CN114292864B - 高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用，所述贝莱斯芽孢杆菌突变株以贝莱斯芽孢杆菌HCK2为出发菌株，利用同源重组原理，敲除或者失活贝莱斯芽孢杆菌HCK2基因组中负调控RapF、SerA基因所得。本发明构建的单基因敲除突变株ΔSerA、ΔRapF和双基因突变株ΔRapF+SerA在发酵条件下用于高效生产表面活性素产量，其中RapF+SerA突变株在优化的培养基和发酵条件下用于生产表面活性素产量是贝莱斯芽孢杆菌HCK2的5倍，在5L发酵罐40‑50h可稳定生产表面活性素约16.5g/L。该表面活性素高产基因突变株及其构建方法为加速表面活性素的产业化提供原材料。

Description

高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一类高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用。

背景技术

表面活性素是由枯草芽孢杆菌和相关物种产生的一种环状脂肪七肽内酯，它包含两个酸性氨基酸(Glu和Asp)，旁边有五个非极性残基和一个3-羟基脂肪酸。由于其出色的表面活性和抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原生质的活性，它具有广泛的生物技术和治疗应用。然而，野生的芽孢杆菌菌株的表面活性素产量通常为每升几十毫克，很少超过每升1克。这使得表面活性素的生产非常昂贵，从而限制了表面活性素进入实际应用。通过物理化学诱变和野生的芽孢杆菌菌株的发酵优化来提高表面活性素的生产，已经得到了广泛和深入的研究。最近，基于表面活性素的生物合成途径和分子调控机制的基因工程方法来提高芽孢杆菌的表面活性素产量得到了极大的关注。

表面活性素不仅具有抗菌活性，而且作为一种信号分子参与到芽孢杆菌菌株的多细胞行为中，包括蜂群运动、细胞分化和生物膜形成。因此，Surfactin的生物合成与其他生物活性分子一样受到非常严格的监管。srfA的表达受一个依赖细胞密度的双组分法定量感应系统ComP-ComA控制。在生长后期，膜激酶ComP能够感知累积的典范寡肽ComX进入激活状态，通过磷酸化(ComA～P)刺激转录因子ComA的活性。最终，ComA～P以四聚体形式与srfA操作子的启动子(PsrfA)结合，并与sigA合作，激活srfA基因的转录表达。另一个调节途径是由phrC编码的典范寡肽CSF介导的。CSF由寡肽渗透酶在细胞内运输，并与Rap蛋白结合，导致其去磷酸化的酶活性丧失，从而维持ComA的磷酸化水平，促进srfA基因转录和表面活性素的合成。除了正向调节器ComA和sigA，srfA操作子的表达也通过几个负向调节器进行调节。全局调节器CodY和AbrB可以通过直接结合到srfA启动子区域来抑制srfA的转录。调节器SpX通过阻断comA和RNA聚合酶之间的相互作用来抑制srfA的表达。PerR、sinI和PhoP等负调控因子也参与了抑制srfA表达的详细报道。此外，自我抵抗基因SwrC(yerP的同义词)编码强大的表面活性素出口器，对于表面活性素的高产量也是必不可少的。有趣的是，只有一小部分处于对数生长后期的细胞可以分化为生产表面活性剂的细胞，而感应到表面活性素信号的外围细胞会关闭表面活性素的合成途径，分化为合格细胞、细胞外基质生产者等。然而，人们对表面活性素的自我反馈抑制性信号通路知之甚少。总的来说，随着对表面活性素的分子调控、自身免疫和反馈抑制机制的逐步深入，将大大有助于我们通过合理的设计方法提高表面活性素的产量。

通过传统的化学、紫外和离子植入诱变和发酵优化，表面活性素产量难以取得重大突破。通过替代原生启动子、增强免疫基因表达和修饰转录因子等策略构建高产表面活性剂的转基因菌株，最近受到高度关注并取得了重大进展。与大多数野生型芽孢杆菌菌株如MT45和B3非常难以转化相比，贝莱斯芽孢杆菌HCK2天然具有吸收裸露的DNA和同源重组的能力，理想地适用于遗传操作。鉴于贝莱斯芽孢杆菌HCK2具有很强的合成和分泌脂肽的能力，并且可以进行基因工程，因此贝莱斯芽孢杆菌HCK2是一个理想的菌株，可以通过基因改造构建成一个高产的表面活性素细胞工厂。申请人在先专利中报道过一种高产表面活性素的基因工程菌(CN112625986A)以解淀粉芽孢杆菌CPLK1314为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控ComQ基因所得。本发明失活ComQ的基因工程菌在优化的培养基和发酵条件下用于生产表面活性素，在5L发酵罐40-50h可稳定生产表面活性素5-6g/L。其中，突变株ΔComQ在LB培养基中表面活性素产量2.5±0.4g/L，在其优化的培养基中表面活性素产量5.5±0.5g/L。

