CN113584223A

CN113584223A - 基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法

Info

Publication number: CN113584223A
Application number: CN202110723398.1A
Authority: CN
Inventors: 宋宏彬; 刘鸿博; 邱少富; 王立贵; 杜昕颖; 向莹; 杨明娟; 杨超杰; 刘洪波; 王辉; 王琪
Original assignee: Chinese Pla Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Chinese Pla Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113584223B

Abstract

本发明提供了一种crRNA分子及用于CRISPR‑Cas12a检测SARS‑CoV‑2中D614G突变的方法。本发明提供的crRNA用于CRISPR‑Cas12a技术检测SARS‑CoV‑2中D614G突变的方法简便、易行、快速、特异，当结合重组酶聚合酶核酸扩增技术时，灵敏度为10⁰拷贝/μL，具有极高的灵敏度，相比常用的基因测序方法，能够对病毒含量更低的样本进行鉴定，适合用于大规模筛查。

Description

基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种基因突变的检测方法，属于基因检测应用领域。

背景技术

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2，SARS-CoV-2)是单股正链RNA病毒，其功能性编码基因包括开放阅读框1ab基因(Open ReadingFrame 1ab，ORF1ab)、刺突蛋白基因(Spike protein，S)、包膜蛋白基因(Envelopeprotein，E)、膜蛋白基因(Membrane，M)和核蛋白基因(Nucleocapsid，N)。感染人体后可造成新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，患者出现发热、咳嗽、胸闷、乏力等流感样症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新型冠状肺炎的传染源为新冠病毒感染者，通过呼吸道飞沫，直接接触新冠病毒污染物，粪口途径等多种途径在人群中迅速传播，所有人群均易感。

随着新型冠状病毒疫情的发展扩大，新型冠状病毒出现了非常多的基因位点突变，这些突变株可能增加了新型冠状病毒的传播能力、影响现有治疗的效果、增加感染者死亡风险或影响疫苗的效果等，为疫情的防控又发出了新的挑战。其中，D614G突变毒株引起了极大的关注，由于新冠病毒基因序列中第23403位核苷酸由腺嘌呤A突变成鸟嘌呤G，刺突蛋白上发生了一种非同义突变，第614位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G)引起。该突变株已成为新型冠状病毒的全球主要流行株，传播速度极快。新冠病毒通过刺突蛋白上的受体结合域与血管紧张素转化酶2(Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2)结合后感染人体，D614G突变株中刺突蛋白上的受体结合构象发生改变，更容易与ACE2结合和融合，传染性更高。与此同时，D614G突变株在上呼吸道的复制增强，传染增强，且在年轻病人上呼吸道中的病毒载量更高。该突变株的出现和传播对新冠疫情的防控发出了新的挑战，疫情发生时迅速甄别D614G突变毒株至关重要。新型冠状病毒D614G突变位点鉴定的主要方法有DNA测序、突变扩增阻滞系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)-PCR等，操作复杂、难度大、耗时长、成本高，开发一种快速鉴定D614G突变位点的检测方法非常必要。

CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated gene)全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”，该系统首先在大肠杆菌中被发现。随着对CRISPR-Cas系统作用机制和Cas蛋白功能的逐步揭示，研究人员发现该系统具有强大和广泛的应用潜力，如：作为基因编辑工具，调节基因表达，用于核酸检测和诊断，核酸成像技术，对细菌进行快速分子分型等。新发现的CRISPR-Cas12a系统可用于核酸检测，实现病原体的快速诊断。CRISPR-Cas12a系统用于核酸检测的原理为：Cas12a蛋白首先与相应的crRNA特异性结合形成Cas12a-crRNA复合体，随后识别目标DNA处前间隔序列邻近基序(Protospacer-Adjacent Motif，PAM)，crRNA与DNA双链中的目标链互补结合形成R环，DNA双链解螺旋，RuvC核酸内切酶催化位点构象激活，由于该核酸内切酶位点每次只能嵌入一条DNA链，因此目标DNA双链依次断裂，首先剪切非目标链，随后剪切目标链。切割产物从复合上释放出去后，Cas12a蛋白的RuvC核酸内切酶催化位点保持激活状态，可随机剪切降解任意单链DNA。基于该原理，将单链DNA制备成荧光淬灭探针，通过监测荧光信号的释放实现对目的序列的特异性检测。然而，使用单一的CRISPR-Cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。

