JP2007508824A - 核酸のプライマーに基づく増幅のための方法及びキット - Google Patents

Abstract

診断又は疾患因子と二次疾患因子の鑑別診断のための新規方法を開示する。開示された方法は、その核酸配列が公知であるいずれかの疾患因子及び／又は二次疾患因子からの標的配列の感受性の高い特異的な増幅を可能にする、ＴｅｍＰＣＲと称する新規増幅戦略を用いる。ＴｅｍＰＣＲ法は、検出すべき疾患因子又は二次疾患因子に特異的な標的富化プライマーの少なくとも１セット（低濃度で存在する）及び共有標的増幅プライマーの少なくとも１対（高濃度で存在する）を利用する。前記標的富化プライマーの少なくとも１対は、標的増幅プライマーのための結合配列を含む。従って、ＴｅｍＰＣＲ法の使用は、多重増幅パラメータの経験的最適化を必要とせずに多重増幅反応を実施することを可能にする。ＴｅｍＰＣＲ法と共に使用するための、核酸単離及び標的配列の検出のための方法も開示する。

Description

外的病原因子の有効な封じ込めと制御のための１つの重要な問題は、この病原因子に感染した患者の時宜を得た正確な診断である。このような診断の１つの側面は鑑別診断を含む。鑑別診断とは、対象とする疾患因子によって引き起こされる疾患状態を有する患者、及び同様の臨床症状発現をもたらす１又はそれ以上の二次因子によって引き起こされる疾患状態を有する患者の判定と特定を意味する。対象疾患因子によって引き起こされる状態において認められる症状／臨床発現は二次因子によって引き起こされる状態でも認められることがあるので、この鑑別診断は極めて重要である。従って、誤診の可能性は重大な問題である。このような誤診は、偽陽性及び偽陰性の両方を生じさせ得る。これらの種類の誤診の各々が疾患因子の封じ込めと制御に有害な影響を及ぼす。例えば偽陰性は、感染個体が一般個体群に疾患因子を拡散し続けることを可能にする。偽陽性は、保健医療システム及び不必要な治療を受けることを求められる個人への負担増加を生じさせる。

偽陽性及び偽陰性は、封じ込め、制御及び有効な公衆衛生上の対応のために病原因子の正確で迅速な特定が必要とされる、生物テロの場合に特別な懸念となり得る。生物テロの使用に関する懸念の増大は、連邦保健機関に、このような攻撃から国民を保護するための手段を急ぐことを促した。２００２年２月に、米国立アレルギー感染研究所（ＮＩＡＩＤ）は、ＣＤＣカテゴリーＡ、Ｂ及びＣ病原因子に関するこのバイオテロ防衛策研究計画（Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｇｅｎｄａ）を発表した。この研究計画の目標の１つは、生物テロにおいて使用される可能性のある病原因子に適用できる診断試験の開発であった。この計画は、「生物テロリストの脅威に対する有効な対策には、関与する病原体を特定することができる診断が必要である。しかし、生物脅威とみなされる多くの病原体の初期臨床徴候及び症状は非特異的であり、一般的な感染に類似する。生物テロ生物又は毒素の導入を迅速に特定する能力は、高度に感受性で、特異的であり、安価で、使い易く、プライマリーケア環境に存在する診断ツールを必要とする。」と述べている。

上述した問題及び課題の一例として、最近の重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の発生が考慮される。ＳＡＲＳの臨床症状は、特に初期段階では、発熱、悪寒及び中等度から重症の咳を含んだ。明らかに、これらの症状は他の病原因子によって引き起こされる多くの状態で認められる。ＳＡＲＳ様の症状を有する状態を引き起こすことができる他の病原因子は、呼吸器合胞体（ＲＳ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス１型及び３型、インフルエンザＡ型及びＢ型ウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、マイコプラスマ菌種及びクラミジア菌種を含むが、これらに限定されない。

疾患因子の検出において一般的に使用される３つのクラスの診断試験がある：ｉ）ＥＬＩＳＡ試験；ｉｉ）細胞培養法；及びｉｉｉ）分子試験。これらの試験の各々がそれ自体の利点と難点を有している。ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）は抗体検査である。臨床症状の発現後２１日目までに患者の血清中の疾患因子に対する抗体を確実に検出する。ＥＬＩＳＡは特異的であるが、検出が疾患管理において有用であるためには検出までに時間がかかりすぎる。疾患因子の封じ込めと制御のために必要とされる早期情報を提供することができない。