虽然工程菌的表面活性素产量明显高于天然菌，但发酵产量仍难以满足工业生产的要求。因此，在以往研究的基础上，可以试图优化培养条件，进一步提高基因工程菌表面活性素的发酵产量。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一类高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株，本发明通过对HCK2基因组中负调控基因RapF和SerA进行敲除或者缺失构建得到了全新的高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株。

本发明还提供所述高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株的构建方法与应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一类高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株，所述贝莱斯芽孢杆菌突变株以贝莱斯芽孢杆菌HCK2出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因RapF和/或SerA所得。

其中，所述负调控RapF和SerA基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

其中，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌HCK2，保藏号CCTCC NO:M2019396。

本发明所述的高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株的构建方法，包括如下步骤：

(1)以RapF和SerA基因核酸序列设计引物，以贝莱斯芽孢杆菌HCK2的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到RapF和SerA基因片段；

(2)对PCR扩增产物和质粒进行双酶切，得到酶切基因片段和线粒质粒片段，经酶连得到重组质粒pUCSCRapF和pMUTIN4SerA。

(3)将重组质粒pUCSCRapF和pMUTIN4SerA同时或者分别转入贝莱斯芽孢杆菌HCK2中，构建得到三种突变菌株贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF、贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔSerA、贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA。

本发明中将构建的RapF基因突变载体pUCSCRapF转化入贝莱斯芽孢杆菌HCK2中，在基因组RapF基因位点发生交换，卡那霉素和壮观霉素双抗性平板上筛选得到卡那霉素和壮观霉素双抗性突变菌株ΔRapF；将构建的SerA基因突变载体pMUTIN4SerA转化入贝莱斯芽孢杆菌HCK2中，在基因组SerA基因位点发生交换，卡那霉素和红霉素双抗性平板上筛选得到卡那霉素和红霉素双抗性突变菌株ΔSerA；将构建的SerA基因突变载体pMUTIN4SerA转化入贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF中，在基因组SerA基因位点发生交换，卡那霉素、壮观霉素和红霉素三抗性平板上筛选得到卡那霉素、壮观霉素和红霉素三抗性突变菌株ΔRapF+SerA。

其中，步骤(1)所述的引物优选分别为：

RapFF：5′-TTT AAGCTT GTCAAAGATTGTATCGAGAA-3′

RapFR：5′-TTT GGATCC TTTCATACAACTTCACACCT-3

SerAF：5′-TTT AAGCTT CTCAGATAAGATGAGCAATG-3′

SerAR：5′-TTT GGATCCTTCCACTTCAAACACGTCAA-3′。

作为优选，步骤(2)所述的限制性内切酶为Hind III和BamH I，所述质粒包括pUCSC和pMUTIN4。

本发明所述高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株在生产表面活性素中的应用。

其中，所述贝莱斯芽孢杆菌突变株进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在35-37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期40-50h。

其中，所述发酵培养基组成为：葡萄糖10-15g/L，谷氨酸5-8g/L，K₂HPO₄1-3g/L，KH₂PO₄ 1-3g/L，KCl 1g/L，MnSO₄·7H₂O 500mg/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，CuSO₄·5H₂O 160mg/L，其余为水，pH 7.0。

作为优选，所述发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，谷氨酸5g/L，K₂HPO₄1g/L，KH₂PO₄1g/L，KCl 1g/L，MnSO₄·7H₂O 500mg/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，CuSO₄·5H₂O 160mg/L。