常用的核酸扩增方法有：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR),重组酶聚合酶核酸扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA或Recombinase-aidAmplification，RAA)，环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)等。其中RAA可在较低温度下(37～42℃)，短时间内完成核酸扩增反应，具有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强的特点，在病原的快速检测领域有很大的应用潜力。

本发明的目的是基于CRISPR-Cas系统，结合RT-RAA恒温扩增与CRISPR荧光检测方法，提供一种可以快速鉴定D614G突变位点的高灵敏、高特异的核酸检测方法。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种用于CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2中D614G突变的crRNA分子，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

其次，本发明还提供了一种应用上述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2中D614G突变的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备样本核酸模板；

(2)使步骤(1)获取的核酸模板，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述的样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增方法制备。

在一个更为优选的实施方案中，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物选自含有SEQ ID NO.7-11任一所示序列的核苷酸，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物选自含有SEQ ID NO.12-15任一所示序列的核苷酸。

更为优选地，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.11所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.12所示。

在一个优选的实施方案中，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.5所示。在本发明一个具体的实施方案中，所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。

第三，本发明还提供了一种CRISPR-Cas12a技术检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.7-11任一所示序列的上游引物，用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.12-15任一所示序列的下游引物。

在一个优选的实施方案中，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.11所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.12所示。

在一个优选的实施方案中，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.5所示。在本发明一个具体的实施方案中，所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。

第四，本发明提供了一种用于制备上述crRNA的上游DNA单链和下游DNA单链，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游DNA单链的序列如SEQ ID NO.2或4所示。

第五、本发明提供了一种用于制备上述crRNA的方法，先使序列如SEQ ID NO.6所示的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.2或4所示的下游DNA单链进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备所述crRNA。

最后，本发明提供了一种用于评价上述试剂盒灵敏度和/或特异性的质粒，所述质粒是在序列如SEQ ID NO.18所示的pUC57质粒的第402bp至424bp区间插入序列如SEQ IDNO.16或SEQ ID NO.17所示的核酸构建而成。在本发明的一个具体实施方案中，所述pUC57质粒的402bp至424bp区间被序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示的核酸所替换。

本发明提供的CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2中D614G突变的方法简便易行快速，针对样本核酸一步即可完成检测，仅需60分钟，相比常用的基因测序方法(1-2天)时效性更强，有利于针对新冠型别快速调整疫情防控策略。相比基于荧光PCR原理的突变位点鉴定方法，本方法更加直观、准确，便于操作人员掌握和应用。当结合重组酶聚合酶核酸扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术时，即RT-RAA-Cas12a检测技术的灵敏度为10⁰copies/μl，具有极高的检测灵敏度，相比常用的基因测序方法，能够对病毒含量更低的样本进行鉴定，更适合用于大规模筛查。

附图说明

图1crRNA T7体外转录单链DNA的设计示意图；

图2D614G突变位点序列比对结果示意图；

图3含目的基因序列的pUC57质粒图谱；

图4D614靶点crRNA检测突变位点质粒结果图；

图5G614靶点crRNA检测突变位点质粒结果图；

图6D614G突变位点鉴定恒温扩增引物筛选电泳图；

图7新冠D614G突变检测灵敏度结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

试剂：重组CRISPR-Cas12a蛋白(北京科昕生物科技有限公司，货号KX-E-002)、RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)(杭州众测生物科技有限公司)、T7RNA Polymerase(M0251L)(美国New England Biolabs生物公司)、Monarch RNA纯化试剂盒(T2030L)(美国NewEngland Biolabs生物公司)、HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒(E2050S)(美国NewEngland Biolabs生物公司)、DNase I(美国New England Biolabs生物公司)、无酶水(北京宝日医生物技术有限公司(takara中国))

仪器：Eppendorf 5424离心机(德国Eppendorf公司)、DeNovix DS-11FX超微量分光光度计(美国DeNovix公司)、7500FAST荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)、多功能酶标仪(美国MolecularDevices公司)、纯水仪(美国Millipore公司)

