饲料DON的微生态制剂奠定基础。
本发明通过以下技术方案予以实现。
一株枯草芽孢杆菌ASAG216，分类命名拉丁文为：bacillus subtilis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏日期为：2019年12月18日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 19219。本发明所提供的高效降解DON的枯草芽孢杆菌ASAG216菌株（保藏编号：CGMCC No. 19219）是从山西省吕梁地区驴养殖厂的驴肠道中分离得到。ASAG216仍然可能发生突变或变异。例如，用化学药剂如亚硝基胍（NTG）、或物理方法如紫外、辐射得到的诱变菌株，只要保留降解DON的能力特征，也属于本发明的一部分。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌ASAG216菌株在LB培养基上生长，菌落圆形，浅黄色，扁平，边缘完整，革兰氏阳性菌；芽孢1.0~1.5 μm，椭圆到柱状，芽孢形成后菌体无明显膨大，葡萄糖：+；甘露醇：+；淀粉水解：+；吲哚产生：+；甲基红：+；明胶液化：+；脲酶：+；分解酪素：+；50℃生长：+。
根据Takara细菌基因组DNA提取试剂盒步骤和PCR方法提取并扩增该菌株的基因组DNA，通过测定16S rRNA基因序列的全长约为1500 bp，测序后在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中对相关序列进行系统发育分析，结合生理生化特征，鉴定为枯草芽孢杆菌。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌ASAG216对模拟胃肠液以及高温具有抗逆性，枯草芽孢杆菌ASAG216在模拟胃液、小肠液、大肠液中的存活率不小于85%，在胆盐以及高温下的存活率不小于70%。
一种高效降解DON的菌剂，所述菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌ASAG216或其衍生的突变菌株，所述枯草芽孢杆菌ASAG216的保藏编号为CGMCC No. 19219。
进一步地，所述菌剂对DON所起降解效果的是胞外酶。
进一步地，所述菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
一种降解DON的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）、浓度为50%的甘油与保藏编号为CGMCC No. 19219的枯草芽孢杆菌ASAG216或其衍生的突变株菌液在LB固体培养基上活化，菌液与甘油的体积比为1:1；
（2）、将步骤（1）活化后的菌液1 mL接种于50 mL的LB液体培养基中，培养至OD值为0.7~0.8，达到对数生长期，得到种子液；
（3）、将步骤（2）获得的种子液接种于LB发酵培养基中，培养至稳定期，同时OD值为1.0~1.2，制得液态菌剂。
进一步地，所述的LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000 mL，pH值为7.2~7.6；所述的LB液体培养基成分为：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH值为7.2~7.6；所述的LB发酵培养基成分为：胰蛋白胨12 g，酵母浸粉6 g，氯化钠12 g，蒸馏水1000 mL，pH值为7.2~7.4。
进一步地，在所述步骤（2）中，活化后的菌液在LB液体培养基中进行发酵，发酵条件为：发酵温度为35~40℃，发酵时间12~24 h，转速为120 ~180 rpm，pH值为7.2~7.6。
进一步地，该方法还包括将所述液态菌液中加入2~10%w/v的保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥，制得固态菌剂；所述的喷雾干燥条件为：进风口温度160~180℃，出口温度60~90℃，进料速度1~2 L/h。
所述的枯草芽孢杆菌ASAG216、或者所述的菌剂、或者所述菌剂的制备方法制得的菌剂在降解DON中的应用。
进一步地，枯草芽孢杆菌ASAG216对DON降解的步骤为：所述菌剂中枯草芽孢杆菌ASAG216的初始浓度为109 CFU/mL，将250 µL菌剂加入250 µL浓度为100 μg/mL的DON标准品溶液中，调节反应体系的pH值为7.2~7.6，培养温度为45~50℃，反应时间为12 h，反应结束后DON降解率为80%以上。
进一步地，所述的枯草芽孢杆菌ASAG216降解DON的最适温度为50℃。
枯草芽孢杆菌ASAG216降解DON活性组分的确定方法，按照下述步骤进行：取枯草芽孢杆菌ASAG216的发酵液、菌体细胞、上清液、上清液+蛋白酶k、胞体、胞体高温处理、上清高温处理运用于降解DON。发现发酵上清液对DON的降解率显著高于其它组别，证明枯草芽孢杆菌ASAG216降解DON活性组分存在于发酵上清液中。
与现有技术相比本发明的有益效果为：
1、本发明使用的枯草芽孢杆菌ASAG216，能高效快速的降解DON。当DON初始浓度为100μg/mL时，12 h后枯草芽孢杆菌对其降解率达80%以上；
2、经研究可确定枯草芽孢杆菌ASAG216可通过生物酶降解作用使得DON降解为无毒的代谢产物。降解过程无毒副作用，无耐药性，无污染，具有实际应用价值。
3、本发明使用的枯草芽孢杆菌ASAG216，可以直接作为饲料添加剂加入饲料中使用，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响，菌种安全且生产成本低、易操作、耐高温。解决饲料原料及饲料DON污染问题，提高畜牧业经济效益。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌ASAG216的菌落形态图。