本发明所述负调控基因RapF和/或Ser在调控贝莱斯芽孢杆菌表面活性素产量中的应用。

本发明以贝莱斯芽孢杆菌HCK2作为出发菌株，通过同源重组的方法，对能提高表面活性素的基因RapF和SerA进行插入突变。具体包括：PCR克隆扩增RapF和SerA部分序列DNA、酶切和连接、转化、筛选并鉴定、同源单交换重组质粒转入贝莱斯芽孢杆菌HCK2中、检测鉴定等步骤。初步研究表明，通过该方法所获得的改造后的菌株，经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin的能力大大提高。

本发明在转座诱变获得贝莱斯芽孢杆菌HCK2的基础上，通过累积敲除负调控基因RapF(aspartate phosphatase天冬氨酸磷酸酶)和SerA(D-3-phosphoglyceratedehydrogenase D-3-磷酸甘油酸脱氢酶)提高表面活性素的产量，其效果优于现有的贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌及其工程菌。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

通过对贝莱斯芽孢杆菌HCK2基因组中负调控RapF和/或SerA基因敲除或者失活构建出高产表面活性素的突变株，其表面活性素产量可以达到9.3g/L，该突变株与HCK2相比表面活性素的产量提高了5倍。

同时本发明设计优化的培养基，在优化后的培养基中每升发酵液可制备获得约16.5g/L表面活性素，相比常规的LB培养基表面活性素产量可以提高1倍以上。本发明的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和发酵应用为加速表面活性素的产业化提供原材料。

附图说明

图1为构建载体pUCSC-RapF凝胶电泳图。A图为RapF部分序列DNA片段的PCR产物凝胶电泳图，其中Marker：2000；1-2:RapF基因中长736bp的DNA片段。B图为质粒pUCSCSrf电泳图谱，其中Marker：5000；1:质粒载体pUCSCSrf双酶切电泳图谱；2:质粒载体pUCSCSrf单酶切电泳图谱。C图为所构建重组质粒pUCSC-RapF电泳图谱，其中Marker：5000；1、3：所构建重组质粒pUCSC-RapF双酶切电泳图谱；2、4：所构建重组质粒pUCSC-RapF单酶切电泳图谱。D图为所构建重组质粒pUCSC-RapF菌落电泳图谱，其中Marker：2000；1-8:RapF基因中长736bp的DNA片段；

图2为构建载体pMUTIN4-SerA凝胶电泳图。A图为SerA部分序列DNA片段的PCR产物凝胶电泳图，其中Marker：2000；1-2:SerA基因中长757bp的DNA片段。B图为质粒pMUTIN4电泳图谱，其中Marker：5000；1:质粒载体pMUTIN4双酶切电泳图谱；2:质粒载体pMUTIN4单酶切电泳图谱。C图为所构建重组质粒pMUTIN4-SerA电泳图谱，其中Marker：5000；1、4：所构建重组质粒pMUTIN4-SerA双酶切电泳图谱；2、3：所构建重组质粒pMUTIN4-SerA单酶切电泳图谱。D图为所构建重组质粒pMUTIN4-SerA菌落电泳图谱，其中Marker：2000；1-5:SerA基因中长757bp的DNA片段；

图3为用于失活RapF基因的同源重组质粒载体pUCSCRapF；

图4为用于失活SerA基因的同源重组质粒载体pMUTIN4SerA；

图5为构建失活负调控RapF、SerA基因的工程菌技术原理示意图；

图6为贝莱斯芽孢杆菌HCK2和RapF、SerA的基因失活突变株ΔRapF、ΔSerA、ΔRapF+SerA的产表面活性素高效液相色谱分析示意图；

图7表面活性素的质谱检测；

图8为贝莱斯芽孢杆菌HCK2和RapF、SerA的基因失活突变株ΔRapF、ΔSerA、ΔRapF+SerA抑制金黄色葡萄球菌活性示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。其中贝莱斯芽孢杆菌HCK2，保藏号CCTCC NO:M2019396，由淮阴工学院提供，申请人在先专利中(CN110540949A)已经公开保藏。

pMUTIN4质粒来源于美国芽孢杆菌菌株保藏中心(BacillusGenetic StockCenter)，货号分别ECE139(参考文献：Vagner V et ai.(1998)Microbiol 144:3097)。

pUCSC质粒来源于淮阴工学院。以pDG1728质粒作为模板，PCR扩增到一条长1182bp的含有壮观霉素表达盒的片段；表达盒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后克隆至pUC19载体，构建为重组载体pUCSC，可参考文献：罗楚平，张婧，季冬淳，陈树桥等.表面活性素、杆菌霉素L、罗克霉素和泛革素4种脂肽类抗生素高效制备方法及其生物学活性[J].西南农业学报，1001-4829(2018)11-2307-08.。

