CN108096573A - 一种猪细小病毒口服疫苗组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪细小病毒口服疫苗组合物，其包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的猪细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；b)、药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料。本发明还公开了上述猪细小病毒口服疫苗组合物的制备方法和应用。本发明提供的猪细小病毒口服疫苗组合物具有良好的免疫原性，口服免疫小鼠后能够产生高滴度的保护性抗体，并具有安全性高、生产成本低并可放大规模生产、操作简单等优点，可应用于预防和减少PPV感染所引起相关性临床症状。

Description

一种猪细小病毒口服疫苗组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术和兽医领域，具体涉及一种猪细小病毒口服疫苗组合物及其制备方法与应用。

背景技术

猪细小病毒(porcineparvovirus，PPV)是一种极为常见的病原体，能引起猪的繁殖障碍，怀孕母猪的死胎和“木乃伊胎”、断奶仔猪多系统衰弱综合征等，而母猪通常无明显临床症状。目前，我国PPV病毒的流行极为广泛，约95％以上的猪场检测为PPV 病毒阳性，因此给养猪业造成巨大的经济损失。PPV属细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒属(Parvovirus)。PPV外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径20～23nm，二十面体等轴对称，病毒基因为单股DNA，分子量为5.3×106Da。猪细小病毒按致病性与组织嗜性，崔尚金等将PPV分为5个类型，分别是NADL-2株为代表的非致病性毒株、对免疫不完全胎儿致病致死的毒株NADL-8和LAF-76、以Kresse株为代表的皮炎型强毒株、肠炎型毒株和呼吸道型毒株等，虽然已经分离出了多株PPV，但目前普遍认为PPV只有一个血清型。

猪细小病毒PPV基因组包括2个开放阅读框(open reading fragment，ORF)，ORF 1编码非结构蛋白NS-1、NS-2和NS-3，ORF2则编码结构蛋白VP1、VP2和VP3。 VP1的相对分子质量为83kDa，VP2的相对分子质量为64kDa，VP3的相对分子质量为60kDa，其中VP1和VP2有许多氨基酸序列是重叠的。VP1的N端有一个脯氨酸丰富区，对病毒转移起重要作用，是PPV复制和包装过程中不可缺少的一种结构蛋白，参与PPV与细胞特异性结合，有利于病毒侵染细胞。VP3是VP2的水解产物，在VP2 蛋白N端有9个连续甘氨酸，这种甘氨酸富集区折叠形成的α螺旋结构可能就是VP3 的切割位点。VP2蛋白是PPV衣壳蛋白的主要成分，在VP2蛋白上有PPV最主要的抗原决定簇，因此VP2蛋白是PPV主要的免疫保护性抗原，而且VP2蛋白还能在体外自我装配成类病毒颗粒(VLPs)。Martinez等(Vaccine，1992、10，p684-690) 将PPV-VP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，发现在昆虫细胞中表达的VP2蛋白能自我装配成病毒样颗粒(virus like particles)。

猪细小病毒PPV引起的繁殖障碍疾病在临床上缺乏有效的治疗方法，预防性疫苗免疫是当前最为有效的防治措施。目前国内外市场上的PPV疫苗主要有灭活苗和弱毒疫苗这两大类，而传统的常规疫苗虽然对预防PPV感染有一定的作用，但仍然存在生产成本高、抗原滴度低以及毒力返强等缺陷。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种免疫效果好、生产成本低、工艺简单以及更安全的新型猪细小病毒疫苗，并提供了其制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种猪细小病毒口服疫苗组合物，包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：

a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的猪细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；

b)、药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料；

其中，马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码猪细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；重组表达载体编码猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，上述重组表达载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码所述猪细小病毒VP2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有无抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列。

更优选地，上述重组表达载体还包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、营养缺陷筛选标记基因序列和克鲁维酵母起始复制序列。

优选地，马克斯克鲁维酵母表达载体包含如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

优选地，马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。

优选地，上述特定营养基因为URA3基因。

在较优实施例中，上述马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10621Kluyveromyces marxianus(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年 3月13日)。

优选地，编码上述猪细小病毒VP2蛋白的基因序列，包括

1)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)、编码取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有猪细小病毒VP2蛋白活性的氨基酸、且由SEQ ID No.1所衍生的核苷酸序列。

优选地，上述药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料至少包括保护剂，保护剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、海藻糖中的一种或多种。

本发明在第二方面提供了上述猪细小病毒口服疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将编码猪细小病毒VP2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；

步骤2、用上述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

步骤3、使上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株发酵表达上述猪细小病毒VP2 蛋白，上述猪细小病毒VP2蛋白在酵母细胞内自组装成猪细小病毒类病毒颗粒；

步骤4、分离纯化获得猪细小病毒类病毒颗粒；

步骤5、以上述猪细小病毒类病毒颗粒为活性成分或活性成分之一，与药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料按比例混合均匀，制备得到猪细小病毒口服疫苗组合物。

