CN108395996B - 一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医药技术领域，具体为一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途。本发明首先提供一株用于制备猪瘟病毒重组亚单位疫苗的马克斯克鲁维酵母重组菌株。该重组菌株是通过截取猪瘟病毒囊膜蛋白E2的抗原表位区域，经密码子优化获得猪瘟病毒mE2蛋白的编码序列，然后将其克隆到马克斯克鲁维酵母表达载体上并转化马克斯克鲁维酵母宿主菌株构建获得。本发明还提供制备猪瘟病毒亚单位疫苗的方法：利用mE2重组表达的马克斯克鲁维酵母重组菌株，经培养、离心、细胞破碎、分离纯化获得猪瘟病毒mE2蛋白抗原，纯化的抗原和佐剂复配制成猪瘟病毒重组亚单位疫苗。该猪瘟病毒mE2蛋白重组亚单位疫苗注射免疫可获得保护性IgG抗体，能够减少和预防猪瘟病毒感染所引起相关性疾病。

Description

一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途

技术领域

本发明属生物医药技术领域，具体涉及利用马克斯克鲁维酵母重组制备猪瘟病毒囊膜蛋白mE2；还涉及猪瘟病毒重组亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

猪瘟(Swine Fever，SF)，又称猪霍乱或烂肠瘟，为了便于与非洲猪瘟相区别，欧洲又称之为古典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)。猪瘟是由猪瘟病毒(Classical SwineFever Virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性传染病。以发病急、高热稽留、细小血管变性，引起出血、梗塞和坏死和高死亡率等为主要特征。猪瘟病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒属(Pestivirus)成员。这个病毒属还有牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrheavirus，BVDV)和绵羊边界病病毒(Border disease virus， BDV)，可分别感染牛群和羊群，并造成严重的经济损失。猪瘟是国际兽疫局(OIE)规定的A类法定传染病之一。我国《家畜家禽防疫条例实施细则》中也将其列为一类传染病。目前我国CSF的流行形式发生了很大变化，猪瘟疫情出现了反弹，主要表现为持续感染和隐性感染的共存，典型猪瘟和非典型猪瘟的共存、免疫耐受和带毒综合征共存等新的特点。CSFV感染新生仔猪后，引起急性或慢性感染，并可造成妊娠母猪的带毒综合征，从而导致胎儿的胎盘感染及新生仔猪的先天感染等现象，仍是对我国养猪业威胁最大的传染病。

CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒。病毒粒子呈球形，直径为40-50 nm，其核心外有脂蛋白囊膜，囊膜表面有许多长达6-8 nm的糖蛋白纤突，其核衣壳由单独衣壳蛋白组成，呈二十面体对称结构。病毒粒子的内部含有40 nm的电子致密的核衣壳，似乎呈六角。CSFV由5' 端非编码区、一个大的开放性阅读框(Open reading frame，ORF)和3'端非编码区三部分组成。5' 端非编码区约为360-373 bp，是CSFV基因组中最保守的部分。3'端非编码区约有229-243 bp，其终止密码子后为可变区，其中有50bp长的区域富含AT，3' 端在CSFV种内也非常保守。CSFV ORF编码3898个氨基酸残基的多聚前体蛋白，在病毒或宿主细胞蛋白酶的作用下裂解为12种病毒成熟蛋白，包括4种结构蛋白(C(p14)、E^rns ( gp44/48El)、E1(gp33)、E2 ( gp53))和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NSS和NSSB)。E^rns、E1、E2 这3种糖蛋白的病毒粒子是以二硫键相连，形成二聚体结构，其中E^rns和E2可通过二硫键形成同源二聚体，分子质量大小约为100KD。E2和E1之间还可形成异源二聚体，分子质量大小约为75 KD，三者均存在于感染细胞和病毒粒子中。4种结构蛋白中，免疫价值最高的是E^rns和E2蛋白，目前已成功制备了猪瘟病毒的感染性克隆，可将其用于病毒的复制/致弱、致病机制、疫苗研发等的研究。

以前临床上一直将高免血清与血毒同时肌肉注射，以此来对猪群进行免疫，但高免血清不仅工艺复杂，而且价格昂贵，另外血毒也会有散毒的风险，直到在20世纪后期，安全、有效的猪瘟弱毒疫苗慢慢广泛应用于临床。目前OIE推荐使用活毒疫苗和标记疫苗对猪瘟进行预防免疫，近年来继重组疫苗、亚单位疫苗之后又研制出了重组标记疫苗、亚单位标记疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗。E2包膜糖蛋白是猪瘟病毒CSFV的主要保护性抗原，在CSFV感染时诱导产生中和抗体，目前E2蛋白亚单位疫苗是最早也是唯一投入使用的猪瘟亚单位疫苗。E2亚单位疫苗可以减少垂直传播，但不能完全预防垂直传播，E2亚单位疫苗接种后，存在感染和接种差异，这种差异有利于快速筛查受感染的猪，帮助控制和消除CSFV。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫效果好、生产成本低、工艺简单以及更安全的猪瘟病毒亚单位疫苗及其供制备方法，本发明提供的猪瘟病毒亚单位疫苗可用于预防猪瘟病毒CSFV 引起的相关疾病。

