CN110540949B - 贝莱斯芽孢杆菌突变株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌突变株及应用，贝莱斯芽孢杆菌突变株命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HCK2，保藏编号为CCTCC NO：M2019396，是从保藏编号为CCTCC NO：M2017658的贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314进行N离子突变而来。本发明贝莱斯芽孢杆菌突变株能够高产罗克霉素，提高克氏原螯虾的抵抗力，减少白斑综合症病毒拷贝数，降低克氏原螯虾的病发率；能够抑制有害细菌在水体中繁殖速率，净化水体环境，在水产养殖中具有广阔的利用前景。

Description

贝莱斯芽孢杆菌突变株及应用

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及一株高产罗克霉素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及应用。

背景技术

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，俗称小龙虾，是我国重要的水产经济品种，主产区为长江中下游地区和淮河流域。据统计，2015年淮安仅盱眙、洪泽、金湖三地的养殖面积达25万亩，产量近2.5万吨，仅克氏原螯虾养殖产业所带来的经济创收达10多亿元。以往认为克氏原螯虾抗病力强，疾病少。但随着人工养殖时间的延长，其本身抗病力降低，加上环境污染，病原体较多，在养成过程中凸现的疾病也逐渐增多。白斑综合征病毒(WSSV)是一种具囊膜、杆状的双链环状DNA病毒，被世界动物卫生组织(OIE)、联合国粮农组织(FAO)及亚太水产养殖中心网(NACA)列为需要报告的重要水生动物疾病病原之一。据统计，自2007年5月份开始，在江苏省的徐州、盱眙、淮安、扬州、常州等地先后发生了由WSSV引起的克氏原螯虾病害，死亡率最高达50％，使克氏原螯虾养殖业遭受了巨大损失。因此从种质、环境和防病药物等方面着手，提出相应的防治措施，是确保克氏原螯虾养殖产业健康发展的重要举措。

白斑综合症病毒(WSSV)的传播有三种途径：水平传播(相同个体之间通过直接接触传播)、垂直传播(通过感染的亲代传给子代)和种间传播。目前，我国的克氏原螯虾大多都携带WSSV病毒，于是在虾的生产上提高小龙虾的抵抗力及切断WSSV传播途径等方法防止WSSV病害的病发与传播。

芽孢杆菌能分泌大量的酶，比如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等不仅能迅速降解鱼虾残留饵料和排泄物，还可以降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，具有改善水质的作用。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，曾用名解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)属于芽孢杆菌属(Bacillus)，是革兰氏阳性菌，好氧，能产生孢子，是一类具有高活性的消化酶系、耐高温、抗应激性的异养菌，且能够产生种类繁多的抑菌物质，有效地抑制真菌和其他细菌的活性，亦是作为一类应用较广的生防菌来推广。但是生物体是复杂多变，仍然有很多东西未发掘出来，利用贝莱斯芽孢杆菌进行生物防治的前景是十分广阔。

发明内容

技术问题：本发明的目的是克服现有技术所存在的不足，而提供一株贝莱斯芽孢杆菌突变株，提高了罗克霉素的产量。

技术方案：本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HCK2，保藏编号为CCTCC NO：M2019396。

本发明还提供了一种用于所述贝莱斯芽孢杆菌突变株发酵的培养基，以质量百分数计，所述的培养基配方为：豆饼粉水解物2～4％、葡萄糖2～4％、KCl 0.5～0.7％、MgSO₄·7H₂O 0.05～0.075％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.2～0.25％；优选的，所述的培养基配方为：豆饼粉水解物3％、葡萄糖3％、KCl 0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.075％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％。该发酵培养基可以提升生物量和罗克霉素的产量。

本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株在生产抗生素中的应用。

本发明还提供了一种抗生素的制备方法，包括：将所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株接种于培养基中进行发酵，从发酵液中分离得到所述的抗生素。

