CN114807453B

CN114807453B - 一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组及其应用

Info

Publication number: CN114807453B
Application number: CN202210734367.0A
Authority: CN
Inventors: 崔淑娟; 赵佳琛; 刘医萌; 彭晓旻; 卢桂兰; 石伟先; 潘阳; 张代涛; 杨鹏; 王全意
Original assignee: Beijing Center for Disease Prevention and Control
Current assignee: Beijing Center for Disease Prevention and Control
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-06-27
Also published as: CN114807453A

Abstract

本发明提供了一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组及其应用，所述特异性引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ NO：2所示，所述的引物组用于新冠病毒omicron株S基因的472‑474位插入位点区RT‑RAA丰度扩增，建立了与荧光CRISPR切割效应兼容在一个反应体系中的一步法荧光CRISPR检测技术，具有较高的特异性、灵敏度及稳定性，并且操作简便快捷，为现场检测、卫生评价、临床诊断等方面提供了有力的技术支撑。

Description

一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，尤其是一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组及其应用。

背景技术

2021年11月26日，世界卫生组织将新冠病毒omicron株定义为第五种“关切变异株”，取名希腊字母Omicron（奥密克戎）变异株，随后迅速传播到全球各地，成为目前全球主流新冠毒株。新冠病毒 omicron 株病例相对病毒载量高、传染性极强、有的感染者易发展为重症，对于新冠病毒的检测，特别是omicron变异株的鉴定尤为重要。

SARS-CoV-2是一类呈球形（有些呈多形）、表面有突起、电镜下观察形似皇冠的病毒，直径在75-160nm。病毒基因为连续线性单链RNA，全基因组序列全长约29000 bp，共包含14个主要的开放阅读框（ORF），能够编码27种蛋白质。其中S蛋白是病毒表面的刺突蛋白，是病毒进入细胞和介导细胞融合的一个重要的结构蛋白，它是感染后中和抗体的主要目标，也是治疗和疫苗设计的重点。新冠病毒omicron株的传染性更强，源于S蛋白上很多位点的突变，其中472-474位插入位点是新冠omicron株的特征性变异位点之一。

目前，新冠病毒的主要检测方法是实时荧光RT-PCR检测技术，针对的靶点是ORF1ab和N基因的保守区，不能鉴定新冠omicron株的关键变异位点。另外，目前鉴定omicron株的方法是实时荧光方法，并且针对的是变异位点，不能直接通过扩增曲线来判读结果，主要是依靠两条扩增曲线的CT值的差值来判定，大大影响了检测的特异性。

CRISPR检测技术原理是利用RT-RPA丰度扩增靶基因片段后，RPA与T7转录相结合，将扩增后靶基因片段转化为RNA。然后Cas13a酶在向导crRNA的引导下识别丰度扩增的靶序列并结合，激发了它对周围荧光报告RNA的切割，根据荧光信号判定目的核酸存在。目前，Cas13a酶主导的CRISPR的检测技术一般分为两步完成，第一步是RT-RPA丰度扩增；第二步将扩增产物再用于荧光CRISPR的检测。现有技术中虽然存在利用CRISPR-Cas12n-NER的方法检测新冠病毒的方法，其检测方法和检测灵敏度均有待于进一步提高（参见参考文献WANG,X.J. et al，Rapid and sensitive detection of COVID-19 using CRISPR/Cas12a-based detection with naked eye readout, CRISPR/Cas12a-NER，ScienceBulletin 65 (2020) 1436–1439）。而现有技术中还未有相关的方法利用Cas13a酶一步荧光法针对omicron毒株的检测方法，也未有针对新冠omicron株472-474位插入位点的检测。本发明即弥补了现有检测方法中的上述缺陷，针对新冠omicron株472-474位插入位点设计特异性的引物和crRNA序列，实现一步荧光法的灵敏和特异性检测。

发明内容

本发明的目的是提供新冠病毒omicron株S基因472-474位插入位点的一步法荧光CRISPR检测技术。主要技术方案为：

我们成功设计和合成了针对新冠病毒omicron株S基因472-474位插入位点区RT-RAA丰度扩增的特异性引物和向导crRNA序列，并且优化了其工作浓度，建立了针对新冠病毒omicron株S基因472-474位插入位点的一步法荧光CRISPR检测技术。该方法通过对多种其他呼吸道病毒及新冠病毒其他突变株的检测、已知病毒载量的新冠omicron株阳性核酸倍比稀释液的检测以及重复性试验等，说明该方法具有较高的特性、灵敏度和稳定性。

在本发明的第一方面，提供了一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ NO：2所示，所述的引物组用于新冠病毒omicron株S基因的472-474位插入位点区RT-RAA丰度扩增。