（一）本发明的一方面，首先提供一种用于制备猪瘟亚单位疫苗的马克斯克鲁维酵母重组菌株，所述马克斯克鲁维酵母重组菌包含插入猪瘟病毒mE2基因的重组表达载体，和马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株；所述马克斯克鲁维酵母重组菌是由插入猪瘟病毒mE2基因的重组表达载体转化到马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建获得；所述重组表达载体是由编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列插入表达载体所构建获得。

本发明的一种实施例中，所述表达载体包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码猪瘟病毒mE2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列、营养缺陷筛选标记基因序列，且不含有无抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列。具体为：

1）SEQ ID No.6所示核苷酸序列；或

2）SEQ ID No.6所示核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸。

本发明的另一种实施例中，所述编码猪瘟病毒mE2蛋白是猪瘟病毒E2蛋白的主要抗原表位区域，位于E2蛋白的1-226氨基酸区域，所述编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1所示核苷酸序列；或

2）SEQ ID No.1所示核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码具有猪瘟病毒mE2蛋白活性衍生的核苷酸序列。

在一种更优的实施例中，上述的猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列是根据马克斯克鲁维酵母密码子偏好性，优化后编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列，具体为：

1）SEQ ID No.2所示核苷酸序列；或

2）SEQ ID No.2所示核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码具有猪瘟病毒mE2蛋白活性衍生的核苷酸序列。

本发明的另一种实施例中，所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。

优选地，上述特定营养基因为URA3基因。

在较优实施例中，上述马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10621（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年3月13日）。

（二）本发明的另一方面，提供一种利用马克斯克鲁维酵母制备猪瘟病毒mE2蛋白的方法，具体步骤为：

1）将编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；

2）用上述重组载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

3）使上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株发酵表达猪瘟病毒mE2蛋白；

4）收集发酵菌体，经离心、破碎、纯化，获得猪瘟病毒mE2蛋白。

其中，所述表达载体、所述编码猪瘟病毒mE2蛋白的序列、所述猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列，均如（一）中所述。

优选地，上述编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列，按照马克斯克鲁维酵母密码子偏好性的密码子优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，上述重组载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码上述猪瘟病毒mE2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列。

优选地，上述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌（CGMCCNo.10621）敲除部分或全部特定营养基因所得。

本发明还提供上述利用马克斯克鲁维酵母制备得到的猪瘟病毒mE2蛋白。

本发明的再一方面，提供一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗组合物（含猪瘟病毒mE2蛋白的疫苗组合物），用于预防和/或治疗由猪瘟病毒引发的疾病的药物和/或疫苗，包括：由上述方法制备的马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的猪瘟病毒mE2蛋白，以及药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的佐剂。

本发明中，所述猪瘟病毒重组亚单位疫苗组合物，其剂型包括但不限于用作液体注射剂、注射粉剂、注射片剂。

本发明中，所述辅料选自水包油、油包水、水包油包水佐剂中的任意一种或几种。

更优选地，上述辅料至少包括ISA201水包油包水矿物油佐剂、IMS1313水溶性纳米侳剂、GEL01新型纳米侳剂中的任意一种或几种。

在较优实施例中，上述辅料为IMS1313水溶性纳米侳剂。

本发明中，所述猪瘟病毒引发的疾病包括但不限于高热、呕吐、运动失调、后肢无力、先便秘后下痢、繁殖障碍，常产死胎、木乃伊胎和弱仔的任意一种或几种。

所述猪瘟病毒重组亚单位疫苗组合物，具体制备步骤为：

1）将编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；

2）用上述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

3）使上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株进行培养，表达猪瘟病毒mE2蛋白；

4）收集发酵菌体，经离心、破碎、纯化，获得猪瘟病毒mE2蛋白；

5）猪瘟病毒mE2蛋白与辅料，混合，乳化，获得含猪瘟病毒mE2重组亚单位疫苗组合物。

其中，所述表达载体、所述编码猪瘟病毒mE2蛋白的序列、所述猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列，均如（一）中所述。

优选地，上述编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列，按照马克斯克鲁维酵母密码子偏好性的密码子优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，上述重组载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码上述猪瘟病毒mE2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列。

优选地，上述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌（CGMCCNo.10621）敲除部分或全部特定营养基因所得。

在本发明范围内中，上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都应在本发明保护的范围。

附图说明

图1为猪瘟病毒mE2基因的PCR扩增产物的电泳图。其中，泳道1为GeneRuler 1kbDNA Ladder (Thermo), 泳道2为PCR的空白对照，泳道3为mE2基因的PCR扩增产物。

图2为猪瘟病毒mE2蛋白的表达检测。其中，(A) 马克斯克鲁维酵母重组菌Fim-1-mE2培养后细胞裂解液的SDS-PAGE分析。泳道1为马克斯克鲁维酵母表达宿主菌Fim-1ura3 ∆的细胞裂解液，泳道2为Pageruler Prestained Protein ladder (Thermo)，泳道3、4为马克斯克鲁维酵母重组菌Fim-1-mE2的细胞裂解液； (B) Western Blot检测马克斯克鲁维酵母重组菌Fim-1-mE2表达的mE2蛋白，泳道1、2为马克斯克鲁维酵母重组菌mE2的细胞裂解液。