其中，上述的抗生素可以为罗克霉素。

发酵时，培养基可以采用LB培养基或上述改进的培养基配方，发酵可以采用常规的条件，一般温度为26～28℃，培养时间为48～96h，发酵时进行振荡。

本发明还提供了一种生防制剂或饲料，含有所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株的菌丝体、芽孢或发酵产物。

本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株在制备抑制细菌或病毒制剂中的应用。所述细菌包括但不限于诺卡氏菌、金黄色葡萄球菌，所述病毒包括但不限于白斑综合症病毒。

本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株在制备防治克氏原螯虾病害、提高克氏原螯虾免疫力的制剂中的应用。

有益效果：

本发明的贝莱斯芽孢杆菌突变株高产罗克霉素，产量较原始菌株提高了10 倍，在优化的发酵培养基中，罗克霉素产量可达2.5g/L。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌突变株能够抑制有害细菌在水体中繁殖速率，净化水体环境，降低克氏原螯虾的病发率。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌突变株能够提高克氏原螯虾的抵抗力，减少白斑综合症病毒拷贝数，降低克氏原螯虾WSSV的病发率，在水产养殖中的应用具有优势及广阔的应用潜力。

附图说明

图1为贝莱斯芽孢杆菌HCK2的电镜图；

图2为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314和贝莱斯芽孢杆菌HCK2抑菌活性对比；

图3为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314产罗克霉素的液相色谱图；

图4为贝莱斯芽孢杆菌HCK2产罗克霉素的液相色谱图；

图5为贝莱斯芽孢杆菌HCK2对水体中氨氮含量的影响；

图6为贝莱斯芽孢杆菌HCK2对水体pH值的影响；

图7为贝莱斯芽孢杆菌HCK2对克氏原螯虾虾重的影响；

图8为贝莱斯芽孢杆菌HCK2对克氏原螯虾发病率的影响；

图9为贝莱斯芽孢杆菌HCK2对克氏原螯虾非特异性免疫的影响；

图10为贝莱斯芽孢杆菌HCK2对抑制克氏原螯虾WSSV病毒繁殖的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。

实施例1

本实施例主要涉及高产罗克霉素贝莱斯芽孢杆菌HCK2的获得过程。

贝莱斯芽孢杆菌HCK2经诱变得到，诱变过程如下：

进行诱变的原始菌株为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，分类地位为：枯草芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌种，贝莱斯芽孢杆菌亚种(曾用名：解淀粉芽孢杆菌)，该菌株已于2017年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2017658，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏时间为30 年。该菌株已经在公开号为CN109182197A、发明名称为“一种解淀粉芽孢杆菌 CPLK1314及其在饲料储存中的应用”的中国专利申请中公开。

将实验室已保存的贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，于LB培养基中28℃培养24h 后，取0.1mL的菌液均匀涂布于无菌平板，在无菌操作台上吹干成菌膜，进行 N⁺离子注入，能量为20KeV，注入剂量为(0～30)×2.6×10¹⁴N⁺/cm²进行诱变筛选。

诱变筛选时，先进行初筛，初筛采用抑菌圈法，挑取平板上长出的单菌落进行抑菌实验，以克氏原螯虾病原细菌诺卡氏菌菌株作为指示菌，28℃培养24h，分别以抑菌带宽大于对照菌株5％、低于对照菌株5％作为正负筛选标准。初筛后得到的菌株进行复筛，复筛时通过比较罗克霉素的产量，以罗克霉素产量高于对照菌株30％计为正突变，以罗克霉素产量低于对照菌株30％计为负突变，统计正突变率和负突变率。对照菌株为未突变的贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314。罗克霉素的产量检测参照实施例2。存活率＝诱变后平板长出的单菌落数量/未诱变的平板长出的单菌落数量×100％。