优选地，上述步骤1还包括编码猪细小病毒VP2蛋白的核苷酸的密码子优化步骤，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在较优实施例中，制备得到的猪细小病毒口服疫苗组合物口服免疫小鼠的平均滴度到达3000以上，峰值达到6400以上。

本发明在第三方面提供了上述猪细小病毒口服疫苗组合物在制备预防和/或治疗由猪细小病毒引发的疾病的药物和/或疫苗中的应用。

优选地，由猪细小病毒引发的疾病包括猪繁殖障碍病、初产母猪易发生死胎、畸形胎和木乃伊胎、仔猪皮炎、腹泻、非化脓性心肌炎和呼吸系统疾病中的任意一种或几种。

优选地，上述猪细小病毒口服疫苗组合物的应用包括用作口服药物和/或疫苗、作为饲料添加剂、饮用水添加剂中的任意一种或几种。

本发明提供的马克斯克鲁维酵母VP2蛋白元件均来源于食品安全级的克鲁维酵母，具有无抗生素抗性基因和大肠杆菌序列特征。本发明提供的口服猪细小病毒样颗粒口服疫苗，具有良好的免疫原性，口服免疫小鼠后能够产生高滴度的保护性抗体，并具有安全性高、生产成本低并可放大规模生产、操作简单等优点，可应用于预防和减少PPV感染所引起相关性临床症状。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1示出了本发明较优实施例中VP2基因的PCR扩增胶回收DNA电泳图；

图2为本发明较优实施例中VP2蛋白马克斯克鲁维酵母重组表达载体 pUKD-N125/VP2的示意图；

图3示出了本发明较优实施例中SDS-PAGE电泳(A)和免疫印迹Western blot (B)检测猪细小病毒VP2蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达，其中泳道1为马克斯克鲁维酵母表达宿主Fim-1ura3Δ细胞裂解液，泳道2为VP2蛋白马克斯克鲁维酵母工程菌Fim-1BH-pUKD-N125/VP2细胞裂解液；

图4示出了本发明较优实施例中马克斯克鲁维酵母表达猪细小病毒衣壳VP2蛋白形成的类病毒颗粒的电子显微镜图；

图5示出了本发明较优实施例中马克斯克鲁维酵母基因工程菌的高密度发酵制备口服型猪细小病毒VLPs的发酵生长曲线图；

图6示出了本发明较优实施例中制备的猪细小病毒口服疫苗中的类病毒颗粒VLPs的电子显微镜图；

图7示出了本发明较优实施例中口服型猪细小病毒VLPs口服免疫小鼠的效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1猪细小病毒VP2蛋白马克斯克鲁维酵母重组表达载体的构建

编码猪细小病毒衣壳蛋白VP2的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，根据马克斯克鲁维酵母的密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，对VP2的基因序列进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。将优化后的VP2基因序列，插入到马克斯克鲁维酵母表达载体pUKD-N125中，构建重组表达载体 PUKD-N125/VP2，具体过程如下：

以特异性引物

VP2-N125-F(SEQ IDNo.3)

5'-TTTTTTTGTTAGATCCGCGGATGAGCGAAAACGTGGAGC-3'

VP2-N125-R(SEQ IDNo.4)

5'-AGCTTGCGGCCTTAACTAGTCTAGTACAACTTTCTTGGG-3'

PCR扩增VP2基因，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收1740bp左右的片段，如图1所示；将表达载体pUKD-N125用限制性酶Spe I和Sac II酶切，以去除氨苄青霉素抗性基因以及大肠杆菌起始复制序列，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收8.2kb左右的载体片段；采用Gibson Assembly的方法，用NEB公司的 Gibson Assembly无痕连接系统(产品编号E2611S/L)，将VP2基因片段与载体片段连接，构建重组表达载体pUKD-N125/VP2，如图2所示，重组表达载体内还包括菊粉酶启动子、菊粉酶终止子、以及缺陷筛选标记基因URA3(KmURA3)及其启动子。

实施例2马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2的构建

本发明采用的酵母表达宿主菌株为马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3Δ，该菌株的制备方法可采用中国专利公布文件CN105112313A实施例1公开的营养缺陷型菌 Fim-1ura3Δ的方法构建。猪细小病毒VP2蛋白马克斯克鲁维酵母基因工程菌 Fim-1-pUKD-N125/VP2是通过将重组表达载体pUKD-N125/VP2转化进Fim-1ura3 Δ菌株构建获得的，实施过程如下：马克斯克鲁维酵母Fim-1ura3Δ接种于含3mL YEPD培养基的玻璃试管中，30℃摇床过夜培养至OD600为12-15。收集菌体， LiAc-TE溶液(100mM LiAc，10mM Tris-HCl pH 7.5,1mMEDTA)洗涤。在菌体中依次加入carrier DNA，重组表达载体pUKD-N125/VP2，PEG溶液(40％PEG 4000、100mM LiAc、10mM Tris-HCl pH 7.5、1mM EDTA)和终浓度为10mM DTT，充分混匀后，30℃水浴15min，47℃水浴15min，8000rpm瞬离，弃上清，加100μL无菌水悬浮菌体，涂SD平板(0.67％无氨基酵母氮源YNB、2％葡萄糖、 2％琼脂)，30℃培养2-4天直至克隆形成。