图3为猪瘟病毒mE蛋白马克斯克鲁维酵母重组菌的发酵生长曲线。

图4为纯化的猪瘟病毒mE2蛋白。其中，（A）mE2蛋白纯化产物的SDS-PAGE检测，泳道1为Pageruler Prestained Protein ladder，泳道2为马克斯克鲁维酵母宿主菌Fim-1ura3 ∆的细胞裂解液，泳道3为马克斯克鲁维酵母重组菌Fim-1-mE2细胞裂解液的浓缩上清样品；泳道4为Fim-1-mE2细胞裂解液经分子筛纯化后的样品；（B）mE2蛋白纯化产物的Western检测。泳道1为Fim-1-mE2细胞裂解液的浓缩上清样品；泳道2为Fim-1-mE2细胞裂解液经分子筛纯化的样品。

图5为重组猪瘟病毒mE2蛋白免疫小鼠血清中抗体水平的检测。注射免疫小鼠每隔7天用ELISA检测血清中猪瘟病毒抗体IgG浓度，标准差±S.D中的n=5。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1、编码猪瘟病毒mE2蛋白的DNA序列的合成和扩增

比较国内外流行猪瘟病毒毒株，选择我国流行的猪瘟病毒CSFV亚型2.1b毒株（Classical Swine Fever Virus strain Hun23/2013，GenBank: KP233071.1）的E2基因序列，作为本发明重组表达的猪瘟病毒E2蛋白质序列的基因来源。

据文献报道，猪瘟病毒CSFV的主要抗原表位位于E2蛋白的第1-176位点内，因此本发明选择猪瘟病毒2.1b毒株E2基因的第1-678位核苷酸序列进行重组表达，并命名mE2基因。参照马克斯克鲁维酵母的密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下将mE2基因核苷酸序列进行密码子优化，优化后mE2基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成.。

以合成的mE2DNA为模板，用引物mE2-N125-F（序列如SEQ IDNo.4所示）和mE2-N125-R（序列如SEQ IDNo.5所示）PCR扩增mE2基因。PCR的过程参照Phanta Super FidelityDNA Polymerase的产品说明进行（Vazyme, 货号P505-d1/d2/d3）。通过琼脂糖电泳分析PCR扩增产物，获得了724bp的目的片段（图1）。按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工，货号B518131-0050)的说明书操作，对PCR产物进行回收。

实施例2、猪瘟病毒mE2蛋白马克斯克鲁维酵母重组表达载体的构建

用限制性酶Spe I和Sac II对马克斯克鲁维酵母表达载体pUKDN125进行双酶切，酶切产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收7.2kb左右的载体片段。采用Gibson Assembly无痕连接系统(NEB公司，货号E2611S/L) ，将mE2基因片段与载体片段进行连接，获得猪瘟病毒mE2蛋白马克斯克鲁维酵母重组表达载体pUKDN125-mE2。该重组载体包括酵母自主复制序列、菊粉酶启动子、猪瘟病毒mE2基因、菊粉酶终止子，筛选标记基因URA3启动子和其启动子。

实施例3、马克斯克鲁维酵母重组菌株Fim-1-mE2的构建

本发明采用的酵母表达宿主菌株来源于马克斯克鲁维酵母菌Fim-1（中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号CGMCC No.10621），通过同源重组的方法敲出除URA3基因，并利用含有5氟乳清酸(1.5g/L)的YPD筛选获得尿嘧啶缺陷的表达宿主菌，被命名为马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3∆。采用醋酸锂转化法（World Journal of Microbiology &Biotechnology 16: 653-654, 2000），将pUKDN125-mE2转入Fim-1ura3∆中。将转化后的产物涂布于SD平板（0.67%无氨基酸酵母氮源、2% 葡萄糖、2%琼脂），将平板放置30℃恒温培养箱培养，培养2-4天直至克隆形成。

实施例4、马克斯克鲁维酵母重组菌株Fim-1-mE2阳性克隆的筛选

从SD板上挑取单克隆，转接到新鲜的SD平板上，生长1天。挑取1/4个火柴头大小的菌体，悬浮于20ul 0.2% SDS中，100℃沸水浴5min。冷却至室温后，14,000rpm离心10s。取上清作为模板，用mE2-N125-F和mE2-N125-R引物进行PCR反应。PCR过程参照Phanta SuperFidelity DNA Polymerase的产品说明进行。对PCR产物进行琼脂糖电泳，获得724bp的条带的阳性克隆即为猪瘟病毒E2蛋白质的表达重组菌，并命名为马克斯克鲁维酵母重组菌株Fim-1-mE2。

实施例5、猪瘟病毒mE2蛋白的表达与检测。

将马克斯克鲁维酵母重组菌株Fim-1-mE2与宿主菌Fim-1ura3∆分别接种于装有50ml的YD培养基(2%酵母抽提物，4%葡萄糖)中，30℃、220rpm培养66h后离心收集菌体。菌体用无菌水洗涤3次，用10 mM Tris-HCl（pH7.5）重悬后经高压均质机（JN3000，广州聚能公司）破碎。破碎后的样品按比例加入5XSDS PAGE上样缓冲液(150 mM Tris-HCl (pH 7.0),12% SDS, 6% 巯基乙醇, 30% 甘油, 0.05% 考马斯亮蓝G-250），沸水浴5min。冷却至室温后，14,000rpm离心1min。取上清进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE的步骤参照“分子克隆实验指南”的方法进行。