图2为枯草芽孢杆菌ASAG216系统进化树。
图3为空白对照组液相色谱图（出峰时间10.024 min）。
图4为枯草芽孢杆菌ASAG216降解DON组液相色谱图（出峰时间10.379 min）。
图5为枯草芽孢杆菌ASAG216在不同逆境下的存活率条形图。
图6为枯草芽孢杆菌ASAG216在不同温度下对DON的降解率条形图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。另外，对于本领域技术人员而言，在不偏离本发明的实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
实施例1 降解DON的枯草芽孢杆菌ASAG216的分离与鉴定
1．菌的分离
（1）从山西省吕梁地区驴养殖厂屠宰驴时采集多份驴肠道于液氮中保存，并注明采集名称、地点、时间等信息。取1 mL驴肠道组织匀浆放在10 mL无菌蒸馏水中稀释制备驴肠道悬浊液，用浓度梯度法逐级稀释10、100、1000和1000倍。
（2）将不同浓度稀释的驴肠道悬浊液涂布在LB固体平板上，37℃培养24 h，挑取平板上形态特征、颜色、大小不同的菌株进行平板划线纯化，接纯化后的菌株进行DON降解试验，分析得到降解效率最高的一株菌，该菌编号为ASAG216。
2．菌的鉴定
（1）菌株ASAG216在LB培养基上为圆形，浅黄色，扁平，边缘完整；革兰氏阳性；芽孢1.0~1.5μm，椭圆到柱状，芽孢形成后菌体无明显膨大，如图1所示；葡萄糖：+；甘露醇：+；淀粉水解：+；吲哚产生：+；甲基红：+；明胶液化：+；脲酶：+；分解酪素：+；50℃生长：+。生化特性符合枯草芽孢杆菌的特征。
（2）经PCR扩增得到16S rRNA基因序列，全长约1500 bp。测序后，在NCBI上使用Blast比对，从GenBank数据库中获得相关序列并进行系统发育分析，测序结果见SEQ IDNO:1。构建系统进化树如图2所示。结果表明，菌株ASAG216为枯草芽孢杆菌。
SEQ ID NO:1：
1~60 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc
61~120 cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat
121~180 aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa
181~240 aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt
241~300 aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga
301~360 ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga
361~420 aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg
421~480 ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag
481~540 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa
541~600 ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc
601~660 aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc
661~720 acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct
721~780 ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg
781~840 tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc
841~900 agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa
901~960 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac
961~1020 cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag
1021~1080 agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg
1081~1140 caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg
1141~1200 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg
1201~1260 ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa
1261~1320 tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa
1321~1380 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc
1381~1440 gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc
1441~1500 agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg
实施例2 枯草芽孢杆菌ASAG216对DON的降解作用
1．DON测定方法