利用PCR的方法进行阳性转化子的筛选，从选择培养基平板挑取单克隆，于 3mLYEPD培养基的试管中30℃摇床过夜培养，采用常规酵母基因组提取方法提取转化子基因组，用上述VP2-N125-F和VP2-N125-R引物进行PCR验证，若PCR 扩增出1700bp左右的条带即为转入重组表达载体pUKD-N125/VP2的克隆，获得重组表达猪细小病毒VP2蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株 Fim-1-pUKD-N125/VP2。

实施例3猪细小病毒VP2蛋白在马克斯克鲁维酵母中的表达

重组工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2与对照菌Fim-1ura3Δ分别接种于装有50 ml的YD培养基(1％酵母抽提物，2％葡萄糖)中，30℃、220rpm培养66h后离心收集细胞，细胞用10mM Tris-HCl pH 7.5重悬后经高压均质破碎。取100μl细胞裂解液加入蛋白质电泳上样缓冲液混合，沸水5min后进行蛋白电泳SDS-PAGE (polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)和PPV-VP2抗体免疫印迹Western Blot 检测，检测猪细小病毒PPV-VP2蛋白在马克斯克鲁维酵母的表达水平。Western Blot采用的PPV-VP2抗体是大肠杆菌重组表达的PPV-VP2蛋白免疫小鼠后分离的多抗血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多抗。

细胞裂解液SDS-PAGE蛋白质电泳检测结果表明，工程菌Fim-1 -pUKD-N125/VP2的全细胞裂解液在55-70kD之间多了一条蛋白条带，如图3所示，其大小与猪细小病毒的VP2蛋白的理论分子量64kDa基本一致。

将细胞裂解液样品经SDS-PAGE蛋白质电泳后经Bio-Rad公司的Trans-Blot 转印槽将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，然后将膜在含5％的脱脂奶粉的TBST缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、137mM NaCI、0.1％Tween20)中室温孵育2h，接着用 1:200稀释小鼠血清PPV-VP2多抗4℃孵育过夜。一抗孵育结束后用TBST洗3次，然后用1:5000稀释的羊抗鼠二抗室温孵育1h，TBST洗3遍后，加入显色液。Western Blot检测结果表明工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2多出来的蛋白条带为猪细小病毒 VP2蛋白。

通过电子显微镜观察发现马克斯克鲁维酵母表达的猪细小病毒VP2蛋白能够在细胞内自我组装类病毒颗粒(virus-like particles，VLPs)，如图4所示，形成的 VLPs大小约为20-26nm。

实施例4重组马克斯克鲁维酵母工程菌的高密度发酵

马克斯克鲁维酵母基因工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2接种于YEPD固体培养基上30℃培养2天进行活化。然后转接到含有葡萄糖(或蔗糖)、硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁等成份的合成培养基中，30℃，220rpm培养18-24h。种子液按照10％的比例接种到装有2L培养基的5升发酵罐进行高密度发酵，发酵过程中通风并搅拌，补料采用全料流加方式，溶解氧控制在20-30％，同时控制温度在30℃，pH 值控制在5.5左右，发酵时间控制在54h以内。结果表明，重组菌株在5L发酵罐中发酵48h后，细胞密度OD₆₀₀达550，细胞干重达120g/L以上，如图5所示，而猪细小病毒VP2蛋白产量高达2.5g/L，比现有文献中报道的产量高了2.5倍以上。

实施例5口服型猪细小病毒类病毒颗粒(VLPs)疫苗的制备

马克斯克鲁维酵母工程菌Fim-1-pUKD-N125/VP2发酵液经5，000rpm离心5 min收集菌体，溶液用去离子水重悬后离心，重复3次。用去离子水重悬，菌体密度OD₆₀₀调节至600左右。菌悬液用广州聚能公司的JN3000高压均质机1，800bar 破碎两次，从而制备猪细小病毒类病毒颗粒(VLPs)悬液。按1：2(V：M)加入玉米淀粉保护剂混料，搅拌混匀后用螺杆式造粒机进行造粒。造粒后的口服型猪细小病毒类病毒颗粒(VLPs)疫苗在沸腾干燥机上37℃干燥1-2h，含水量控制在5％左后，干燥后的口服疫苗经分装和真空包装制成成品。