在本发明的第二方面，提供了一步法荧光CRISPR检测技术的向导crRNA分子，如SEQ NO：3所示。

在本发明的第三方面，提供了一步法荧光CRISPR检测技术的检测试剂盒，其中包括如下组分：

a) RT-RAA丰度扩增酶，包括等温扩增酶和反转录酶；

b) SEQ NO：1、2所示引物；

c) cas13a酶；

d) SEQ NO：3所示向导crRNA；

e) 反应缓冲液(醋酸镁、RNA保护剂、NTP等)。

在一个具体的实施例中，所述的试剂盒中，组分a）中的等温扩增酶的工作浓度8～12µg、反转录酶的工作浓度为3～7µg；组分b）中所述的引物的工作浓度为8～12μM；组分c）中Cas13a酶的工作浓度为8～12µg；组分d）中crRNA的工作浓度为10～18μM。

在本发明的第四方面，提供了一步法荧光CRISPR检测方法，其中所述的检测方法中的的反应条件：

1) Reporter选择FAM，Quencher选择None，Passive Reference选择None。

2) 45℃ 5 min,收集荧光；

3) 60℃ 30秒设置40个循环,收集荧光；

4) 60℃ 30秒设置1个循环,收集荧光；

5)以是否存在扩增曲线或检测值来判定检测结果(检测值ΔRn =（RnCycle42-RnCycle1）/RnCycle1)。

所述的检测方法为非诊断的检测方法。

在本发明的第五方面，提供第一方面和第二方面所述引物和向导序列在制备新冠病毒omicron株S基因472-474位插入位点检测试剂中的应用。

本发明的有益效果将RT-RAA丰度扩增与荧光CRISPR切割效应兼容在一个反应体系中，一步法完成了新冠omicron株472-474位插入位点的鉴定，只要有扩增曲线，就代表存在S基因472-474位插入位点，即omicron株，如果没有扩增，则表明不是omicron株，结果判定简便高效。该方法不仅特异性强、灵敏度高、稳定性好，并且操作简便快速，在新冠omicron突变株的临床诊断等方面显示出良好的应用前景。

附图说明

图1：利用本发明的引物和crRNA序列检测新冠病毒omicron株的特异性验证；

图2：利用本发明的引物和crRNA序列检测新冠病毒omicron株的灵敏性验证。

具体实施方式

下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：

RT-RAA丰度扩增特异性引物设计：以新冠病毒omicron株（EPI_ISL_10969390）S基因的S基因的432-582nt之间作为扩增的靶区域。上游引物序列如SEQ NO：1所示，上游引物合计56bp，其中5’端25bp是T7聚合酶识别序列aattctaatacgactcactataggg，后31bp是针对新冠omicron株S基因432-582nt区域的序列。下游引物如SEQ NO：2所示，特异性下游引物合计34bp，是针对新冠omicron株S基因472-474位插入位点区域的序列反向互补序列，SEQNO：1和SEQ NO： 2扩增的片段长度为150bp。所述SEQ NO：1的浓度是10µM；SEQ NO：2的浓度是10µM。

向导crRNA设计：向导crRNA长度约为66nt，5’端38bp为固定的骨架序列，后28nt是与SEQ NO：1和SEQ NO： 2扩增的片段150bp区进行互补，向导crRNA序列如SEQ NO：3所示。

一步法荧光CRISPR检测技术的体系配制：

1）RT-RAA丰度扩增酶（等温扩增酶10µg、反转录酶5µg）

2）SEQ NO：1和SEQ NO： 2（工作浓度均为10µM）

4）SEQ NO：3最佳工作浓度是15µM

3）cas13a酶(工作浓度分别为8µg)

4）荧光报告RNA(工作浓度为15µM)

5）反应预混液:醋酸镁(工作浓度为20mM)、RNA保护剂(工作浓度为10µL)、dNTP工作浓度为20µM)

一步法荧光CRISPR检测技术的反应条件：

a) Reporter选择FAM，Quencher选择None，Passive Reference选择None。

b) 45℃ 5 min,收集荧光；

c) 60℃ 30秒设置40个循环,收集荧光；

d) 60℃ 30秒设置1个循环,收集荧光；

e)以是否存在扩增曲线或检测值来判定检测结果(检测值ΔRn =（RnCycle42-RnCycle1）/RnCycle1)

实施例2：

SEQ NO：1和SEQ NO：2的最佳工作浓度确定：将SEQ NO：1和SEQ NO：2的浓度配制成50µM、20µM、10µM、5µM梯度，按矩阵式配对浓度配制（表1），其他成份浓度如实施例1中配制，反应条件同实施例1中记载。根据扩增曲线起峰起点的荧光值越大并且引物浓度较小时作为优选判定结果，确定SEQ NO：1和SEQ NO：2的最佳工作浓度均为10µM。

表1 SEQ NO：1和SEQ NO：2的矩阵式配对浓度扩增曲线起点荧光值

实施例3：

SEQ NO：3(向导crRNA)的最佳工作浓度确定：将SEQ NO：3的浓度配制成50µM、20µM、10µM、5µM梯度，其他成份浓度如实施例1中所述配制，SEQ NO：1和SEQ NO：2的最佳工作浓度均为10µM。反应条件同实施例1中记载。根据扩增曲线起峰起点的荧光值越大并且向导crRNA浓度较小时作为优选判定结果，最后确定SEQ NO：3的最佳工作浓度均为15µM。