采用高效液相色谱法检测DON，条件如下，迪马C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相：甲醇∶水（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱温：35˚C；检测波长：λex=280 nm；进样量：20 μL。
2．枯草芽孢杆菌ASAG216对DON的降解
（1）将1 mL保藏的枯草芽孢杆菌ASAG216接种到装有50 mL灭菌LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 mL，pH为7.2~7.6）中，在35~40℃，120~180 rpm条件下培养12~24 h后，取250 µL发酵培养液与250 µL DON标准品（浓度为100 μg/mL）混合；以250 µL LB培养基与250 µL DON标准品（浓度为100 μg/mL）作为对照，反应12 h后测定DON浓度，计算降解率。
（2）DON降解率（%）=（初始DON峰面积-取样后测得的DON峰面积）/初始DON峰面积×100%。
（3）结果发现：如图3和图4所示，枯草芽孢杆菌ASAG216与100 μg/mL DON标准品作用12 h，对DON的降解率可达到80%以上。
3．枯草芽孢杆菌ASAG216降解DON活性组分的确定
（1）取枯草芽孢杆菌ASAG216发酵液，在4℃的冷冻离心机中，10000 g离心10 min，将上清液取出备用（置于冰中），将菌体细胞沉淀用PBS缓冲液冲洗三次后，复溶于缓冲液并置于冰中备用。取枯草芽孢杆菌ASAG216发酵液121℃高温处理20 min，重复上述操作。取未经高温处理的上清液加入蛋白酶K，50℃作用30 min。（所有上清液均需要用灭菌的0.22 μm的纤维素膜过滤，得到菌体的胞内提取物，置于冰中备用）
（2）分别取250 µL发酵液（上清液、清液+蛋白酶k、胞体、胞体高温处理、上清高温处理高温细胞悬浮液）与250 µL DON标准品稀释液（浓度为100 μg/mL）混合；同时以250 µL LB培养基与250 µL DON标准品稀释液（浓度为100 μg/mL）作为对照，反应12 h后测定DON浓度，计算降解率。
（3）结果分析：发酵上清液对DON的降解率显著高于菌体细胞和胞内提取物，发酵液、上清液对DON的降解率均为80%左右，而其余组分对DON的降解率降低至20%左右，证明枯草芽孢杆菌ASAG216降解DON活性组分存在于发酵上清液中，是一种胞外酶。
实施例3 枯草芽孢杆菌ASAG216降解DON的最适温度
1．菌种活化：将在30%浓度甘油中（菌液：甘油=1：1）保藏的ASAG216或其衍生的突变株接种于LB固体培养基上，于37℃下培养24h。其中：LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH为7.2~7.6；
2．样品处理：取40 μL菌液于2mL离心管，加入40 μL DON稀释液（DON终浓度：10 μg/mL），放在不同温度（30℃、40℃、50℃、60℃、80℃）的水浴锅内温育30 min。取40 μL无菌培养基于2 mL离心管，加入40 μL毒素稀释液，室温放置30 min作为空白对照。
温育结束后，取40 μL上述样品加入960 μL样品稀释液B进行稀释（检测所用试剂来自中检维康ELISA呕吐毒素试剂盒）
3．毒素含量检测：
（1）将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架，标准品和样品做两个平行实验。
（2）吸取50 μL标准品或样品分别加至相应的微孔中，然后各加入50 μL的DON酶标抗原，再加入50 μL的DON抗体，加盖，在室温温育30 min。
（3）倒出孔中的液体，每孔加入200 μL稀释好的洗涤液（取10 mL浓缩液+90 mL纯水稀释10倍后使用），置于脱色摇床振荡60秒钟，重复操作5次。洗完后用力在吸水纸上拍干。
（4）每孔加入150 μL显色底物TMB，室温避光温育 10分钟。
（5）每孔加入50 μL终止液。
（6）置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸光度值（OD值）。
4．标准曲线的制作：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝B/B0×100%
以毒素标准品浓度值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，得到回归方程。将样品百分吸光度值带入方程，得到样品中的毒素浓度。
5．降解率计算公式：
降解率（%）=（C0-Cx）/C0×100%
6．结果分析：由图5可知枯草芽孢杆菌ASAG216对DON的降解最适温度为50℃。
实施例4 枯草芽孢杆菌ASAG216抗逆性的检测
1．模拟胃液环境的耐受试验：取浓盐酸23.4 mL加水100 mL配制成稀盐酸。取上述稀HCl 1.64 mL，加水约80mL与胃蛋白酶1 g混匀，加水稀释成100 mL，即得人工胃液，人工胃液的pH约为2，配成的溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。试验时，取500 μL活菌菌液分别加入4.5 mL的模拟胃液中，并迅速混匀，37℃恒温静置培养2 h。恒温培养结束后进行逐级稀释，平板涂布，计数存活的芽孢数。
结果表明，活菌存活率达86.6%（图6）。