贝莱斯芽孢杆菌HCK2感受态细胞制备相关试剂配制：GCHE液体培养基：GCHE液体培养基：以200ml为例(葡萄糖100g，L-谷氨酸钾0.4g，柠檬酸三钠0.18g，柠檬酸铁铵0.022g，L-色氨酸0.101g，酪蛋白化合物20g，K₂HPO₄2.2822g，KH₂PO₄ 1.3609g)；

GE液体培养基：以200ml为例(葡萄糖100g，L-谷氨酸钾0.4g，柠檬酸三钠0.18g，柠檬酸铁铵0.022g，L-色氨酸0.101g，K₂HPO4 2.2822g，KH₂PO₄ 1.3609g)。

实施例1

重组质粒载体的构建

(1)引物设计

根据贝莱斯芽孢杆菌HCK2基因组DNA中的RapF和serA基因的基因序列，设计引物RapFF/RapFR和SerAF/SerAR。并以贝莱斯芽孢杆菌HCK2的基因组DNA为模板，分别以引物RapFF/RapFR进行PCR扩增得到RapF部分基因；以引物SerAF/SerAR进行PCR扩增得到SerA部分基因(RapF基因的片段为736bp，SerA基因的片段为757bp)。

引物序列如下：

RapFF：5′-TTT AAGCTT GTCAAAGATTGTATCGAGAA-3′

RapFR：5′-TTT GGATCC TTTCATACAACTTCACACCT-3′

SerAF：5′-TTT AAGCTT CTCAGATAAGATGAGCAATG-3′

SerAR：5′-TTT GGATCCTTCCACTTCAAACACGTCAA-3′

PCR体系如下表1：

表1

PCR反应程序如下：1)95℃预变性5min；2)95℃变性30S，49℃(RapF)/53℃(SerA)退火45S，72℃延伸1min，三个步骤进行33次循环，72℃再延伸7min。

(2)酶切和连接

使用Hind III和BamH I限制性内切酶对PCR扩增产物和质粒进行双酶切，80μL双酶切体系设计如下表2：

表2

37℃，酶切2小时。

对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收酶切产物。将得到的酶切基因片段和线粒质粒片段经T4DNA连接酶进行连接，15μL的线性化后质粒与DNA片段连接体系如下(表3)：

表3

16℃连接3h，其中pUCSC线性化质粒连接纯化后的DNA片段(RapF)，其中pMUTIN4线性化质粒连接纯化后的DNA片段(SerA)。

(3)转化、筛选并鉴定

通过氯化钙转化法将上步骤中得到的连接产物转入大肠杆菌DH5α中，并涂布于含有100μL/mL氨苄青霉素的LB固体培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸膏粉，5g/L NaCl)上以筛选出阳性克隆，提取质粒。

重组质粒pUCSCRapF(图3)双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳验证得到3868bp和736bp两条大小的条带，与预期结果相符合；重组质粒pUCSCRapF单酶切后1％琼脂糖凝胶电泳验证得到一条4580bp大小的条带，与预期结果相符合，其序列如SEQ ID NO.3所示。

重组质粒pMUTIN4SerA(图4)双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳验证得到8610bp和757bp两条大小的条带，与预期结果相符合；重组质粒pMUTIN4SerA单酶切后1％琼脂糖凝胶电泳验证得到一条9367bp大小的条带，与预期结果相符合，本实施例中SerA、pMUTIN4序列和酶切位点是已知的，所以构建重组质粒pMUTIN4SerA是明确的，本发明中未列出其序列。

(4)菌落PCR

进一步地，对正确的转化子进行菌落PCR检测鉴定，以步骤(1)中所设计的上下引物进行扩增，以正确的转化子的菌落为模板，扩增条件如步骤(1)，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1和图2。其结果验证正确。

实施例2

突变株的构建

将重组质粒载体转入贝莱斯芽孢杆菌HCK2中，在37℃的条件下经含有抗性的培养基进行筛选，筛选得到的转化子经过重组质粒随机插入验证得到正确的突变菌株，其构建失活负调控RapF、SerA基因的工程菌技术原理如图5。