实施例1.基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2D614G突变鉴定

1、寻找包含突变位点的靶点并设计靶点crRNA

CRISPR-Cas12a系统的核酸检测目的基因序列5’端需存在TTTN/TTN的PAM序列，在突变位点处选择合适的检测靶点。本发明经过反复的筛选和测试，选自了位于NC_045512.2(23387bp至23406bp)检测靶点。

根据靶点的基因序列以及CRISPR-Cas12a核酸检测系统设计crRNA。crRNA序列由两部分构成：5’端的保守基因序列(scaffold/repeat部分)，以及3’端的靶基因序列的互补序列构成，不同CRISPR-Cas核酸检测系统中crRNA的保守基因序列不同，针对各检测靶点需设计不同的crRNA。crRNA序列可由生物公司直接合成，或通过T7体外转录的方式获得。本发明一个可选的技术方案是通过T7体外转录的方式得到各核酸检测靶点的crRNA，下文将对该过程进行详细介绍。

(1)设计并合成crRNA的T7体外转录模板

在CRISPR-Cas12a系统中，依据双链DNA中目标基因序列的互补基因序列，在其5’端插入CRISPR-Cas12a核酸检测系统的保守基因序列，即可得到该检测靶点的crRNA序列。在该crRNA序列的5’端插入T7启动子基因序列：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.6)，将该基因序列反向互补后即可得到该检测靶点的T7体外转录单链DNA模板。如图1所示，crRNA序列中划线部分为CRISPR-Cas12a核酸检测系统的保守基因序列，体外转录模板序列中划线的部分为T7启动子的反向互补序列。

(2)T7体外转录生成crRNA

1)退火生成T7体外转录所需双链DNA

使用退火的方法生成T7体外转录双链DNA时，需要上游DNA单链和下游DNA单链，其中上游(T7-Foward)为T7启动子序列，下游(T7-Reverse)为各核酸检测靶点的T7体外转录单链DNA模板序列，按照表1所示方案配置退火反应体系。将该反应体系置于PCR仪、水浴锅或恒温金属浴中，95℃孵育10分钟，关闭仪器电源，仪器温度自然降至室温后取出；或将该反应体系放入PCR仪中95℃孵育10分钟后，以0.1℃/s的速率降温至4℃后取出，退火产物于-20℃保存备用。

表1 退火反应体系

2)T7体外转录生成crRNA

将各核酸检测靶点的退火产物作为样本DNA，使用T7体外转录试剂盒(HiScribeT7快速高效RNA合成试剂盒，NEB)进行体外转录，体外转录反应体系如表2所示。将配置好的转录体系混匀并短暂离心后，置于37℃恒温培养箱或恒温金属浴中过夜孵育(12-16小时)。

表2 退火体外转录反应体系

3)crRNA的纯化回收

将过夜孵育的样本取出，向反应管中依次加入20μL无酶水和2μL DNase I，以去除残留的DNA核酸，混匀并短暂离心后置于37℃恒温培养箱或恒温金属浴中孵育15分钟后取出。

使用Monarch RNA纯化回收试剂盒，按照说明书对crRNA进行纯化回收，具体步骤如下：

a)添加100μL RNA Cleanup Binding Buffer至50μL的样本中，吹打混匀后室温静置10分钟，以确保crRNA与反应液充分结合；

b)添加150μL无水乙醇至样本中并吹打混匀，将吸附柱放入收集管中，添加样品反应液至吸附柱中，静置几分钟后13000r离心1分钟，弃废液；

c)将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL RNA Cleanup WashBuffer，13000r离心1分钟，弃废液，该步骤重复两次；洗液第一次使用时应根据说明加入相应体积的无水乙醇；

d)将吸附柱转移至1.5ml无酶管中，加入20-30μL无酶水至吸附膜，对纯化的样本crRNA进行洗脱，室温下静置10分钟后13000r离心1分钟，收集离心液；使用超微量分光光度计测量crRNA浓度，于-80℃冰箱保存备用。

所有的T7体外转录单链DNA模板序列，以及T7启动子基因序列均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