表1不同诱变条件下对菌株突变的影响

结果显示，在能量为20KeV，注入剂量为20×2.6×10¹⁴N⁺/cm²的条件下，正突变率最高，为13.2％。

在正突变菌株中，筛选到一株罗克霉素产量最高的菌株，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HCK2，形态如图1，其分类地位为：枯草芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌种，贝莱斯芽孢杆菌亚种，该菌株已于2019年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2019396，保藏地址：中国武汉大学，保藏时间为30年。

实施例2

本实施例主要涉及诱变菌株贝莱斯芽孢杆菌HCK2发酵液菌含量、抑菌活性和罗克霉素产量的检测。

1、贝莱斯芽孢杆菌HCK2发酵液菌含量的检测

贝莱斯芽孢杆菌HCK2的单菌落接种至1000mL LB液体培养基(胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、pH7.0)，28℃，180r/min，培养72h。采取系列稀释平板计数法，将发酵液稀释至10^-8～10^-7cfu·mL^-1，然后取0.2mL 均匀涂布到LB平板上，28℃培养24h后记录每皿菌落数，并计算发酵液菌含量，结果表明菌含量可达到5×10¹⁰cfu·mL^-1。

2、抑菌活性的测定

采用牛津杯法进行抑菌活性的测定，具体步骤包括：取诱变前的贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314和诱变后得到的贝莱斯芽孢杆菌HCK2的单菌落进行液体培养， LB培养基中于28℃条件下培养72h后，分别取0.2mL的菌液打入到以金黄色葡萄球菌为指示菌的牛津杯中，进行实验对比，28℃条件下培养24h，结果显示诱变后菌株的抑菌圈面积比诱变前的抑菌圈大40.3％(如图2)。

表2贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314和HCK2的抑菌圈对比

菌株名称	抑菌圈面积(mm<sup>2</sup>)
		CPLK1314	44.75
HCK2	62.8

3、罗克霉素产量的对比

取诱变前的贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314和诱变后得到的贝莱斯芽孢杆菌 HCK2的单菌落分别接种至1000mL LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、pH7.0)，28℃，180r/min，培养72h。培养液离心除去菌体后，加盐酸调pH值至2.8，离心得到酸沉淀，甲醇抽提沉淀，然后过0.22μm 的滤膜得到罗克霉素粗提物。对罗克霉素粗提物进行处理制成样品液，用高效液相色谱仪进行罗克霉素含量的检测。(检测条件：色谱柱：Agilent zorbax sb-Aq C18 (规格：4.6×250mm，粒径：5μm)；柱温：29℃；进样量：20μL；流动相：乙腈：水(20:80，v/v)；流速：0.5ml/min；检测波长：230nm)。

液相色谱图如图3、图4，经试验证明，诱变后得到的贝莱斯芽孢杆菌HCK2 比诱变前的贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314产生罗克霉素的含量提高了10倍。

实施例3

本实施例主要涉及贝莱斯芽孢杆菌HCK2发酵工艺。

把诱变后得到的贝莱斯芽孢杆菌HCK2进行液体发酵，发酵结束后统计发酵液中菌体数量，并检测发酵液中罗克霉素的含量，检测方法参考实施例2，发酵过程中，以质量分数计，发酵培养基配方为：豆饼粉水解物(淮安正昌饲料公司) 3％、葡萄糖3％、KCl 0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.075％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％；发酵条件：接种量为2％，发酵温度为28℃，发酵时间为72h。以LB培养基作为对照。

表3工业培养基与LB培养基对发酵的影响

名称	LB培养基	工业培养基
			贝莱斯芽孢杆菌HCK2菌体数量	5×10<sup>10</sup>个/mL	1×10<sup>11</sup>个/mL
罗克霉素产量	1.7g/L	2.5g/L