进一步用用电子显微镜观察猪细小病毒口服疫苗的类病毒颗粒(VLPs)，发现经制粒、沸腾干燥后的猪细小病毒VP2蛋白依然以类病毒颗粒形式存在，如图6 所示。

实施例6口服型猪细小病毒类病毒颗粒(VLP)疫苗的免疫效果

以小鼠作为靶动物进行口服型猪细小病毒类病毒颗粒(VLP)疫苗的免疫效果分析，选用6周龄健康雌性SPF级Balb/c小鼠，随机分组，每组各6只。第一组为空白组，喂食PBS(PBS)不做免疫；第二组为免疫组：喂食本发明提供的猪细小病毒类病毒颗口服疫苗，每只小鼠喂食剂量100mg蛋白/次，首免1周后，按相同途径和剂量重复喂食4次，喂食时间分别：0天、7天、14天、21天、28天。

喂食前小鼠面颊取血，采取的血液放到37度培养箱中lh，然后4℃3000rpm 离心4min，用10ml的移液器吸取血清到新的EP内，放入-20℃冰箱保存。

小鼠血清中抗PPV-VP2IgG抗体的含量的检测采用原核表达VP2蛋白包被96 孔板进行ELISA检测。

猪细小病毒口服疫苗免疫小鼠后血清中的抗PPV-VP2IgG抗体采用ELISA方法检测。面颊取血的血清样品用稀释液PBS稀释后，取100μL加入到抗原包被板中，37℃孵育50min，TBST洗涤5次，加1:4000稀释的二抗，37℃孵育50min后 TBST洗涤5次；每孔加入100μl TMB显色液，常温避光显色10min，加入50μl 2M 硫酸终止液后，使用酶标仪检测450nm处的吸光值。分析结果表明小鼠口服免疫猪细小病毒VLPs疫苗3周血清中产生IgG抗体，6周后鼠血清中的IgG抗体滴度达到峰值，平均滴度达到3000以上，峰值能达到6400以上，如图7所示。

其中用于ELISA检测的抗原包被板是以纯化的大肠杆菌重组表达的PPV-VP2 蛋白为抗原进行包被的，包被过程具体如下：

1)抗原包被：大肠杆菌重组表达PPV-VP2蛋白经纯化后，用pH 9.8碳酸盐包被液分别稀释至0.75μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL,取100μl加入到 Corning公司的抗原包被96孔板中，4℃过夜孵育。

2)清洗：TBST洗涤5次。

3)封闭：用含10％脱脂奶粉的TBST溶液37℃封闭2h。

4)清洗：TBST洗涤5次。

5)检测血清：每孔中加入100μl经PBS梯度稀释的血清样品，4℃过夜。

6)清洗：TBST洗涤5次；

7)加羊抗鼠IgG酶标二抗：二抗的稀释浓度分别为1:4000和1:8000，每孔 100μL，37℃孵育50min，TBST洗涤5次；

8)显色：每孔加入100μl TMB显色液，常温避光显色10min。

9)终止：每孔加入50μl 2M硫酸终止液后，使用酶标仪检测450nm处的吸光值。

通过检测结果，综合阴、阳性值、P/N值等方面的因素，初步确定抗原最佳包被浓度为抗原浓度为3μg/mL，二抗浓度为1:4000。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种猪细小病毒口服疫苗组合物及其制备方法与应用

<130> 2010

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 579

<212> PROTEIN

<213> 人工序列()

<400> 1

<210> 2

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgagcgaaa acgtggagca acacaatcca attaacgcag gtactgaatt gtctgctacc 60