SDS-PAGE的结果表明，与宿主菌Fim-1ura3∆的裂解液相比，Fim-1-mE2的裂解液在27KDa附近出现了一条明显的蛋白条带(图2A)，该条带的大小与猪瘟病毒的mE2蛋白的理论分子量27kDa一致，由此推测该蛋白条带是猪瘟病毒的mE2蛋白。

采用Western Blot免疫印迹法对Fim-1-mE2细胞裂解液进行检测。Western Blot的具体步骤参照“分子克隆实验指南”的方法进行。Western Blot中采用的一抗是猪瘟病毒阳性血清（1：500稀释），二抗为为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪多抗(1:5000稀释)。Western Blot检测结果显示在分子量27kDa大小处存在一条能够被猪瘟阳性血清特异性识别的条带(图2B)，这与SDS-PAGE的结果一致。上述结果表明Fim-1-mE2可以表达mE2蛋白。

实施例6、马克斯克鲁维酵母重组菌株Fim-1-mE2的高密度发酵

将马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1-mE2接种于YPD平板上，30℃培养2天进行活化。然后转接到合成培养基中，该合成培养基含有葡萄糖或蔗糖(2%-20%)、硫酸铵(5-15g/L)、磷酸二氢钾(3-20g/L)和硫酸镁(1-5g/L)等成份，30℃，220rpm摇床恒温培养18-24h。种子液按照10%的比例接种到装有2L培养基的5升发酵罐进行高密度发酵，发酵过程中通风并搅拌，补料采用全料流加方式，溶解氧控制在20-30%，同时控制温度在30℃，pH值控制在5.5左右，发酵时间控制在72h以内。结果表明，重组菌株在5L发酵罐中发酵72h后，细胞密度OD_600nm可以达到520左右(图3)，猪瘟病毒mE2蛋白产量约2g/L左右。

实施例7、猪瘟病毒mE2蛋白的纯化

马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1-mE2在5L发酵罐中发酵72h后，发酵液经7000rpm离心15min收集菌体。菌体用去离子水重悬后离心，重复3次。获得菌体重悬于PBS缓冲液（135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH₂PO₄, 8 mM K₂HPO₄，4%SDS）中，利用高压均质机破碎。破碎后的菌液7000rpm离心15min，上清液经冻干浓缩3.5倍采用分子筛凝胶层析Sephadex G-200纯化猪瘟病毒mE2蛋白，按体积收集的洗脱液进行SDS-PAGE和WesternBlot检测。SDS-PAGE的结果表明猪瘟病毒mE2蛋白洗脱体积在8-20ml之间，经过筛凝胶层析纯化的猪瘟病毒mE2蛋白的纯度达90%以上(图4A）。Western Blot检测结果表明在洗脱的样品中，含有mE2蛋白(图4B)。

实施例8、马克斯克鲁维酵母制备的猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗的免疫效果

将分子筛凝胶层析纯化的猪瘟病毒mE2蛋白样品，加入10% IMS1313水溶性纳米侳剂进行乳化，制备成猪瘟病毒mE2蛋白亚单位疫苗。

选用6周龄健康雌性SPF级Balb/c小鼠，随机分组，每组各5只。第一组为空白组，注射PBS不做免疫；第二组为免疫组，每只小鼠注射剂量72μg猪瘟病毒亚单位疫苗，免疫一次，21天后二次免疫。免疫后每7天进行小鼠面颊取血，采取的血液放到37度培养箱中孵育lh，然后3,000 rpm，4℃离心4min，用移液器吸取血清至1.5ml Eppendorf 管内，-20℃冰箱保存，以待检测。

小鼠血清中猪瘟病毒IgG的抗体酶联免疫吸附测定方法（ELISA）的步骤如下：

1）血清稀释：血清样品用稀释液梯度稀释后，取100μL加入到科前生物猪瘟病毒间接ELISA检测试剂盒96孔板中，37℃孵育50min；

2）清洗：用TBST (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)洗涤5次；

3）加羊抗鼠IgG酶标二抗：二抗的稀释浓度为1:4000，每孔100μL，37℃孵育50min，TBST洗涤5次；

4）显色：每孔加入100μl TMB显色液，常温避光显色10min；

5）终止：每孔加入50μl 2M硫酸终止液后，使用酶标仪检测450 nm处的吸光值。

ELISA结果表明小鼠注射免疫猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗4周后，血清中开始产生IgG抗体。免疫后的第4周到第6周之间，小鼠血清中的IgG抗体水平不断增加(如图5)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途