2．模拟人工肠液的耐受试验：参照2010年《中国药典》二部附录XV D中方法配制人工肠液。取0.68 g磷酸二氢钾，加50 mL水溶解，用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调成pH=6.8的溶液，另外取1 g胰蛋白酶，加适量水溶解，将两种溶液混合均匀，加水稀释成100mL，即得人工肠液，人工小肠液的pH约为6.8，配成的溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。采用浓度为0.1 mol/L的盐酸溶液和0.1 mol/L的碳酸氢钠配制pH=8.3的模拟大肠液，配成的溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。试验时，取500 μL活菌菌液分别加入4.5 mL的模拟小肠液或大肠液中，并迅速混匀，37℃恒温静置培养，小肠液组5 h，大肠液组17 h。恒温培养结束后进行逐级稀释，平板涂布，计数存活的芽孢数。
结果表明，活菌存活数达90.0%以上（图6）。
3．模拟胆盐溶液的耐受试验：用胰液素制成1 g/L的溶液，并在溶液中加入0.3%的猪胆盐，用10%的NaOH调整pH为8.0，配成的溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。试验时，取500 μL活菌菌液分别加入4.5 mL的模拟胆盐中，并迅速混匀，37℃恒温静置培养24 h。恒温培养结束后进行逐级稀释，平板涂布，计数存活的芽孢数。
结果表明，活菌存活数达70.7%（图6）。
4．高温环境的耐受试验：将5 mL枯草芽孢杆菌ASAG216活菌菌液，进行逐级稀释，平板涂布，作为对照组；同时，将5 mL枯草芽孢杆菌ASAG216活菌菌液在80℃水浴锅中高温处理20-30 min，恒温培养结束后进行逐级稀释，平板涂布，作为处理组。对照组和处理组在35~40℃培养24 h后计算加热前后的数量。
结果表明，加热后活菌存活数达73.2%（图6）。
由此可以判断枯草芽孢杆菌ASAG216对胃肠环境有一定的抵抗作用，抗逆性较强。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 贾如
北京世纪鸿邦生物科技有限公司
山西令德生物科技有限公司
<120> 一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用
<141> 2019-12-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1472
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa 180
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260
tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc 1440
agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg 1472

Claims (13)

1.一株枯草芽孢杆菌ASAG216，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 19219。
2.根据权利要求1所述的一株枯草芽孢杆菌ASAG216，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌ASAG216菌株在LB培养基上生长，菌落圆形，浅黄色，扁平，边缘完整，革兰氏阳性菌；芽孢1.0~1.5 μm，椭圆到柱状，芽孢形成后菌体无明显膨大。
3.根据权利要求1所述的一株枯草芽孢杆菌ASAG216，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌ASAG216对模拟胃肠液以及高温具有抗逆性，枯草芽孢杆菌ASAG216在模拟胃液、小肠液、大肠液中的存活率不小于85%，在胆盐以及高温下的存活率不小于70%。
4.一种高效降解呕吐毒素的菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌ASAG216或其衍生的突变菌株，所述枯草芽孢杆菌ASAG216的保藏编号为CGMCC No. 19219。
5.根据权利要求4所述的一种高效降解呕吐毒素的菌剂，其特征在于：所述菌剂对呕吐毒素所起降解效果的是胞外酶。
6.根据权利要求4所述的一种高效降解呕吐毒素的菌剂，其特征在于：所述菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
7.一种如权利要求4所述的高效降解呕吐毒素的菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、浓度为50%的甘油与保藏编号为CGMCC No. 19219的枯草芽孢杆菌ASAG216或其衍生的突变株菌液在LB固体培养基上活化，菌液与甘油的体积比为1:1；
（2）、将步骤（1）活化后的菌液1 mL接种于50 mL的LB液体培养基中，培养至OD值为0.7~0.8，达到对数生长期，得到种子液；
（3）、将步骤（2）获得的种子液接种于LB发酵培养基中，培养至稳定期，同时OD值为1.0~1.2，制得液态菌剂。
8.根据权利要求7所述的一种高效降解呕吐毒素的菌剂的制备方法，其特征在于：
所述的LB固体培养基成分为：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH值为7.2~7.6；
所述的LB液体培养基成分为：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2~7.6；
所述的LB发酵培养基成分为：胰蛋白胨12 g，酵母浸粉6 g，氯化钠12 g，蒸馏水1000mL，pH值为7.2~7.4。
9.根据权利要求7所述的一种高效降解呕吐毒素的菌剂的制备方法，其特征在于：在所述步骤（2）中，活化后的菌液在LB液体培养基中进行发酵，发酵条件为：发酵温度为35~40℃，发酵时间12~24 h，转速为120 ~180 rpm，pH值为7.2~7.6。