结果如表3，优化培养基后，贝莱斯芽孢杆菌HCK2的罗克霉素产量从1.7g/L 到2.5g/L，产量提高了接近1.5倍。

实施例4

本实施例涉及高产罗克霉素HCK2对克氏原螯虾生长及水体环境的影响。

本克氏原螯虾养殖实验地为30亩，均分为六个塘口，以塘口一和塘口二为空白对照塘口，塘口三和塘口四喷洒高产罗克霉素的贝莱斯芽孢杆菌HCK2经优化培养基在28℃培养72h发酵液，喷洒量为1L/亩，塘口五和塘口六喷洒微产罗克霉素的贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314经同样条件培养的发酵液，喷洒量为1L/亩进行对照。克氏原螯虾的养殖塘口深度1.5m，水深1.2米，养殖密度为1.2万尾 /亩。检测不同菌株对水体环境及虾生长的影响。

1、水体环境检测，主要涉及水体pH值和氨氮含量的测定。

一个月为一个周期在克氏原螯虾养殖基地采集水样，先将水样倒入Φ70mm 的定性滤纸中抽滤，抽滤后的水倒入Φ50mm、孔径为0.45μm的水溶性滤膜中抽滤，将抽滤后的水样倒入干净的塑料桶中，取100mL水样装在塑料管中。

pH值测定如下：首先用塑料管中的水样润洗测定管数次，然后将水样滴定至测定管的刻度线，再向测定管中滴加pH测定液4滴后摇晃均匀。静置数分钟，将比色卡放在测定管下，从上而下观察比对，与比色卡相同颜色的就是测定管中水样的pH值。

氨氮的测定如下：首先用塑料管中的水样润洗测定管数次，然后将水样滴定至测定管的刻度线。再向测定管中加氨氮试剂I 2滴，盖上测定管塞子摇晃均匀后，加入氨氮试剂II 5滴，盖上测定管塞子摇晃均匀后竖直静置10min左右，将比色卡放在测定管下，从上而下观察比对，与比色卡相同颜色的就是测定管中水样的氨氮含量。

根据上面测出的pH值和氨氮含量，再测出测定水样时的温度，然后根据水样有毒氨的比例表查出氨在氨氮总量的比例，按如下公式计算得到虾塘中有毒氨的含量。

计算公式如下：

NH₃＝N×1.216×％

其中NH₃是指氨气，单位为mg/L；

N是指氨氮中氮的含量，单位为mg/L；

1.216是固定值；

％是指从水样有毒氨比例表中所查到的数值。

结果如图5发现喷晒HCK2发酵液和CPLK1314发酵液塘口的氨氮含量相对于对照塘口，均略有下降，但在HCK2和CPLK1314发酵液处理的塘口无显著差异，说明HCK2和CPLK1314对塘口中的产氨菌均具有一定抑制作用。结果如图6发现喷晒HCK2发酵液和CPLK1314发酵液塘口的pH值相对对照塘口波动范围窄，说明HCK2和CPLK1314在维持养殖水体环境稳定具有一定作用。

2、虾的生长检测。

虾重测量：每隔15天，每个塘口取50只克氏原螯虾带回实验室，用天平测量每只虾的重量，各个塘口的50个数据取其平均值为各自塘口的虾重，塘口一和塘口二的虾重再取其平均值作为空白对照的虾重，塘口三和塘口四的虾重取其平均值作为喷洒了高产罗克霉素的贝莱斯芽孢杆菌HCK2的虾重数据，塘口五和塘口六的虾重取其平均值作为喷洒了微产罗克霉素CPLK1314的虾重数据，制成生长曲线图(图7)。

如图7，由克氏原螯虾的生长曲线可知，克氏原螯虾在30d至90d的体重是呈快速上升的阶段，在90d至120d，体重增长趋于平缓。通过实验发现空白塘口虾总重为1090.5kg，喷洒了贝莱斯芽孢杆菌HCK2的塘口虾总重为1355.5kg，比其空白对照增产24.30％，喷洒了贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314的塘口虾总重为 1179kg，比空白对照增产8.12％。