上述的突变株的具体构建方法如下：

制备贝莱斯芽孢杆菌HCK2感受态细胞和重组质粒随机插入验证

将保存于-80℃超低温冰箱中的菌株HCK2，划线后置于37℃培养箱培养24h；

挑取HCK2单菌落并接种于5mL无抗生素的GCHE液体培养基中37℃、160rpm/min振荡培养12h；

取1mL HCK2菌液加入到24mL新的无抗生素GCHE液体培养基中，于摇床上28℃、180rpm/min振荡培养；

分别在2h、2.5h、3h、3.5h、4h五个时间段吸取1mL培养液，加入到1mL无抗生素GE液体培养基中，37℃、200rpm/min振荡培养1h；

每个时间段培养1小时后，5000rpm离心10分钟，浓缩至400uL加入相应的重组质粒DNA(实施例1制备，约3μg)，37℃，180rpm/min培养90分钟，然后5000rpm离心1分钟。弃去300μL上清液，将沉淀的菌体与剩余的上清液混合，得到100μL菌悬液，涂在抗性板上(其中pUCSCRapF为卡那霉素10μg/mL和壮观抗性50μg/mL；pMUTIN4SerA为卡那霉素10μg/mL和红霉抗性1μg/mL)，37℃培养24h，然后观察培养基上是否有菌落生长。

从中挑出单个菌落，接种到含有抗生素(其中pUCSCRapF为卡那霉素10μg/mL和壮观抗性50μg/mL；pMUTIN4SerA为卡那霉素10μg/mL和红霉抗性1μg/mL)的LB液体培养基上，37℃，180rpm/min培养过夜，观察菌落是否生长，如果菌落正常生长，初步断定质粒转入成功。然后用接种环在含有抗生素的(其中pUCSCRapF为卡那霉素10μg/mL和壮观抗性50μg/mL；pMUTIN4SerA为卡那霉素10μg/mL和红霉抗性1μg/mL)LB固体平板上划线培养，37℃24小时，观察菌落是否生长。菌落是否能在相应抗性的LB培养基上生长，用来验证重组质粒是否成功转移到菌株HCK2中。

通过上述方法，ΔRapF突变菌株的构建：以贝莱斯芽孢杆菌HCK2为出发菌株制备感受态细胞，采用化学转化方法，将构建的RapF基因突变载体pUCSCRapF转化入贝莱斯芽孢杆菌HCK2中，在基因组RapF基因位点发生交换，卡那霉素和壮观霉素双抗性平板上筛选得到卡那霉素和壮观霉素双抗性菌株，经过验证后，获得正确的突变菌株，命名为ΔRapF；ΔSerA突变菌株的构建：将构建的SerA基因突变载体pMUTIN4SerA转化入贝莱斯芽孢杆菌HCK2感受态细胞中，在基因组SerA基因位点发生交换，卡那霉素和红霉素双抗性平板上筛选得到卡那霉素和红霉素双抗性菌株，经过验证后，获得正确的突变菌株，命名为ΔSerA；ΔRapF+SerA突变菌株的构建：将构建的SerA基因突变载体pMUTIN4SerA转化入贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF感受态细胞中(感受态细胞的制备和质粒的导入按上述步骤)，在基因组SerA基因位点发生交换，卡那霉素10μg/mL、壮观霉素50μg/mL和红霉素1μg/mL三抗性平板上筛选得到卡那霉素、壮观霉素和红霉素三抗性菌株，经过验证后，获得正确的突变菌株，命名为ΔRapF+SerA；以上所述突变株可以在生产脂肽类抗生素Surfactin中应用，生产贝莱斯芽孢杆菌抗菌肽产品。