实施例4：

一步法荧光CRISPR检测技术分析特异性验证：

将新冠omicron株提取的RNA为阳性对照，分别对新冠野生株、新冠Alpha株、新冠Delta株、甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒（PIV）、腺病毒（AdV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人偏肺病毒（hMPV）、人普通冠状病毒（OC43）、人博卡病毒（hBoV）、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）的阳性样本提取核酸分别进行检测，以确认一步法荧光CRISPR检测体系的分析特异性。结果表明，只有新冠omicron株的检测值≧ΔRn[ΔRn=（RnCycle42-RnCycle1）/RnCycle1)],结果如图1所示；说明本发明检测体系具有很高的分析特异性。

实施例5:

一步法荧光CRISPR检测技术分析灵敏度验证：

新冠Omicron株的阳性核酸起始定量为5×10⁴copies/mL，然后将其进行10倍倍比稀释，倍比稀释载量从5×10⁴copies/mL到0.05 copies/mL，共7个稀释度，分别进行一步法荧光CRISPR检测，各个梯度进行3个重复，以检测值≧ΔRn为临界值，结果表明，该发明检测体系的分析灵敏度为5 copies/mL（结果如图2所示），显著优于了现有技术公开的10copies/mL的检测下限。

实施例6:

一步法荧光CRISPR检测技术稳定性验证：

在同一次试验中（同一个PCR板），对10倍梯度稀释的omicron株病毒阳性核酸（设置10^-1、10^-2、10^-3稀释梯度）CRISPR检测，每个样本做3个重复；另外在不同PCR板上重复3次，结果各个稀释度样品的批内三个重复反应获得的Ct值的变异系数CV%在4.04%~4.80%之间，批间重复的变异系数CV%在4.35%~4.77%之间，详见表2。

表2 一步法双重荧光RT-PCR检测方法的批内重复试验和批间重复试验结果

实施例7:

一步法荧光CRISPR检测技术临床应用验证：

利用208份隔离点人员的鼻咽拭子样本进行临床验证，并且与已获得国家药监局批证的新冠检测试剂（靶标是OFR1ab和N基因）同时进行检测，其灵敏度与特异性均为100%，结果详见表3。

表3 一步法荧光CRISPR与新冠实时荧光PCR试剂检测结果的比较

综上，本发明的新冠omicron株S基因472-474位插入位点区域的序列反向互补序列，SEQ NO:1和SEQ NO:2的扩增引物和SEQ NO:3的crRNA序列可以利用CRIPR的方法一步荧光法特异性检测新冠omicron株，且具有良好的灵敏度和特异性，基于所述引物和crRNA制备的试剂盒具有良好的稳定性，具有很好的应用前景。

序列表

<110> 北京市疾病预防控制中心

<120> 一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattctaata cgactcacta tagggagtgt gcgaatttca gttttgcaac gatccg 56

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acggctggct cacatattca aaggtgcagt tgtt 34

<210> 3

<211> 66

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggauuuaga cuaccccaaa aacgaagggg acuaaaacua ucguuucacc cgccguugau 60

auugau 66

Claims

1.一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ NO：1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQNO：2所示，所述的引物组用于新冠病毒omicron株S基因的472-474位插入位点区RT-RAA丰度扩增。

2.一种一步法荧光CRISPR检测技术的向导crRNA分子，其特征在于，其核酸序列如SEQNO：3所示。

3.一种一步法荧光CRISPR检测技术的检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：

a) RT-RAA丰度扩增酶，包括等温扩增酶和反转录酶；

b) SEQ NO：1所示上游引物，SEQ NO：2所示下游引物；

c) cas13a酶；

d) SEQ NO：3所示向导crRNA分子；

e) 反应缓冲液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中，组分a）中的等温扩增酶的工作浓度8～12µg、反转录酶的工作浓度为3～7µg；组分b）中所述的引物的工作浓度为8～12μM；组分c）中Cas13a酶的工作浓度为8～12µg；组分d）中crRNA的工作浓度为10～18μM。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，组分e)反应缓冲液包括醋酸镁、RNA保护剂、NTP。

6.一种一步法荧光CRISPR检测COVID-19 omicron变异株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）收集含有病毒的样本并提取核酸；

2）配制反应体系：按照权利要求3所述的试剂盒中各个组分配制反应体系；

3）上机检测并根据荧光分析获得检测结果；

所述一步法荧光CRISPR检测COVID-19 omicron变异株的方法为非诊断的应用。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3）中的上机检测的反应条件为：

1) Reporter选择FAM，Quencher选择None，Passive Reference选择None；

2) 45℃ 4～7 min,收集荧光；

3) 58～62℃ 28～35秒设置35～45个循环,收集荧光；

4) 58～62℃ 28～35秒设置1～3个循环,收集荧光；

5)以是否存在扩增曲线或检测值来判定检测结果。

8.权利要求6或7所述的方法，其特征在于，检测的omicron S蛋白编码基因具有472-474位插入位点的突变。

9.权利要求1所述特异性引物组或权利要求2所述的crRNA分子在制备新冠病毒omicron株S基因472-474位插入位点检测试剂中的应用。