ggcaacgagt ctggtggagg cggtggcggt ggaggcggta gaggcgctgg tggcgttggt 120

gtgtctactg gcagcttcaa taaccaaacc gaattccaat acttgggtga gggcttggtt 180

agaatcactg cacacgcttc aaggctcata catctaaaca tgccagaaca cgagacctac 240

aagagaatcc atgtcctaaa ctcagaatcc ggcgtggccg gtcaaatggt tcaggacgat 300

gcacacaccc aaatggtcac tccttggtcc ttgatcgatg ctaacgcatg gggcgtgtgg 360

ttcaacccag cggactggca gttgatctcc aacaatatga ctgaaatcaa cttggttagc 420

ttcgagcaag aaatcttcaa cgtcgttctt aagaccatta ctgaatcagc aacctcccca 480

cctaccaaga tctacaataa cgacctaact gctagcttga tggtcgcact agacaccaat 540

aacactcttc catacacccc agcagctcct agaagcgaaa ctcttggttt ctacccttgg 600

ttacctacca agccaactca atacagatat tacctatcct gcaccagaaa cttgaatcca 660

cctacctaca ctggccaatc ccagcaaatc actgactcaa tccaaactgg cttgcacagt 720

gacattatgt tctacaccat cgaaaacgct gttccaattc accttttgag aactggcgat 780

gaattctcca caggcatcta ccacttcgac accaagccac taaagttgac tcactcctgg 840

caaaccaaca gatctctagg cttgcctcca aagctactaa ctgaacctac cactgagggc 900

gaccaacacc caggcaccct accagcagct aacactagaa agggttacca ccaaaccatt 960

aataacagct acacagaagc tactgcaatt aggccagctc aggttggcta caacacccca 1020

tatatgaact tcgaatactc caatggtggc ccattcttga ctcctatcgt tccaacagca 1080

gacacccaat acaacgatga cgaaccaaac ggtgctatca gattcactat gggttaccaa 1140

cacggccaat tgaccacttc ttcccaagag ctagaaagat acaccttcaa cccacaaagc 1200

aagtgcggca gagcaccaaa gcaacagttc aaccaacagg ctccactaaa cttggaaaat 1260

accaacaatg gcacactttt gccttccgat ccaatcggcg gtaagccaaa catgcacttc 1320

atgaacaccc tcaacacata cggaccatta accgctttga acaatactgc acctgtcttc 1380

ccaaacggtc aaatctggga taaggaactt gacaccgatc taaagccaag attgcacgtt 1440

accgctccat tcgtctgcaa gaacaatcca ccaggccaac tattcgttaa gatcgctcca 1500

aacttgacag acgatttcaa tgctgactct cctcaacagc caagaatcat tacttactcc 1560

aacttctggt ggaagggcac cttgactttc acagctaaga tgagatccag taatatgtgg 1620

aacccaattc aacagcacac tacaaccgct gagaacattg gtaactacat cccaaccaac 1680

attggtggca tcaagatgtt cccagaatac tcccaactta tcccaagaaa gttgtactag 1740

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tttttttgtt agatccgcgg atgagcgaaa acgtggagc 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agcttgcggc cttaactagt ctagtacaac tttcttggg 39

<210> 5

<211> 10967

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gcatgcatca ctaatgaaaa gcatacgacg cctgcgtctg acatgcactc attctgaaga 60