10.根据权利要求7所述的一种高效降解呕吐毒素的菌剂的制备方法，其特征在于：该方法还包括将所述液态菌液中加入2~10%w/v的保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥，制得固态菌剂；所述的喷雾干燥条件为：进风口温度160~180℃，出口温度60~90℃，进料速度1~2L/h。
11.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌ASAG216、或者根据权利要求4所述的菌剂、或者根据权利要求7所述菌剂的制备方法制得的菌剂在降解呕吐毒素中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌ASAG216对呕吐毒素降解的步骤为：所述菌剂中枯草芽孢杆菌ASAG216的初始浓度为109 CFU/mL，将250 µL菌剂加入250 µL浓度为100 μg/mL的呕吐毒素标准品溶液中，调节反应体系的pH值为7.2~7.6，培养温度为45~50℃，反应时间为12 h，反应结束后呕吐毒素降解率为80%以上。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌ASAG216降解呕吐毒素的最适温度为50℃。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852666A (zh) * 2021-01-19 2021-05-28 新疆河润水业有限责任公司 一种微生物菌剂的制备方法及采用微生物菌剂制备的微生物肥料
CN113621539A (zh) * 2021-08-11 2021-11-09 武汉观海生物科技有限公司 一株具有呕吐毒素脱毒功能的产酶抑菌型枯草芽孢杆菌的筛选及应用
CN114214222A (zh) * 2021-10-08 2022-03-22 河南工业大学 一株高效降解玉米赤霉烯酮耐高温的菌株及其菌剂
CN114517170A (zh) * 2022-03-18 2022-05-20 广西优比特生物科技有限公司 一株降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103243047A (zh) * 2013-05-09 2013-08-14 中国农业大学 一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用
CN109527222A (zh) * 2018-11-15 2019-03-29 山西大学 一种防治呕吐毒素中毒症状的饲料添加剂及其应用
CN109593665A (zh) * 2017-09-30 2019-04-09 中粮营养健康研究院有限公司 枯草芽孢杆菌、含有该菌的菌剂和试剂盒及它们的应用以及降解呕吐毒素的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103243047A (zh) * 2013-05-09 2013-08-14 中国农业大学 一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用
CN109593665A (zh) * 2017-09-30 2019-04-09 中粮营养健康研究院有限公司 枯草芽孢杆菌、含有该菌的菌剂和试剂盒及它们的应用以及降解呕吐毒素的方法
CN109527222A (zh) * 2018-11-15 2019-03-29 山西大学 一种防治呕吐毒素中毒症状的饲料添加剂及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RU JIA, LIRONG CAO, WENBIN LIU, ZHUOYU SHEN: "Detoxification of Deoxynivalenol by Bacillus subtilis ASAG 216 and characterization the degradation process" *
谭剑;杨硕;苏会波;吴延东;佟毅;: "一株降解呕吐毒素枯草芽孢杆菌的鉴定与降解效果研究" *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852666A (zh) * 2021-01-19 2021-05-28 新疆河润水业有限责任公司 一种微生物菌剂的制备方法及采用微生物菌剂制备的微生物肥料
CN113621539A (zh) * 2021-08-11 2021-11-09 武汉观海生物科技有限公司 一株具有呕吐毒素脱毒功能的产酶抑菌型枯草芽孢杆菌的筛选及应用
CN113621539B (zh) * 2021-08-11 2023-05-23 武汉观海生物科技有限公司 一株具有呕吐毒素脱毒功能的产酶抑菌型枯草芽孢杆菌的筛选及应用
CN114214222A (zh) * 2021-10-08 2022-03-22 河南工业大学 一株高效降解玉米赤霉烯酮耐高温的菌株及其菌剂
CN116396883A (zh) * 2021-10-08 2023-07-07 河南工业大学 一株耐高温高效降解玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其菌剂
CN116396883B (zh) * 2021-10-08 2023-12-01 河南工业大学 一株耐高温高效降解玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其菌剂
CN114517170A (zh) * 2022-03-18 2022-05-20 广西优比特生物科技有限公司 一株降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用

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