<130> 001

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcggttgt cctgcaagga agactacagg tatgcaatat catcaaccaa tgagataggg 60

ccgctagggg ctgaaggtct caccaccacc tggaaagaat ataaccatgg tttgcagctg 120

gatgacggga ctgtcagggc catttgcact gcagggtcct ttaaagttat agcacttaat 180

gtggtcagta ggaggtacct ggcatcatta cacaagaggg ccttacccac ttcagtaaca 240

tttgaactcc tatttgatgg gactagtcca gcaattgagg agatgggaga tgactttgga 300

tttgggctgt gcccttttga cacaaccccc gtggtcaaag ggaagtacaa taccacttta 360

ttaaacggta gtgctttcta tctagtctgc ccaataggat ggacgggtgt catagagtgc 420

acggcagtaa gccctacaac cttgagaaca gaagtggtga agaccttcag gagagagaag 480

cctttcccac acagagtgga ttgcgtgacc actgttgtag aaaaagaaga cctgttctac 540

tgcaagtggg ggggtaattg gacgtgtgta aaaggcaacc cggtgaccta catggggggg 600

caagtaaaac aatgcagatg gtgcggtttt gacttcaaga agcccgatgg gctcccacac 660

taccccatag gcaagtgcat ctaa 684

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagattgt cttgtaagga agactacaga tacgctattt cctccaccaa cgaaatcggc 60

ccattgggcg ctgaaggttt gaccaccacc tggaaggaat acaaccacgg tttgcagttg 120

gacgacggta ccgttagagc catctgtacc gccggttcct tcaaggttat cgctttgaac 180

gttgtttctc gtcgttactt agcctcttta cacaagagag ccttgccaac ctctgtcacc 240

ttcgagttgt tgttcgatgg tacctctcca gccattgaag aaatgggcga cgacttcggt 300

ttcggtttgt gtccattcga caccacccct gtcgtcaaag gtaagtacaa caccaccttg 360

ttgaacggtt ccgctttcta cttggtttgc ccaatcggtt ggaccggcgt catcgagtgc 420

accgctgtct ccccaactac tttgcgtacc gaagtcgtca agaccttcag aagagagaaa 480

ccattcccac accgtgtcga ctgtgttacc accgtcgtcg agaaggagga cttgttctac 540

tgcaagtggg gtggtaactg gacctgcgtc aagggtaacc cagtcaccta tatgggtggc 600

caggtcaaac agtgccgttg gtgcggtttc gatttcaaga agccagacgg cttgcctcat 660

tacccaatcg gtaagtgtat ctaa 684

<210> 3

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr

1 5 10 15

Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys

20 25 30

Glu Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile

35 40 45

Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu Asn Val Val Ser Arg

50 55 60

Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr

65 70 75 80

Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu Glu Met Gly

85 90 95

Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Thr Pro Val Val

100 105 110

Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu

115 120 125

Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser

130 135 140

Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Glu Lys

145 150 155 160

Pro Phe Pro His Arg Val Asp Cys Val Thr Thr Val Val Glu Lys Glu

165 170 175

Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Trp Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly

180 185 190

Asn Pro Val Thr Tyr Met Gly Gly Gln Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys

195 200 205

Gly Phe Asp Phe Lys Lys Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly

210 215 220

Lys Cys Ile

225

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttttttgtt agatccgcgg atgagattgt 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcttgcggc cttaactagt ttagatacac 30

<210> 6

<211> 10967

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcatgcatca ctaatgaaaa gcatacgacg cctgcgtctg acatgcactc attctgaaga 60