结果：根据CRISPR-Cas12a核酸检测靶点设计原理，突变碱基的位置应尽量靠近PAM序列，落在核酸检测基因序列种子区，而D614G突变碱基位点的5’端无5’-TTTN-3’的PAM序列，但靠近其3’端存在5’-NAA-3’的PAM序列，利用该位点，设计合成相应的CRISPR-Cas12a核酸检测的crRNA及其T7体外转录单链DNA序列。共设计合成了2条突变位点鉴定用crRNA，一条为非突变株鉴定靶点D614，一条为突变株鉴定靶点G614，其中一条可有效鉴定出突变位点即可。基因序列比对结果和crRNA序列信息分别见图2和表3。图2中G614为突变株，D614为非突变株。

表3 D614G突变位点核酸检测靶点crRNA和crRNA T7体外转录序列

注：下划线标注出D614G突变核苷酸位点；D614为非突变株，G614为突变株。

2、阳性质粒标准品

方法：将包括新型冠状病毒D614G突变位点的593bp的核苷酸序列插入pUC57质粒(北京天一辉远生物科技有限公司，序列见SEQ ID NO.18)骨架中(替换402bp至424bp区间)，合成新冠病毒D614G位点非突变株和突变株的阳性质粒标准品。其中，D614的序列见SEQ ID NO.16，G614的序列见SEQ ID NO.17。pUC57质粒的质粒图谱如图3所示，Target标识为插入序列所在位置。所有的质粒全基因组序列均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

3、基于CRISPR-Cas12a系统的核酸检测

(1)合成单链DNA荧光报告探针

在单链DNA基因序列的两端分别标记FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团，即可构成单链DNA荧光报告探针。报告探针的基因序列为：5’-FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’(SEQ IDNO.5)，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

(2)CRISPR-Cas12a系统的荧光检测

使用本研究建立的CRISPR-Cas12a核酸检测体系对新冠病毒D614G突变位点各检测靶点的基因扩增产物进行检测，按照表4配制荧光检测体系。将配制好的反应液加入96孔板中，使用多功能酶标仪或荧光定量PCR仪进行荧光强度检测，其中酶标仪设置激发光波长495nm、发射光波长520nm，荧光定量PCR仪选择FAM荧光通道。反应温度为37℃，每隔2分钟检测一次荧光值，连续检测30-60分钟，观察各靶点CRISPR检测反应中荧光强度升高情况。

表4 CRISPR-Cas12a荧光检测体系

注：荧光定量PCR仪的反应体系总体积为25μL，表中各反应组分均减半。

(3)阳性结果判定

与阴性对照相比，检测60分钟时荧光强度有明显升高，经过统计学分析，三次重复实验的荧光强度值与阴性对照间有统计学差异。

4、筛选D614G突变位点CRISPR-Cas12a鉴定靶点

方法：设计合成含有非突变位点基因序列以及突变位点基因序列的阳性质粒，使用相同浓度的阳性质粒作为样本核酸，使用两种鉴定crRNA，且crRNA浓度保持一致，进行CRISPR-Cas12a荧光检测，观测荧光值变化情况。

结果：检测结果如图4和图5所示：使用非突变株(D614)crRNA进行CRISPR荧光检测时，反应60分钟，非突变位点和突变位点的阳性质粒荧光值均升高，与阴性对照相比有统计学意义；使用突变株(G614)crRNA对非突变位点和突变位点质粒检测时，反应60分钟，含突变位点基因序列的质粒荧光值升高，P＜0.01，非突变位点(D614)质粒荧光值与阴性对照相比差异无统计学意义。该结果说明针对G614靶点的crRNA(SEQ ID NO.3)具备区分D614位点和G614位点的特异度，能够有效区分新冠病毒D614型和G614型。因此最终选择突变位点G614的检测靶点(G614crRNA(SEQ ID NO.3)对新型冠状病毒D614G突变位点进行鉴定。图4中，a：D614靶点crRNA检测非突变株和突变株阳性质粒，60分钟内CRISPR-Cas12a检测荧光值变化折线图；b：D614靶点crRNA检测非突变株和突变株阳性质粒60分钟时的荧光强度值，各组荧光值与阴性对照组比较，****为P＜0.0001。D614为非突变株，G614为突变株，NC为阴性对照。图5中，a：G614靶点crRNA检测非突变株和突变株阳性质粒，60分钟内CRISPR-Cas12a检测荧光值变化折线图；b：G614靶点crRNA检测非突变株和突变株阳性质粒60分钟时的荧光强度值，各组荧光值与阴性对照组比较，**为P＜0.01。D614为非突变株，G614为突变株，NC为阴性对照。