实施例3

表面活性素发酵提取方法

对实施例2构建的贝莱斯芽孢杆菌突变株发酵产表面活性素的定性定量分析。

从平板上依次挑取实施例2构建的不同的贝莱斯芽孢杆菌突变株单菌落至5mL LB液体含对应抗性培养基中37℃、180r/min培养16h，转接至50mL LB液体培养基中37℃、180r/min培养24h，制备种子液，活化后的菌株分别按体积比10％接种量接入5L发酵罐，新鲜的LB发酵培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母浸膏粉，5g/L NaCl和优化的培养基(葡萄糖20g/L，谷氨酸5g/L，K₂HPO₄ 1g/L，KH₂PO₄ 1g/L，KCl 1g/L，MnSO₄·7H₂O 500mg/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，CuSO₄·5H₂O 160mg/L)开始发酵，发酵过程中控制pH值在7.0，温度维持在37℃，溶氧在30％左右，通过DNS法测定发酵液中的还原糖含量，当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在3g/L，利于后续产物积累，发酵48小时；发酵液通过8000r/min离心10min获得发酵上清液，上清液用6mol浓盐酸调节pH到2.5，4℃冰箱静置过夜。上清液通过12000r/min离心20min获得沉淀，100％甲醇溶液溶解发酵粗提物，冰箱静置过夜，8000r/min离心10min后用0.22μm有机系过滤器进行过滤除去大颗粒杂质制备初提的表面活性素。

表面活性素检测方法

表面活性素用于高效液相色谱HPLC的检测条件为：安捷伦1200系列高效液相色谱HPLC和C18柱(5μm，4mm×250mm；Merck，Frankfurt，Germany)流动相为(乙腈：水：三氟乙酸(20：80：0.05(V/V))，检测波长均为210nm，流速为0.8mL/min，柱温是30℃，对上述贝莱斯芽孢杆菌突变株发酵产表面活性素的量见图6和表7。

表面活性素的质谱检测条件：质谱分析的仪器为Agilent 6410三重串联四级杆质谱仪，购自美国安捷伦科技股份有限公司。按照上述方法粗制备脂肽类化合物，采用含有饱和α-氰基-4-羟基桂皮酸，0.1％三氟乙酸，乙腈和水(体积比3﹕1)溶液稀释1 000倍后，通过注射器直接进样。采用质谱法测定粗提脂肽类化合物的分子质量，电喷雾条件为：毛细管电压32V、喷雾电压20kV、毛细管温度320℃。检测方式：正离子。表面活性素的质谱检测结果见图7。

表7对贝莱斯芽孢杆菌突变株发酵产表面活性素

由图6和表7可以看出，本发明构建的突变株ΔRapF、ΔSerA、ΔRapF+SerA发酵后可产生大量的表面活性素，并且明显优于贝莱斯芽孢杆菌HCK2，其中本发明中突变株ΔRapF+SerA，同时敲除负调控基因RapF和Ser效果更加显著，具有显著的协同增效的效果，其表面活性素产量提升率显著超过两种单一突变之和。此外，采用本发明优化后的培养基，其表面活性素产量可以进一步提高。

实施例4

抑菌圈实验

采用牛津杯法对实施例2贝莱斯芽孢杆菌突变株抑制金黄色葡萄球菌的抑菌活性进行测定，具体方法如下：挑取金黄色葡萄球菌的单菌落接于5mL LB液体培养基中，37℃，180rpm/min震荡培养12h。按体积比2％的量将金黄色葡萄球菌菌液接种至100mL冷却至40℃的LB固体培养基中，混匀后倒入无菌平板中，将平板等分并做好标注，无菌操作下夹取牛津杯垂直放置在无菌平板中，各取200uL实施例2贝莱斯芽孢杆菌突变株的发酵上清液加入到牛津杯中，进行实验对比，静置平放于37℃培养箱中培养24h，观察牛津杯周围抑菌圈，抑菌圈直径(mm)＝测量总直径(mm)-牛津杯直径(mm)。结果如图8，从图8可以看出，双基因突变株ΔRapF+SerA发酵上清液抑菌效果明显优单基因敲除突变株ΔSerA、ΔRapF以及HCK2。

序列表

<110> 淮阴工学院

江苏省农业科学院

<120> 高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 736

<212> DNA

<213> 人工序列(RapFArtificial Sequence)