agattctggg cgcgtttcgt tctcgttttc ctctgtatat tgtactctgg tggacaattt 120

gaacataacg tctttcacct cgccattctc aataatgggt tccaattcta tccaggtagc 180

ggttaattga cggtgcttaa gccgtatgct cactctaacg ctaccgttgt ccaaacaacg 240

gacccctttg tgacgggtgt aagacccatc atgaagtaaa acatctctaa cggtatggaa 300

aagagtggta cggtcaagtt tcctggcacg agtcaatttt ccctcttcgt gtagatcaga 360

ggctatatac atgccgaggt attcgatcac tctacgatga cggtctgtta gctcaacaac 420

ttcttctaaa tgctccataa ccgtaacgta agaagcataa ctgtcaatac tgaagtcatc 480

ccagtttatt ggtgctcctg ttgaacagtc atccactata tgttcgaata gcccaggatc 540

acgaggaggt cctacaaacg gatacggtac agtcttcttt ttatagtctg caaattctag 600

aatagcattt tttatccaat agtgtcgaat cgtcctggcc gttctaccga taaaggatcc 660

aatgtgatta ttagctccac tacacgatat gttaagtttg atcgatgtct tgttaacaaa 720

cgctaaactc aagttcggca tttccaacag cgagaagaaa tcatcaattc catcggctat 780

ctcttgataa gtcattagat catatacctt ctcgggatgt cgttgagtta ctttatgact 840

agaaatcttc aggttatcat caacgtaatt gttctccaat agctctggag agggacataa 900

caatactttg attttttcca tggcctggac ttgtttccgt aggaaatact tgttcttttg 960

tagacgttcc atgatgagtt tgtatacctc tgctggagat atccattcta gatctttgat 1020

ataagtttgg tatggtaaag agttgatttt gtaggacacg taaatctgcg ctagataagt 1080

acattgtgca aatgcctctg gtacttcgta agacccatgc tgcgtaatta tagtattatt 1140

gagtggatca taagcgttgt actcgttttt gaatttaaaa ctgtctaata aggccctgta 1200

aatctctctg acttgttgta cacctttctg ctcttcggga ctgagatcgg atagcaatgg 1260

agcagcagtt tctgagcttt ctgatggggc tgacatggca gatgcctatt caatgctgcc 1320

ttttgtttgg gaggttatga aatgcatctg tttacattgt atgtaatacc cttactaggc 1380

aatgttataa gcaaaaatcc tttgatcaca tggaatatca ctttatacgt gttgaaatat 1440

gcaaaaaaac agtccccctg agctcagggg gtggtttacg cttttgaggc tcagcagcgc 1500

gaattctctc ttggggctga agtgaaattt aaaaaagtcg cttgaggctc agccggaatt 1560

ataaaacatc acctgagtct tgagagcgct ttcactcacc tgaggctcag ctgaaatttc 1620

aaaaagtcac ttgagcccag aaggagtgtt tcaccccctg aggctataac gttcgttatt 1680

ttaataccta aataaacaaa aatatatggt acaggaacgc gaggcaacgc gccgatacag 1740

ggtcaatggg tacacgagag ggtgacacta ggcgtagaaa gtcattagta taaaatacag 1800

tggtatatag tagatattta gtttgttttc cttttctttt tctccaaaac gatatcagac 1860

atttgtctga taatgaagca ttatcagaca aatgtctgat atcgtttttc aataataata 1920

tacatcatca caaaacaaac aaacatagca tcgcaagccc catcatgcca ccaccgtccg 1980

ctgtgatcgc aactcatgtt tccggcggta ttctgcaatg aattggagaa cctcgtctga 2040

gataattcca tgccattgtt cgaacaactg gaggctagga tgagctgaga aggattgagc 2100

gaccaagcgc ggacttgacg gtgggctgag tggtgggcta ccagggctgt taccctcctc 2160

ttcaagtagc tcctcgcgag ataaaggttt attagaagga tccttcaaaa catatatttc 2220

actgcccaat ggggcttcct tgtaaaaacc tgatataaag gcaaatacac ggtcatctac 2280

agtcacacta ccatgactgt agtgtgatct agccactgca ctttgaattt cacggtcccc 2340

agcccaattg cccagtgagg agacatattt tcccttctca gatctcgata aaaaggtcgc 2400

cattaaatgt cttccaaaat gagacttcgg gccgttccag atcttgaaga ctggttcatc 2460

gacatgctgg gtaagaaacc tagagaacgt tctggccaat gactctggta aaaactgatg 2520

agtttgatta gttggtctat tactggatac tgttttttca ataggcgagc aaacacgcaa 2580

atagtcgtat aatgatatca gaagatcgca atcaccattc acaggataga agttaacgta 2640

ccgttcagtt ctgcttttcg tttctgtcac agtagcacgc acaattgggc ccagaaatga 2700

attgttgtag atctcaaaag tccttggatc tagattcttc agatcgctgt atctgcagca 2760

atttccaaca gctcccagaa gtagcaatcg gtattccgct cgttttgtag tggttacgca 2820

ggactgatcg aagaagcagg caatcctgga gacaatcttc caaatatctt tttcttttga 2880

cagaatatta gtgaattgta atccaaccat agaagcatcg tatttatgtg tttcctcgta 2940

gcgatcaaac aaggaaactt cttgattttt aaatgggcta acaacaacct tgtaagaagg 3000

caatgctgat tcgatatcct tttgcagaga ctctgtcttt cttagtctaa cagtgaattt 3060

gataattttg tcatccttat caaaagacag agatttgcca attgcgctct tgtaagagcg 3120

gtaggtattg attttcatct cgcgtcggat agatagcgac tgcattgtca agatagagaa 3180

tagggacgcc agcttatttc taatttcttt cgcatttata ttaaaggtgt cagattccag 3240

aatttcatta atttcattag cacactgatg aggtgtgagg tgagcagcct ccgcaaaggt 3300

agacataggg gcattggttg gaggcctttg aggtaccact agagtgctgc aaacatagca 3360

ccgttcgaga ctttaaaatc ttcagtttta aaattatgaa aaaaaacatc gtcctgagtt 3420

gaaacggtcg tttcaacctc cgtgtacaga aagatacata gcatatggca agctgcacgc 3480

agcgtaaaca tgccggacaa ctgtcatttc gtcagatcag ttgatctact ctctgtgata 3540

ctgcttcgtt tgtccacgga ggtcggacta actctcacca cgcttccacg gcattcgaaa 3600

gaactaatat tgtatcattg tacatatgag gaacacgcag ttgaactgag caaaccagga 3660

ctcaggaaag caggaggtaa gtgctcgctt ttcgtggatc cagaggaacg tgaaaattcg 3720

ccttctcctc ctataccgcc gtatcagata tcagagatgc cccttcatga acttctcgag 3780

tcaggcaatg ctaaattggt tccaaatccc gagtttgatc taactgatcc agacgacttt 3840

cataagtgtt tctcggtcac ctattcagca ttatctttaa tggtaccata tctgcccaga 3900

gctgctctaa aggctgctcg agtgttttgt aaagatcatt caatattaac aacggatatg 3960

cttgatttga attatcttga agagctaatt gagttctcaa aggaaactgt gaacaaaatc 4020

ccagctagaa tccctataga ggacatgctt ctcgagcggg gatatgtgct accatgggtt 4080

catggtggta cagtgaaggg aggaaagcta ctgaccccca acgattgatt ctttaccgaa 4140

tcattgcata attcattgca taattcattg cagaataccg ccggaaacat gagttgcgat 4200