agattctggg cgcgtttcgt tctcgttttc ctctgtatat tgtactctgg tggacaattt 120

gaacataacg tctttcacct cgccattctc aataatgggt tccaattcta tccaggtagc 180

ggttaattga cggtgcttaa gccgtatgct cactctaacg ctaccgttgt ccaaacaacg 240

gacccctttg tgacgggtgt aagacccatc atgaagtaaa acatctctaa cggtatggaa 300

aagagtggta cggtcaagtt tcctggcacg agtcaatttt ccctcttcgt gtagatcaga 360

ggctatatac atgccgaggt attcgatcac tctacgatga cggtctgtta gctcaacaac 420

ttcttctaaa tgctccataa ccgtaacgta agaagcataa ctgtcaatac tgaagtcatc 480

ccagtttatt ggtgctcctg ttgaacagtc atccactata tgttcgaata gcccaggatc 540

acgaggaggt cctacaaacg gatacggtac agtcttcttt ttatagtctg caaattctag 600

aatagcattt tttatccaat agtgtcgaat cgtcctggcc gttctaccga taaaggatcc 660

aatgtgatta ttagctccac tacacgatat gttaagtttg atcgatgtct tgttaacaaa 720

cgctaaactc aagttcggca tttccaacag cgagaagaaa tcatcaattc catcggctat 780

ctcttgataa gtcattagat catatacctt ctcgggatgt cgttgagtta ctttatgact 840

agaaatcttc aggttatcat caacgtaatt gttctccaat agctctggag agggacataa 900

caatactttg attttttcca tggcctggac ttgtttccgt aggaaatact tgttcttttg 960

tagacgttcc atgatgagtt tgtatacctc tgctggagat atccattcta gatctttgat 1020

ataagtttgg tatggtaaag agttgatttt gtaggacacg taaatctgcg ctagataagt 1080

acattgtgca aatgcctctg gtacttcgta agacccatgc tgcgtaatta tagtattatt 1140

gagtggatca taagcgttgt actcgttttt gaatttaaaa ctgtctaata aggccctgta 1200

aatctctctg acttgttgta cacctttctg ctcttcggga ctgagatcgg atagcaatgg 1260

agcagcagtt tctgagcttt ctgatggggc tgacatggca gatgcctatt caatgctgcc 1320

ttttgtttgg gaggttatga aatgcatctg tttacattgt atgtaatacc cttactaggc 1380

aatgttataa gcaaaaatcc tttgatcaca tggaatatca ctttatacgt gttgaaatat 1440

gcaaaaaaac agtccccctg agctcagggg gtggtttacg cttttgaggc tcagcagcgc 1500

gaattctctc ttggggctga agtgaaattt aaaaaagtcg cttgaggctc agccggaatt 1560

ataaaacatc acctgagtct tgagagcgct ttcactcacc tgaggctcag ctgaaatttc 1620

aaaaagtcac ttgagcccag aaggagtgtt tcaccccctg aggctataac gttcgttatt 1680

ttaataccta aataaacaaa aatatatggt acaggaacgc gaggcaacgc gccgatacag 1740

ggtcaatggg tacacgagag ggtgacacta ggcgtagaaa gtcattagta taaaatacag 1800

tggtatatag tagatattta gtttgttttc cttttctttt tctccaaaac gatatcagac 1860

atttgtctga taatgaagca ttatcagaca aatgtctgat atcgtttttc aataataata 1920

tacatcatca caaaacaaac aaacatagca tcgcaagccc catcatgcca ccaccgtccg 1980

ctgtgatcgc aactcatgtt tccggcggta ttctgcaatg aattggagaa cctcgtctga 2040

gataattcca tgccattgtt cgaacaactg gaggctagga tgagctgaga aggattgagc 2100

gaccaagcgc ggacttgacg gtgggctgag tggtgggcta ccagggctgt taccctcctc 2160

ttcaagtagc tcctcgcgag ataaaggttt attagaagga tccttcaaaa catatatttc 2220

actgcccaat ggggcttcct tgtaaaaacc tgatataaag gcaaatacac ggtcatctac 2280

agtcacacta ccatgactgt agtgtgatct agccactgca ctttgaattt cacggtcccc 2340

agcccaattg cccagtgagg agacatattt tcccttctca gatctcgata aaaaggtcgc 2400

cattaaatgt cttccaaaat gagacttcgg gccgttccag atcttgaaga ctggttcatc 2460

gacatgctgg gtaagaaacc tagagaacgt tctggccaat gactctggta aaaactgatg 2520

agtttgatta gttggtctat tactggatac tgttttttca ataggcgagc aaacacgcaa 2580

atagtcgtat aatgatatca gaagatcgca atcaccattc acaggataga agttaacgta 2640

ccgttcagtt ctgcttttcg tttctgtcac agtagcacgc acaattgggc ccagaaatga 2700

attgttgtag atctcaaaag tccttggatc tagattcttc agatcgctgt atctgcagca 2760

atttccaaca gctcccagaa gtagcaatcg gtattccgct cgttttgtag tggttacgca 2820

ggactgatcg aagaagcagg caatcctgga gacaatcttc caaatatctt tttcttttga 2880

cagaatatta gtgaattgta atccaaccat agaagcatcg tatttatgtg tttcctcgta 2940

gcgatcaaac aaggaaactt cttgattttt aaatgggcta acaacaacct tgtaagaagg 3000

caatgctgat tcgatatcct tttgcagaga ctctgtcttt cttagtctaa cagtgaattt 3060

gataattttg tcatccttat caaaagacag agatttgcca attgcgctct tgtaagagcg 3120

gtaggtattg attttcatct cgcgtcggat agatagcgac tgcattgtca agatagagaa 3180

tagggacgcc agcttatttc taatttcttt cgcatttata ttaaaggtgt cagattccag 3240

aatttcatta atttcattag cacactgatg aggtgtgagg tgagcagcct ccgcaaaggt 3300

agacataggg gcattggttg gaggcctttg aggtaccact agagtgctgc aaacatagca 3360

ccgttcgaga ctttaaaatc ttcagtttta aaattatgaa aaaaaacatc gtcctgagtt 3420

gaaacggtcg tttcaacctc cgtgtacaga aagatacata gcatatggca agctgcacgc 3480

agcgtaaaca tgccggacaa ctgtcatttc gtcagatcag ttgatctact ctctgtgata 3540

ctgcttcgtt tgtccacgga ggtcggacta actctcacca cgcttccacg gcattcgaaa 3600

gaactaatat tgtatcattg tacatatgag gaacacgcag ttgaactgag caaaccagga 3660

ctcaggaaag caggaggtaa gtgctcgctt ttcgtggatc cagaggaacg tgaaaattcg 3720

ccttctcctc ctataccgcc gtatcagata tcagagatgc cccttcatga acttctcgag 3780

tcaggcaatg ctaaattggt tccaaatccc gagtttgatc taactgatcc agacgacttt 3840

cataagtgtt tctcggtcac ctattcagca ttatctttaa tggtaccata tctgcccaga 3900

gctgctctaa aggctgctcg agtgttttgt aaagatcatt caatattaac aacggatatg 3960

cttgatttga attatcttga agagctaatt gagttctcaa aggaaactgt gaacaaaatc 4020

ccagctagaa tccctataga ggacatgctt ctcgagcggg gatatgtgct accatgggtt 4080

catggtggta cagtgaaggg aggaaagcta ctgaccccca acgattgatt ctttaccgaa 4140

tcattgcata attcattgca taattcattg cagaataccg ccggaaacat gagttgcgat 4200

cacagcggac ggtggtggca tgatggggct tgcgatgcta tgtttgtttg ttttgtgatg 4260

atgtatatta ttattgaaaa acgatatcag acatttgtct gataatgctt cattatcaga 4320

caaatgtctg atatcgtttt ggagaaaaag aaaaggaaaa caaactaaat atctactata 4380

taccactgta ttttatacta atgactttct acgcctagtg tcaccctctc gtgtacccat 4440

tgaccctgta tcggcgcgtt gcctcgcgtt cctgtaccat atatttttgt ttatttaggt 4500

attaaaattt actttcctca tacaaatatt aaattcacca aacttctcaa aaactaatta 4560

ttcgtagtta caaactctat tttacaatca cgtttattca accattctac atccaataac 4620

caaaatgccc atgtacctct cagcgaagtc caacggtact gtccaatatt ctcattaaat 4680

agtctttcat ctatatatca gaaggtaatt ataattagag atttcgaatc attaccgtgc 4740

cgattcgcac gctgcaacgg catgccgatc cgaaaaggta aacagacaca aaaacgacaa 4800

gagaagcaaa cacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaaaa aaaaaaacac aaacacaaac 4860