細胞培養法は生菌の存在を検出する。疾患因子に感染している疑いのある個体から試料を採取し、この疾患因子を細胞培養において増殖させるか又は選択培地で規定条件に従って培養する。いずれの工程も、時間がかかる、困難で危険な作業であるが、生菌の存在を示すための唯一の手段である。ＥＬＩＳＡと同様に、この試験も比較的特異的であるが、検出が疾患管理において有用であるためには検出までに時間がかかりすぎる。

分子試験は、一般にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の多くの変法のいずれか１つを使用する。ＰＣＲは、疾患因子に感染したことが疑われる個体からの様々な標本（血液、糞便、呼吸器分泌物又は体組織）中の病原因子の遺伝物質を検出することができる。既存のＰＣＲ試験は非常に特異的であるが、感受性を欠く。これは、病原因子がまだ患者標本中に存在しない可能性があるか若しくは増幅と検出のスキームが遺伝物質を特定できないためである。従って、陰性試験は個体における疾患因子の存在を除外することができない。

多重ＰＣＲは、遺伝子座特異的プライマーの多数のセットを使用して、１つの反応で多数の生物からの標的配列の増幅を可能にする。従って、多重ＰＣＲは鑑別診断に適する。しかし、多重ＰＣＲ法には限界がある。多重ＰＣＲ法に関連する２つの主要な問題が存在する。１つは、増幅する各々の標的配列（又は遺伝子座）がそれ自体の増幅効率を有することである。遺伝子座特異的増幅効率は、プライマー標的の組成物、標的に対するプライマーの結合親和性、プライマーのプライミング効率及び反応成分の利用率を含む多数の因子によって決定される。１つの反応において多数の標的遺伝子座を一緒にすることは、選択的増幅又は一部の増幅反応の阻害を生じさせる、様々なプライマーセットの間での不適合性を導入し得る。２番目の問題は、プライマー対遺伝子座の最適比率の特定である。プライマー濃度を高く設定しすぎた場合、プライマー二量体及びバックグラウンド増幅が起こる。しかし、プライマー濃度が低すぎると、標的配列の所望対数増幅が起こらない。

多重ＰＣＲを最適化するためには、プライマー、緩衝液、ｄＮＴＰ、酵素及びＭｇＣｌ_２の濃度をプライマーの組合せの各々のセットに関して経験的に決定する必要がある。生み出したアッセイの各々のロットについて実施する必要があるというのは、時間のかかる工程である。徹底的な最適化実験後でさえも、多重ＰＣＲが成功するという保証はない。

本発明の開示は、疾患因子の診断及び／又は１又はそれ以上の二次疾患因子の存在下での疾患因子の鑑別診断のための迅速で正確な分子診断法を提供する。簡単に述べると、疾患因子及び／又は二次疾患因子を含むことが疑われる試料から核酸試料を得る；核酸はＤＮＡ又はＲＮＡ（プラス鎖又はマイナス鎖のいずれか）又はこの組合せであり得る。多重増幅反応を使用して、１つの容器内での１回の増幅反応を通して核酸から所定の標的配列を増幅する。標的配列を含む増幅産物を検出し、多重検出戦略を用いて鑑別する。疾患因子又は二次疾患因子からの標的配列の検出は、試料におけるこの存在を指示する。ここで開示する方法を用いると、疾患因子の診断又は鑑別診断がわずかに３時間で実施できる。高い処理能力は、各々のプライマーの組合せに関する複雑で時間のかかる最適化手順を必要とせずに、１日当り数百の試料の分析を可能にする。このような方法は当技術分野では存在しない。