<400> 1

gtcaaagatt gtatcgagaa agctgaattt tattttaaga tgtcagagtc ctactattat 60

atgaaacaga cttatttttc tatggattat gcccggcagg cttataaaat ttatcataag 120

caggaggcat ataatataag ggtgcttcag tgccattcat tgttcgctac caactttctt 180

gacttaaagc aatatgatga agcaattcag cattttaaaa aggcttatgc catggcagag 240

gcagaacagc agccacaatt aatgggccgg actctatata atatcggact ttgttttaac 300

agccaagaaa attacaaacc agccattgat tacataaaac gggcaatagc tgtttttgaa 360

gatgggaaca tcatcacttc tctcccgcaa gcctatttct taatcacaca aatacattat 420

aaaatcggaa atatggccat agccagacaa tatcatgaca aaggggtatc ttatgcagag 480

gaggcagaag attccctata tatcgccgag tatgaatttt tagaatcttt atatgtcggt 540

gagcctgatg aagaagcaat catggaatgt tttgactttc tcagagataa atcgatgtat 600

gctgatcttg aagattttgc cttagatgtg gcaaaatatt atcatgaaag agaaaatttc 660

gagaaggctt ccgcatattt tttaaaggtg gaagaaacaa gacagcagat tcaaggaggt 720

gtgaagttgt atgaaa 736

<210> 2

<211> 757

<212> DNA

<213> 人工序列(SerAArtificial Sequence)

<400> 2

ctcagataag atgagcaatg acggcttaaa gccgctgatg gaatcagact ttatagaaat 60

tgttcaaaaa aacgtcgcgg atgcagaaga tgaattacat acctttgatg ccctgttagt 120

ccgcagtgcc acgaaagtaa ccgaagaatt gtttaagaaa atgacctctt taaaaatcgt 180

cggcagagcc ggtgtcggcg tagacaacat cgacattgat gaggctacaa aacatggggt 240

tatcgtgata aacgcgccga atggaaacac catttcaacg gcagagcata cattcgcgat 300

gatttcttca ttaatgagac acattccgca agccaatatc tcagtaaaat caagagaatg 360

gaaccggacg gcttttgtcg gggcggagct ctacggaaag actttaggca ttgtcggtct 420

gggccggatc ggaagcgaga ttgcccagcg cgccagagcg ttcggtatga cggttcatgt 480

attcgatcct ttcttaaccg aagagagagc cggcaaaatc ggcgtaaaca gccggacatt 540

cgaagaagtg cttgaaagcg cggatatcat taccgtccac acgcctttaa caaaggaaac 600

aaaaggactg cttaacagag aaaccattgc caaaacgaaa aaaggcgtcc gtcttatcaa 660

ctgcgcaaga ggcggcatta ttgatgaagc ggcgcttttg gaagcgctgg aaagcggcca 720

tgtcgcaggc gctgcccttg acgtgtttga agtggaa 757

<210> 3

<211> 4580

<212> DNA

<213> 人工序列(pUCSCRapFArtificial Sequence)

<400> 3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cctgcagccc tggcgaatgg 420