实施例2.基于RT-RAA恒温扩增及CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2D614G突变鉴定

1、D614G突变位点鉴定恒温扩增引物的设计与筛选

(1)设计各检测靶点的恒温扩增引物

RT-RAA恒温扩增引物的设计要求为：引物长度为30-35bp，引物的5’端为AT碱基富集区，引物的3’端为CG碱基富集区，避免引物自身形成发夹结构，避免上下游引物之间形成引物二聚体，可不考虑引物本身的溶解温度Tm值。在本实验中，设计恒温扩增引物时，在保证引物扩增效率的情况下，使扩增产物的片段长度尽量小。

在每个CRISPR核酸检测目的基因处设计多条上游扩增引物和多条下游扩增引物，配对组合后对含有各检测靶点基因序列的阳性质粒标准品进行扩增。所有的引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

(2)反转录-RAA扩增(RT-RAA)

使用RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)，对新型冠状病毒样本核酸进行一步法反转录-恒温扩增反应，核酸扩增体系同表5。将配置好的反应溶液置于42℃恒温金属浴或PCR仪中反应30分钟，扩增完成后取出，扩增产物于4℃保存备用。

表5 RT-RAA恒温扩增体系

注：A液为水化溶液，B液为乙酸镁。

核酸扩增效果可通过DNA凝胶电泳检测判定。

结果：

设计合成了5条上游引物和4条下游引物，用于D614G突变位点的恒温核酸扩增反应，各引物基因序列信息见表6，将上下游引物配对组合，恒温扩增含有G614突变位点基因序列的阳性质粒，经过DNA凝胶电泳检测分析扩增情况，最终选取扩增效果较好且扩增片段较小的引物对G-AF5/G-AR1建立恒温扩增体系(见图6)。图6中，1-4泳道：1F与1R-4R依次配对；5-8泳道：2F与1R-4R依次配对；9-12泳道：3F与1R-4R依次配对；13-16泳道：4F与1R-4R依次配对；17-20泳道：5F与1R-4R依次配对。17泳道为最终选择引物对扩增结果。

表6 D614G突变位点鉴定恒温扩增引物

2.D614G突变位点鉴定的检测下限

将G614突变株阳性质粒作为标准品，用于评价靶点RT-RAA-CRISPR荧光检测的灵敏度/检测下限。使用超微量分光光度计测量阳性质粒的浓度，根据质粒浓度和质粒片段大小计算质粒拷贝数(copies)。对质粒浓度进行十倍梯度稀释，直至稀释到单拷贝每微升为止。

质粒拷贝数计算如公式(I)所示：

注：c为质粒浓度，DNA length为阳性质粒的基因序列全长，x为最终得到的质粒拷贝数。

结果：使用筛选得到的G-AF5/G-AR1恒温扩增引物，对梯度稀释的各浓度G614突变株阳性质粒进行扩增，同时扩增高浓度的D614非突变株阳性质粒，使用G614检测靶点crRNA(SEQ ID NO.3)对扩增产物进行CRISPR-Cas12a检测。结果如图7所示，图7中，a：G614靶点检测各浓度突变株60分钟内样本荧光值变化折线图；b：G614靶点检测各浓度突变株60分钟的荧光强度值，各组荧光值与阴性对照组比较，***为P＜0.001。NC为阴性对照。反应60min后，G614检测靶点的检测下限可达10⁰拷贝/μL，P＜0.001，其它浓度G614质粒样本的CRISPR检测荧光值与阴性对照相比，P值均小于0.0001，该方法对G614突变位点的鉴定较灵敏。因此，本发明提供的RT-RAA联合CRISPR-Cas12a鉴定D614G靶点方法能够有效分辨G614突变株的最低检测限为10⁰拷贝/μL。

在特异性方面，图4和图5的结果表明，本发明提供的RT-RAA联合CRISPR-Cas12a鉴定D614G靶点方法能够有效分辨D614和G614单位点突变，说明本发明具有显著的特异性。

序列表

<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心

<120> 基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uaauuucuac uaaguguaga uacauccuga uaaagaacag c 41

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgttcttt atcaggatgt atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga uacacccuga uaaagaacag c 41