cacagcggac ggtggtggca tgatggggct tgcgatgcta tgtttgtttg ttttgtgatg 4260

atgtatatta ttattgaaaa acgatatcag acatttgtct gataatgctt cattatcaga 4320

caaatgtctg atatcgtttt ggagaaaaag aaaaggaaaa caaactaaat atctactata 4380

taccactgta ttttatacta atgactttct acgcctagtg tcaccctctc gtgtacccat 4440

tgaccctgta tcggcgcgtt gcctcgcgtt cctgtaccat atatttttgt ttatttaggt 4500

attaaaattt actttcctca tacaaatatt aaattcacca aacttctcaa aaactaatta 4560

ttcgtagtta caaactctat tttacaatca cgtttattca accattctac atccaataac 4620

caaaatgccc atgtacctct cagcgaagtc caacggtact gtccaatatt ctcattaaat 4680

agtctttcat ctatatatca gaaggtaatt ataattagag atttcgaatc attaccgtgc 4740

cgattcgcac gctgcaacgg catgccgatc cgaaaaggta aacagacaca aaaacgacaa 4800

gagaagcaaa cacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaaaa aaaaaaacac aaacacaaac 4860

acaaacacaa aaacgctaaa ttatgcacac aagggccggc ggggctgccg gaaaaaaaaa 4920

gggaaaaata cacagacgag cgcgcacaga tggggttacc actgcaagtt acaagttgca 4980

agttgcacgc tggaatcaga attggaatca gaattggaat tggaattaga attagaatta 5040

aacttggggt agccacggga acgggataac tcaggaatcg ctcgcaggcg tctccgtcta 5100

ggcaatccca aggtaagcct aggcactccc acaggggaaa gaacggttga aggcaaagta 5160

gtgctaacaa ttggtaacga atggtaacaa gtgtgtccgt ctccacctga catttgctag 5220

agctggggat tccacattct tgtgctctga attctcaaac cgaaatgggg cgttgttacc 5280

ccaggtatcc ggttgtagtt ggcactgggg atggaaaaaa atgatgttga tgttgagtta 5340

gttgggttga gtcaattagt gcgtgaaagt atcaccactt ttgtcatccg gcgtttctgt 5400

gcgaatcaca cacacacaca cagtttattg gagcacttgt ttctggcgta ttcgtaattg 5460

ttctgcggtg cggttctgtg tgcatttttc ctggggtgtc tgccgcacct actcatcacc 5520

cacgccgtgg gtttgagcca tggcggaggt acgactgact ggctgcctgc ctgcctgact 5580

gactgcctga ctgcaggaaa agagggtttc gaaggaaaaa cttttcctgt gttaatccgg 5640

ccgtgcgccg ctgctccaaa atccaccttc atgagaagga gtttgaaaaa acaaaaaaat 5700

tcacatataa aaagcgtatc tcgagatctc aaagtctccc ttgaatcgtg tttgccagtt 5760

gtaactcatc ctttattctt ctattctatc tctctctttc cttcccctaa tcagcaatta 5820

aatccggggt aaggaagaat tactactgtg tgtaacggtt atatttcgtt ttttattttt 5880

tttttccatt gccatagaga aagaaaaaaa aaaaaaagag agtttgtgaa gatcttccat 5940

tcgaatccca taagtgacac atttaatttt ttttttgtta gatccgcggg ggaatctcta 6000

gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 6060

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 6120

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 6180

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 6240

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 6300

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 6360

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 6420

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 6480

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 6540

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 6600

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 6660

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 6720

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 6780

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 6840

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 6900

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 6960

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 7020

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 7080

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 7140

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 7200

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 7260

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 7320

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 7380

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 7440

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 7500

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 7560

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 7620

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 7680

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 7740

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 7800

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 7860

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 7920

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 7980

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 8040

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 8100

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 8160

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 8220

ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac 8280

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 8340

gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg 8400

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 8460

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc 8520

aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg 8580

ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt 8640

aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg acgattacta gttaaggccg 8700