cgattttcgt tcgtgaatac atgttataat aactataact aataacgtaa cgtgactggc 480

aagagatatt tttaaaacaa tgaataggtt tacacttact ttagttttat ggaaatgaaa 540

gatcatatca tatataatct agaataaaat taactaaaat aattattatc tagataaaaa 600

atttagaagc caatgaaatc tataaataaa ctaaattaag tttatttaat taacaactat 660

ggatataaaa taggtactaa tcaaaatagt gaggaggata tatttgaata catacgaaca 720

aattaataaa gtgaaaaaaa tacttcggaa acatttaaaa aataacctta ttggtactta 780

catgtttgga tcaggagttg agagtggact aaaaccaaat agtgatcttg actttttagt 840

cgtcgtatct gaaccattga cagatcaaag taaagaaata cttatacaaa aaattagacc 900

tatttcaaaa aaaataggag ataaaagcaa cttacgatat attgaattaa caattattat 960

tcagcaagaa atggtaccgt ggaatcatcc tcccaaacaa gaatttattt atggagaatg 1020

gttacaagag ctttatgaac aaggatacat tcctcagaag gaattaaatt cagatttaac 1080

cataatgctt taccaagcaa aacgaaaaaa taaaagaata tacggaaatt atgacttaga 1140

ggaattacta cctgatattc cattttctga tgtgagaaga gccattatgg attcgtcaga 1200

ggaattaata gataattatc aggatgatga aaccaactct atattaactt tatgccgtat 1260

gattttaact atggacacgg gtaaaatcat accaaaagat attgcgggaa atgcagtggc 1320

tgaatcttct ccattagaac atagggagag aattttgtta gcagttcgta gttatcttgg 1380

agagaatatt gaatggacta atgaaaatgt aaatttaact ataaactatt taaataacag 1440

attaaaaaaa ttataaaaaa attgaaaaaa tggtggaaac acttttttca atttttttgt 1500

tttattattt aatatttggg aaatattcat tctaattggt aatcagattt tagaaaacaa 1560

taaacccttg cataggggga tctgagctcg gtacccgggg atccgtcaaa gattgtatcg 1620

agaaagctga attttatttt aagatgtcag agtcctacta ttatatgaaa cagacttatt 1680

tttctatgga ttatgcccgg caggcttata aaatttatca taagcaggag gcatataata 1740

taagggtgct tcagtgccat tcattgttcg ctaccaactt tcttgactta aagcaatatg 1800

atgaagcaat tcagcatttt aaaaaggctt atgccatggc agaggcagaa cagcagccac 1860

aattaatggg ccggactcta tataatatcg gactttgttt taacagccaa gaaaattaca 1920

aaccagccat tgattacata aaacgggcaa tagctgtttt tgaagatggg aacatcatca 1980

cttctctccc gcaagcctat ttcttaatca cacaaataca ttataaaatc ggaaatatgg 2040

ccatagccag acaatatcat gacaaagggg tatcttatgc agaggaggca gaagattccc 2100

tatatatcgc cgagtatgaa tttttagaat ctttatatgt cggtgagcct gatgaagaag 2160

caatcatgga atgttttgac tttctcagag ataaatcgat gtatgctgat cttgaagatt 2220

ttgccttaga tgtggcaaaa tattatcatg aaagagaaaa tttcgagaag gcttccgcat 2280

attttttaaa ggtggaagaa acaagacagc agattcaagg aggtgtgaag ttgtatgaaa 2340

aagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 2400

tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 2460

ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 2520

ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 2580

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 2640

agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 2700

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 2760

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 2820

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 2880

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 2940

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 3000

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 3060

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 3120

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 3180

taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 3240

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 3300

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 3360

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 3420

catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 3480

atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 3540

ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 3600

gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 3660

agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 3720

gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 3780

agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 3840

catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 3900

aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 3960

gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 4020

taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 4080

caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 4140

ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 4200

ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 4260

tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 4320

aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 4380

actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 4440

catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 4500

agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 4560

tatcacgagg ccctttcgtc 4580

Claims (7)

1.高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)突变株，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌突变株以贝莱斯芽孢杆菌HCK2出发菌株，保藏号CCTCC NO:M2019396，敲除或者失活菌株基因组中基因RapF和/或SerA所得。

2.权利要求1所述的高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以RapF和SerA基因核酸序列设计引物，以贝莱斯芽孢杆菌HCK2的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到 RapF和SerA基因片段；

（2）对PCR扩增产物和质粒进行双酶切，得到酶切基因片段和线性质粒片段，经酶连得到重组质粒pUCSCRapF和pMUTIN4SerA；所述质粒为pUCSC和pMUTIN4；

（3）将重组质粒pUCSCRapF和pMUTIN4SerA同时或者分别转入贝莱斯芽孢杆菌HCK2中，构建得到三种突变菌株贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF、贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔSerA、贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA。

3.根据权利要求2的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述的引物为：

RapFF： 5′-TTT AAGCTT GTCAAAGATTGTATCGAGAA-3′

RapFR： 5′-TTT GGATCC TTTCATACAACTTCACACCT-3

SerAF ：5′-TTT AAGCTT CTCAGATAAGATGAGCAATG-3′

SerAR ：5′-TTT GGATCCTTCCACTTCAAACACGTCAA-3′。

4.根据权利要求2的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述的酶为Hind III和BamH I。

5.权利要求1所述高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株在生产表面活性素中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌突变株进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7 .0，温度维持在35-37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0 .1-5g/ L；发酵周期40-50h。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖10-15g/L，谷氨酸5-8g/L，K₂HPO₄ 1-3g/L，KH₂PO₄ 1-3g/L，KCl 1g/L，MnSO₄•7H₂O 500mg/L，FeSO₄•7H₂O5mg/L，CuSO₄•5H₂O 160mg/L，其余为水，pH 7.0。