<210> 4

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgttcttt atcagggtgt atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttttttttt tt 12

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg 20

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacattgctg acactactga tgctgtccgt gatcc 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaatggttt aacaggcaca ggtgttctta ctgag 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgttcttac tgagtctaac aaaaagtttc tgcct 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcagagaca ttgctgacac tactgatgct gtccg 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatccacaga cacttgagat tcttgacatt acacc 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgccaagtag gagtaagttg atctgcatga atagc 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acattagaac ctgtagaata aacacgccaa gtagg 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgaaaaaca ttagaacctg tagaataaac acgcc 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttgacatgtt cagcccctat taaacagcct gcacg 35

<210> 16

<211> 593

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 16

agagtagtag tactttcttt tgaacttcta catgcaccag caactgtttg tggacctaaa 60

aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt gtcaatttca acttcaatgg tttaacaggc 120

acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac 180

attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat ccacagacac ttgagattct tgacattaca 240

ccatgttctt ttggtggtgt cagtgttata acaccaggaa caaatacttc taaccaggtt 300

gctgttcttt atcaggatgt taactgcaca gaagtccctg ttgctattca tgcagatcaa 360

cttactccta cttggcgtgt ttattctaca ggttctaatg tttttcaaac acgtgcaggc 420

tgtttaatag gggctgaaca tgtcaacaac tcatatgagt gtgacatacc cattggtgca 480

ggtatatgcg ctagttatca gactcagact aattctcctc ggcgggcacg tagtgtagct 540

agtcaatcca tcattgccta cactatgtca cttggtgcag aaaattcagt tgc 593

<210> 17

<211> 593

<212> DNA

<213> SARS-CoV-2

<400> 17

agagtagtag tactttcttt tgaacttcta catgcaccag caactgtttg tggacctaaa 60

aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt gtcaatttca acttcaatgg tttaacaggc 120

acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac 180

attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat ccacagacac ttgagattct tgacattaca 240

ccatgttctt ttggtggtgt cagtgttata acaccaggaa caaatacttc taaccaggtt 300

gctgttcttt atcagggtgt taactgcaca gaagtccctg ttgctattca tgcagatcaa 360

cttactccta cttggcgtgt ttattctaca ggttctaatg tttttcaaac acgtgcaggc 420

tgtttaatag gggctgaaca tgtcaacaac tcatatgagt gtgacatacc cattggtgca 480

ggtatatgcg ctagttatca gactcagact aattctcctc ggcgggcacg tagtgtagct 540

agtcaatcca tcattgccta cactatgtca cttggtgcag aaaattcagt tgc 593

<210> 18

<211> 2710

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 480

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 540

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 600

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 660

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 720

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 780

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 840

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 900

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 960

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1020

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1080

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1140

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1200

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1260

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1320

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1380

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1440

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1500

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1560

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1620

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1680

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1740

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1800

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1860

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1920

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1980

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2040

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2160

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2220

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2280

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2340

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2400

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2460

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2520

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2580

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2640

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700

ccctttcgtc 2710

Claims

1.一种用于CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2中D614G突变的crRNA分子，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

2.一种应用权利要求1所述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2中D614G突变的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备样本核酸模板；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增方法制备。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物选自含有SEQ ID NO.7-11任一所示序列的核苷酸，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物选自含有SEQ ID NO.12-15任一所示序列的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.11所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.12所示。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.5所示。

7.一种CRISPR-Cas12a技术检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.7-11任一所示序列的上游引物，用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.12-15任一所示序列的下游引物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.11所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.12所示。

9.根据权利要求7或8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的序列如SEQ IDNO.5所示。

10.一种用于制备权利要求1所述crRNA的上游DNA单链和下游DNA单链，其特征在于，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游DNA单链的序列如SEQ ID NO.2或4所示。

11.一种用于制备权利要求1所述crRNA的方法，其特征在于，先使序列如SEQ ID NO.6所示的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.2或4所示的下游DNA单链进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备所述crRNA。

12.一种用于评价权利要求7所述试剂盒灵敏度和/或特异性的质粒，其特征在于，所述质粒是在序列如SEQ ID NO.18所示的pUC57质粒的第402bp至424bp区间插入序列如SEQ IDNO.16或SEQ ID NO.17所示的核酸构建而成。