多重分析システム（ＭＡＳ）と称する、ここで記載の方法は、疾患因子の診断及び／又は疾患因子と二次疾患因子の鑑別診断のための迅速で便利な方式を提供する。本明細書において使用する、「病原因子」は、形態に関わりなく、細菌（リストのクラス）、ウイルス（ウイルスはＤＮＡゲノム、マイナス鎖ＲＮＡゲノム又はプラス鎖ＲＮＡゲノムを有し得る）又は寄生生物を含むがこれらに限定されない、核酸を組み込んでおり、感染、症状又は状態を引き起こす又は感染、症状又は状態に寄与する生物を意味する。診断しようとする疾患因子によって引き起こされる又はこれに関連する感染、症状又は状態を本明細書では「疾患状態」と称する。本明細書において使用する、「疾患因子」は、診断しようとする疾患状態を引き起こす又は疾患状態に寄与する病原因子を意味する。１つの実施態様では、診断しようとする疾患因子及び／又は疾患状態は、医療提供者又は他の人物によってあらかじめ決定される。１つの実施態様では、疾患因子は、ＮＩＡＩＤバイオテロ防衛策研究計画の中に述べられている潜在的生物脅威とみなされる生物などの、生物兵器プログラムに関与し得る。ここで述べるように、ＭＡＳは鑑別診断において使用することができる。鑑別診断を論じるとき、疾患因子及び１又はそれ以上の二次疾患因子に言及する。本明細書において使用する、「二次疾患因子」は、疾患因子によって引き起こされる疾患状態に類似した臨床症状を呈する病原因子を意味する。結果として、ＭＡＳを使用した鑑別診断は、疾患因子が存在する場合は疾患因子の存在、並びに存在する可能性のある何らかの二次疾患因子の存在を正確に判定することができる。

本開示において交換可能に使用される、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡ又はＤＮＡ（一本鎖、二本鎖、コード鎖、相補鎖又はアンチセンス鎖）、又は一本鎖又は二重鎖形態の２個以上のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を包含する（上記種の各々は詳細に規定し得るが）。「ヌクレオチド」という用語は、ここでは一本鎖又は二重鎖形態の何らかの長さのＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を表すための形容詞として使用される。より詳細には、「ヌクレオチド配列」の表現は核酸物質自体を包含し、したがって、特定ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち４個の塩基文字の中から選択される文字の連続）に限定されない。「ヌクレオチド」という用語はまた、ここでは、プリン又はピリミジン、リボース又はデオキシリボース糖成分及びリン酸基、又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合はホスホジエステル結合を含む、分子又はより大きな核酸分子中の個々の単位を意味する個別ヌクレオチド又はヌクレオチドの変化種を表す名詞としても使用される。「ヌクレオチド」という用語はまた、ここでは、（ａ）代替的連結基、（ｂ）プリンの類似体、（ｃ）ピリミジンの類似体又は（ｄ）類似糖などの、少なくとも１つの修飾を含む「修飾ヌクレオチド」を包含するために使用される。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、エクスビボ生成又はこれらの組合せを含む何らかの公知の方法によって、並びに当技術分野において公知の何らかの精製方法を用いて作製し得る。

ここで述べるＭＡＳは、様々な疾患状態を引き起こす又は疾患状態に寄与する疾患因子を検出することができる。ＭＡＳは、特定疾患因子が存在するかどうかを判定するため及び二次疾患因子が存在するかどうかを判定するために使用することができる。しかし、ＭＡＳは必ずしも鑑別診断適用において使用する必要はない。ＭＡＳはまた、疾患状態に関連する遺伝子変異の存在又は不在、一塩基多型（ＳＮＰｓ）の存在又は不在を診断するため、遺伝子発現のプロフィールを判定するため、及び遺伝子量変異を判定するためにも使用できる。ＭＡＳのこれらの代替的使用の適用は、同時係属中の米国特許出願第１０／２８４，６５６号に述べられている。ＭＡＳの他の使用は当業者に認識される。

ここで述べるＭＡＳは、３つの工程：ｉ）核酸の単離；ｉｉ）標的配列を含む疾患因子又は二次疾患因子からの核酸配列を増幅するための多重増幅；及びｉｉｉ）工程（ｉｉ）で増幅した標的配列の多重検出、を含み得る。ここで述べるＭＡＳの実施態様では、ＲＮＡ（プラス及びマイナス鎖の両方）とＤＮＡの両方の同時単離を提供する。疾患因子及び二次因子は異なる核酸ゲノムを有し得るので、ＲＮＡとＤＮＡの同時単離は好都合である。ＤＮＡとＲＮＡの二元的増幅を伴わずに、多数の試料を試験する必要がある。代替的実施態様では、疾患因子と二次疾患因子が各々同じ型の核酸ゲノムを有する場合、核酸単離工程は１つの型の核酸だけを単離し得る。ＭＡＳは高度に適応性であり、新しい病原因子及び公知及び新規因子の突然変異体が公知になったとき、多重増幅工程で使用するプライマー配列の適切な設計を通してこれらを包含することが可能である。以下でより詳細に論じるように、１つの実施態様では、ＭＡＳにおいて使用する多重増幅戦略は、現在使用可能な方法に比べて、様々なプライマー対の間の不適合性を低減させるため及び多重増幅反応の感受性と特異性を高めるために特有のこれまで評価されていない方法を利用する。ＭＡＳ手順全体がわずか３時間で完了できる。