acaaacacaa aaacgctaaa ttatgcacac aagggccggc ggggctgccg gaaaaaaaaa 4920

gggaaaaata cacagacgag cgcgcacaga tggggttacc actgcaagtt acaagttgca 4980

agttgcacgc tggaatcaga attggaatca gaattggaat tggaattaga attagaatta 5040

aacttggggt agccacggga acgggataac tcaggaatcg ctcgcaggcg tctccgtcta 5100

ggcaatccca aggtaagcct aggcactccc acaggggaaa gaacggttga aggcaaagta 5160

gtgctaacaa ttggtaacga atggtaacaa gtgtgtccgt ctccacctga catttgctag 5220

agctggggat tccacattct tgtgctctga attctcaaac cgaaatgggg cgttgttacc 5280

ccaggtatcc ggttgtagtt ggcactgggg atggaaaaaa atgatgttga tgttgagtta 5340

gttgggttga gtcaattagt gcgtgaaagt atcaccactt ttgtcatccg gcgtttctgt 5400

gcgaatcaca cacacacaca cagtttattg gagcacttgt ttctggcgta ttcgtaattg 5460

ttctgcggtg cggttctgtg tgcatttttc ctggggtgtc tgccgcacct actcatcacc 5520

cacgccgtgg gtttgagcca tggcggaggt acgactgact ggctgcctgc ctgcctgact 5580

gactgcctga ctgcaggaaa agagggtttc gaaggaaaaa cttttcctgt gttaatccgg 5640

ccgtgcgccg ctgctccaaa atccaccttc atgagaagga gtttgaaaaa acaaaaaaat 5700

tcacatataa aaagcgtatc tcgagatctc aaagtctccc ttgaatcgtg tttgccagtt 5760

gtaactcatc ctttattctt ctattctatc tctctctttc cttcccctaa tcagcaatta 5820

aatccggggt aaggaagaat tactactgtg tgtaacggtt atatttcgtt ttttattttt 5880

tttttccatt gccatagaga aagaaaaaaa aaaaaaagag agtttgtgaa gatcttccat 5940

tcgaatccca taagtgacac atttaatttt ttttttgtta gatccgcggg ggaatctcta 6000

gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 6060

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 6120

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 6180

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 6240

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 6300

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 6360

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 6420

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 6480

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 6540

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 6600

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 6660

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 6720

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 6780

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 6840

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 6900

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 6960

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 7020

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 7080

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 7140

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 7200

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 7260

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 7320

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 7380

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 7440

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 7500

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 7560

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 7620

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 7680

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 7740

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 7800

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 7860

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 7920

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 7980

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 8040

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 8100

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 8160

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 8220

ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac 8280

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 8340

gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg 8400

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 8460

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc 8520

aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg 8580

ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt 8640

aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg acgattacta gttaaggccg 8700