caagctttga tctgatctgc ttactttact aacgacaaaa aaaaatcaaa aaaaaaaaaa 8760

caatcagtcc ttctcttctt acgatatgat atgattaaat gatgctatga aatcatcttc 8820

ttcttaactt tcttaaatct tacgcgtcac ttactctata tacccgttta gctttgcctg 8880

gtcacagcga cattttatat aagtgtacgt attttctttt tttttttaaa aatttctatt 8940

ctaaccttag aaaagtgccc tttaaaccag ctgtcctggc actatatctt tatcatgtgc 9000

cggtcgcttt ccctttccgt ttcccttttc ctttcaattg gtggcctgga attccgaact 9060

cattttcgca tctgaaacta attctcgaaa cctttaacat caaacaattg aaaagatcat 9120

catcaccaga aataagaaaa agatcaacac aacagctaat aacagtacga aagaaagatc 9180

gctcgagtga aaaggcagcc aagaaaggtc attcgatttg ggtctagact gattatagac 9240

ataccaattg cactcagtaa gaaaatgagt ttcaaatttg acgatgacgg tgtggtaaaa 9300

gaatttcacg gcaacaccat catatgccat attcctcaac aaaccgaatt cttcaacaaa 9360

ttgttggact tctaccgttt tgcgaaacga ctttccttct acgacaagat caccctactt 9420

cctccttcaa gctaccacgt tacgatcatg aattgctgcc acgaacacga tcgttctgag 9480

ggccactggc ccaaaggaat cgatccggac acaagcatgc tgcggtgtac atcacatctg 9540

accaacattc taggatcggt cgaattctga ttggaaagac cattctgctt tacttttaga 9600

gcatcttggt cttctgagct cattatacct caatcaaaac tgaaattagg tgcctgtcac 9660

ggctcttttt ttactgtacc tttgacttcc tttcttattt ccaaggatgc tcatcacaat 9720

acgcttctag atctattatg cattataatt aatagttgta gctacaaaag gtaaaagaaa 9780

gtccggggca ggcaacaata gaaatcggca aaaaaaacta cagaaatact aagagcttct 9840

tccccattca gtcatcgcat ttcgaaacaa gaggggaatg gctctggcta gggaactaac 9900

caccatcgac tgactctatg cactaaccac gtgactacat atatgtgatc gtttttaaca 9960

tttttcaaag gctgtgtgtc tggctgtttc cattaatttt cactgattaa gcagtcatat 10020

tgaatctgag ctcatcacca acaagaaatt ctaccgtaaa agtgtaaaag ttcgtttaaa 10080

tcatttgtaa actggaacag caagaggaag tatcatcagc tagccccata aactaatcaa 10140

aggaggatgt cgactaagag ttactcggaa agagcagctg ctcatagaag tccagttgct 10200

gccaagcttt taaacttgat ggaagagaag aagtcaaact tatgtgcttc tcttgatgtt 10260

cgtaaaacag cagagttgtt aagattagtt gaggttttgg gtccatatat ctgtctattg 10320

aagacacatg tagatatctt ggaggatttc agctttgaga ataccattgt gccgttgaag 10380

caattagcag agaaacacaa gtttttgata tttgaagaca ggaagtttgc cgacattggg 10440

aacactgtta aattacaata cacgtctggt gtataccgta tcgccgaatg gtctgatatc 10500

accaatgcac acggtgtgac tggtgcgggc attgttgctg gtttgaagca aggtgccgag 10560

gaagttacaa aagaacctag agggttgtta atgcttgccg agttatcgtc caaggggtct 10620

ctagcgcacg gtgaatacac tcgtgggacc gtggaaattg ccaagagtga taaggacttt 10680

gttattggat ttattgctca aaacgatatg ggtggaagag aagagggcta cgattggttg 10740

atcatgacgc caggtgttgg tcttgatgac aaaggtgatg ctttgggaca acaatacaga 10800

actgtggatg aagttgttgc cggtggatca gacatcatta ttgttggtag aggtcttttc 10860

gcaaagggaa gagatcctgt agtggaaggt gagagataca gaaaggcggg atgggacgct 10920

tacttgaaga gagtaggcag atccgcttaa gaggggtacc gagctcg 10967

Claims (9)

1.一种用于制备猪瘟亚单位疫苗的马克斯克鲁维酵母重组菌株，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母重组菌是由插入猪瘟病毒mE2基因的重组表达载体转化到马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建获得；所述重组表达载体是由编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列插入表达载体所构建获得；其中：

所述猪瘟病毒mE2基因是猪瘟病毒E2基因第1-678位核苷酸序列，经密码子优化后获得，为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其包括含马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、猪瘟病毒mE2基因、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列；

所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心、保藏编号为CGMCC No.10621的马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。

2.一种猪瘟病毒mE2蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

1）将编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；

2）用上述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

3）使上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株进行培养，重组表达猪瘟病毒mE2蛋白；

4）收集培养菌体，经离心、破碎、纯化，获得猪瘟病毒mE2蛋白；

所述编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸序列，按照马克斯克鲁维酵母密码子偏好性的密码子优化获得，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其包括含马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、猪瘟病毒mE2基因、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列；

所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌CGMCC No.10621敲除部分或全部特定营养基因所得。

3.由权利要求2所述的制备方法得到的猪瘟病毒mE2蛋白。

4. 一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗组合物，其特征在于，包括：权利要求3 所述的猪瘟病毒mE2蛋白，以及药学上可接受的用于注射制剂的辅料。

5.根据权利要求4所述的猪瘟病毒重组亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述辅料为水包油、油包水、水包油包水佐剂中的任意一种或几种。

6.根据权利要求4所述的猪瘟病毒重组亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述辅料选自ISA201水包油包水矿物油佐剂、IMS1313水溶性纳米佐剂、GEL01纳米佐剂中的任意一种或几种。

7.一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗组合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）将编码猪瘟病毒mE2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；

2）用上述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

3）使上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株进行培养，表达猪瘟病毒mE2蛋白；

4）收集发酵菌体，经离心、破碎、纯化，获得猪瘟病毒mE2蛋白；

5）猪瘟病毒mE2蛋白与辅料混合，乳化，获得含猪瘟病毒mE2重组亚单位疫苗组合物；

其中，所述猪瘟病毒mE2基因核苷酸序列如权利要求2中所述，所述表达载体的核苷酸序列如权利要求2中所述，所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为权利要求2中所述。

8.如权利要求3所述的猪瘟病毒mE2蛋白在制备预防和/或治疗由猪瘟病毒引发的疾病的药物中的用途。

9.如权利要求4-6之一所述的猪瘟病毒重组亚单位疫苗组合物在制备预防和/或治疗由猪瘟病毒引发的疾病的药物中的用途。

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