病虾检测：将每个塘口称量过虾重的50只虾进行健康状况检测，根据观察克氏原螯虾是否有活力，虾壳的颜色是否正常以及解剖虾后，观察克氏原螯虾的肠道，头部是否水肿，鳃部是否正常和肉质是否紧致等问题，判断虾是否患病。病虾的壳有烂壳现象，不正常颜色；克氏原螯虾的肠道有蓝色色素，无食，分节现象，肉质不紧致，发白，诊断为肠炎。

根据上述检测标准检测后，计算病虾率，绘制曲线图，结果如图8所示。发现喷洒贝莱斯芽孢杆菌HCK2的塘口，克氏原螯虾的发病率比喷洒贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314的塘口和空白对照发病率低，说明喷洒HCK2可以在一定程度上能降低克氏原螯虾的发病率。

实施例5

本实施例涉及贝莱斯芽孢杆菌HCK2在饲料中的应用。

以基础饲料(金大地小龙虾配合饲料，粗蛋白28％，粒径2.8mm)为对照组，在每1kg基础饲料中分别添加180ml微产罗克霉素的贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314 发酵液和180ml高产罗克霉素的贝莱斯芽孢杆菌HCK2发酵液配置免疫饲料。每组三个重复，进行了为期30d的养殖试验，饲喂条件为每天的早上9:00和 17:00，投食量为虾重的7％。每5d取样，以克氏原螯虾血清中的酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、一氧化氮合酶(NOS)和溶菌酶(LSZ)活性为免疫指标，采用常规方法或商用试剂盒进行检测。

结果如图9显示：添加贝莱斯芽孢杆菌的实验组克氏原螯虾血清中ACP、 AKP、NOS和LSZ活性明显高于对照组，贝莱斯芽孢杆菌HCK2的效果优于贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314。其中加入HCK2的实验组的抗病性最好。

实施例6

本实施例涉及贝莱斯芽孢杆菌HCK2在抑制白斑综合症病毒(WSSV)繁殖的应用。提取对照和经过贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314和贝莱斯芽孢杆菌HCK2 按照实施例5处理的克氏原螯虾的基因组DNA，使用引物WSSVF(5`-AGC TCC AAC ACC TCC TCC TTC A-3`)和WSSVR(5`-TTA CTC GGT CTC AGT GCC AGA-3`)进行荧光定量PCR测定病毒拷贝数。荧光定量PCR反应体系(10μL)：5μL 2×Premix Ex Taq，200ng基因组DNA，2μL vF2(1μM)，2μL vR1(1μM)。Real time PCR程序为：95℃ 3min；95℃ 30s，60℃，50s，共40循环；制作60-95℃的溶解曲线，每0.5℃读板；10℃保存。Real time PCR重复三次；qRT-PCR仪是 real-time thermalcycler(Bio-Rad,USA)。结果如图10所示贝莱斯芽孢杆菌HCK2 抑制WSSV病毒繁殖的效果优于贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314，相对于对照，病毒含量下降最大倍数分别达200倍和50倍，显示出强的抗抑制WSSV病毒繁殖的活性。

结论认为，饲料中添加益生菌贝莱斯芽孢杆菌HCK2能提高克氏原螯虾非特异性免疫水平和抗病的能力，可以作为新型克氏原螯虾免疫增强剂应用于克氏原螯虾养殖业。

Claims (6)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌突变株，其特征在于，命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HCK2，保藏编号为CCTCC NO：M2019396。

2.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株在生产抗生素中的应用，所述抗生素为罗克霉素。

3.一种抗生素的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株接种于培养基中进行发酵，从发酵液中分离得到所述的抗生素，所述抗生素为罗克霉素。

4.一种生防制剂或饲料，其特征在于，含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株的菌丝体、芽孢或发酵产物。

5.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株在制备抑制细菌或病毒制剂中的应用，所述细菌为金黄色葡萄球菌，所述病毒为白斑综合症病毒。

6.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌突变株在制备防治克氏原螯虾病害、提高克氏原螯虾免疫力的制剂中的应用。

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