caagctttga tctgatctgc ttactttact aacgacaaaa aaaaatcaaa aaaaaaaaaa 8760

caatcagtcc ttctcttctt acgatatgat atgattaaat gatgctatga aatcatcttc 8820

ttcttaactt tcttaaatct tacgcgtcac ttactctata tacccgttta gctttgcctg 8880

gtcacagcga cattttatat aagtgtacgt attttctttt tttttttaaa aatttctatt 8940

ctaaccttag aaaagtgccc tttaaaccag ctgtcctggc actatatctt tatcatgtgc 9000

cggtcgcttt ccctttccgt ttcccttttc ctttcaattg gtggcctgga attccgaact 9060

cattttcgca tctgaaacta attctcgaaa cctttaacat caaacaattg aaaagatcat 9120

catcaccaga aataagaaaa agatcaacac aacagctaat aacagtacga aagaaagatc 9180

gctcgagtga aaaggcagcc aagaaaggtc attcgatttg ggtctagact gattatagac 9240

ataccaattg cactcagtaa gaaaatgagt ttcaaatttg acgatgacgg tgtggtaaaa 9300

gaatttcacg gcaacaccat catatgccat attcctcaac aaaccgaatt cttcaacaaa 9360

ttgttggact tctaccgttt tgcgaaacga ctttccttct acgacaagat caccctactt 9420

cctccttcaa gctaccacgt tacgatcatg aattgctgcc acgaacacga tcgttctgag 9480

ggccactggc ccaaaggaat cgatccggac acaagcatgc tgcggtgtac atcacatctg 9540

accaacattc taggatcggt cgaattctga ttggaaagac cattctgctt tacttttaga 9600

gcatcttggt cttctgagct cattatacct caatcaaaac tgaaattagg tgcctgtcac 9660

ggctcttttt ttactgtacc tttgacttcc tttcttattt ccaaggatgc tcatcacaat 9720

acgcttctag atctattatg cattataatt aatagttgta gctacaaaag gtaaaagaaa 9780

gtccggggca ggcaacaata gaaatcggca aaaaaaacta cagaaatact aagagcttct 9840

tccccattca gtcatcgcat ttcgaaacaa gaggggaatg gctctggcta gggaactaac 9900

caccatcgac tgactctatg cactaaccac gtgactacat atatgtgatc gtttttaaca 9960

tttttcaaag gctgtgtgtc tggctgtttc cattaatttt cactgattaa gcagtcatat 10020

tgaatctgag ctcatcacca acaagaaatt ctaccgtaaa agtgtaaaag ttcgtttaaa 10080

tcatttgtaa actggaacag caagaggaag tatcatcagc tagccccata aactaatcaa 10140

aggaggatgt cgactaagag ttactcggaa agagcagctg ctcatagaag tccagttgct 10200

gccaagcttt taaacttgat ggaagagaag aagtcaaact tatgtgcttc tcttgatgtt 10260

cgtaaaacag cagagttgtt aagattagtt gaggttttgg gtccatatat ctgtctattg 10320

aagacacatg tagatatctt ggaggatttc agctttgaga ataccattgt gccgttgaag 10380

caattagcag agaaacacaa gtttttgata tttgaagaca ggaagtttgc cgacattggg 10440

aacactgtta aattacaata cacgtctggt gtataccgta tcgccgaatg gtctgatatc 10500

accaatgcac acggtgtgac tggtgcgggc attgttgctg gtttgaagca aggtgccgag 10560

gaagttacaa aagaacctag agggttgtta atgcttgccg agttatcgtc caaggggtct 10620

ctagcgcacg gtgaatacac tcgtgggacc gtggaaattg ccaagagtga taaggacttt 10680

gttattggat ttattgctca aaacgatatg ggtggaagag aagagggcta cgattggttg 10740

atcatgacgc caggtgttgg tcttgatgac aaaggtgatg ctttgggaca acaatacaga 10800

actgtggatg aagttgttgc cggtggatca gacatcatta ttgttggtag aggtcttttc 10860

gcaaagggaa gagatcctgt agtggaaggt gagagataca gaaaggcggg atgggacgct 10920

tacttgaaga gagtaggcag atccgcttaa gaggggtacc gagctcg 10967

Claims (15)

1.一种猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述猪细小病毒口服疫苗组合物包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：

a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的猪细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；

b)、药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料；

其中，所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码所述猪细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；所述重组表达载体编码所述猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述重组表达载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码所述猪细小病毒VP2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有无抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列。

3.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述重组表达载体还包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、营养缺陷筛选标记基因序列和克鲁维酵母起始复制序列。

4.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母表达载体包含如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。

6.根据权利要求5所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述特定营养基因为URA3基因。

7.根据权利要求5所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10621。

8.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，编码所述猪细小病毒VP2蛋白的基因序列，包括

1)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)、编码取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有猪细小病毒VP2蛋白活性的氨基酸、且由SEQ ID No.1所衍生的核苷酸序列。

9.根据权利要求1所述的猪细小病毒口服疫苗组合物，其特征在于，所述药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料至少包括淀粉。

10.根据权利要求1-7和9中任一项所述的猪细小病毒口服疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、将编码猪细小病毒VP2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；

步骤2、用所述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；

步骤3、使所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株发酵表达所述猪细小病毒VP2蛋白，所述猪细小病毒VP2蛋白在酵母细胞内自组装成猪细小病毒类病毒颗粒；

步骤4、分离纯化获得所述猪细小病毒类病毒颗粒；

步骤5、以所述猪细小病毒类病毒颗粒为活性成分或活性成分之一，与药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料按比例混合均匀，制备得到所述猪细小病毒口服疫苗组合物。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1还包括所述编码猪细小病毒VP2蛋白的核苷酸的密码子优化步骤，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，制备得到的所述猪细小病毒口服疫苗组合物口服免疫小鼠的平均滴度到达3000以上，峰值达到6400以上。

13.根据权利要求1-9中任一项所述的猪细小病毒口服疫苗组合物在制备预防和/或治疗由猪细小病毒引发的疾病的药物和/或疫苗中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述由猪细小病毒引发的疾病包括猪繁殖障碍病、初产母猪易发生死胎、畸形胎和木乃伊胎、仔猪皮炎、腹泻、非化脓性心肌炎和呼吸系统疾病中的任意一种或几种。

15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述猪细小病毒口服疫苗组合物的应用包括用作口服药物和/或疫苗、作为饲料添加剂、饮用水添加剂中的任意一种或几种。