ＭＡＳを、この適用が理解できるように一般的に説明する。ＭＡＳ法は、疾患因子を保有することが疑われる個体から得た試料から疾患因子の存在を判定すること、従って、この疾患因子によって引き起こされる又はこの疾患因子が寄与する疾患状態を有する個体を特定し、診断するために使用できる。ＭＡＳは、疾患因子と１又はそれ以上の二次疾患因子に関わる鑑別診断において使用し得る。ＭＡＳはいかなる疾患因子の存在を判定するためにも使用できるが、ＳＡＲＳが疾患因子であり、及び呼吸器合胞体ウイルスＡ型及びＢ型、ＨＰＩＶ１型及び３型、インフルエンザＡ型及びＢ型ウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス４型及び２１型、Ｃ．ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びＭ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が二次疾患因子である場合の鑑別診断を説明する一例を提供する。しかし、ＭＡＳは、多重増幅の適切な設計を通していかなる疾患因子及び二次疾患因子の存在を判定するためにも使用できる。

ＭＡＳの様々な成分を以下で詳細に説明する。これらの成分に関していくつかの実施態様を述べるが、同じ目的を達成するための当技術分野で公知の他の方法も本発明の開示の範囲内とみなされるべきであることは認識されねばならない。加えて、ＭＡＳの様々な実施態様は、ＭＡＳの目的、疾患状態の性質、及び疾患因子と１又はそれ以上の二次疾患因子の性質に依存して、以下で述べる工程を実施する様々な方法を使用し得る。

（核酸の単離）
ＭＡＳの１つの実施態様では、１つの反応においてＲＮＡとＤＮＡの両方を単離する核酸単離工程を使用する。代替的実施態様では、ＲＮＡとＤＮＡを独立して単離し、この後ＭＡＳにおける使用のために一緒にし得る。さらにもう１つの代替的実施態様では、１つの型の核酸だけを単離する必要がある場合は（対象とする全ての疾患因子の二次疾患因子が同じ型の核酸ゲノムを有するときなど）、ＲＮＡ又はＤＮＡだけを単離する核酸単離法を使用し得る。ＲＮＡとＤＮＡの同時単離及び各々の別個の単離のための様々な手法及びプロトコールが当技術分野において公知であり、このような手法及びプロトコールが使用できる。ここで述べる核酸単離は、様々な患者試料又はソースからの核酸を単離するために使用し得る。患者試料／ソースの種類は、鼻腔／咽頭綿棒、唾液、痰、血清、全血及び便を含むが、これらに限定されない。

上記核酸単離法は、以下の必要条件の１又はそれ以上を満たし得る。第一に、核酸単離法は、患者試料中に存在する可能性のある疾患因子及び二次疾患因子を不活性化し得る。結果として、検査及び医療担当者の危険度を低下させる。さらに、ＭＡＳの残りの工程は、所望する場合は厳格な生物封じ込め手順のための必要条件なしで実施することができる。加えて、この方法は、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ阻害因子及び単離核酸からの他の望ましくない化合物の除去を可能にし得る。

１つの実施態様では、患者試料からのＲＮＡ及びＤＮＡの初期単離のためにトリゾールベースの試薬を用いる、二元的ＲＮＡ／ＤＮＡ単離法を使用する。患者試料と接触したとき、トリゾール中のフェノール及び高塩試薬は、患者試料中に存在する可能性のある疾患因子又は二次疾患因子を有効に不活性化する。単一工程で同じ段階でのＲＮＡとＤＮＡの二元的単離を可能にするために、トリゾール溶液のｐＨを中性（酸性ではなく）の方に調整し得る。ＲＮＡとＤＮＡを患者試料から単離した後、シリカベースのカラムを使用してＲＮＡとＤＮＡをさらに単離し得る。シリカベースのカラムの使用は、汚染の可能性を最小限に抑えながら、洗浄工程を迅速で効率的に実施することを可能にする。洗浄工程は、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ阻害因子を除去するために使用し得る。核酸精製のためのカラム法は、様々な種類の患者試料に関して使用でき、遠心と洗浄の工程がＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ阻害因子を有効に除去するので、好都合である。

１つの実施態様では、Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ−Ｔｅｋによって提供される二元的ＲＮＡ／ＤＮＡ単離キットを製造者の指示に従って使用して核酸単離を実施する。簡単に述べると、被験者の試料２５０μｌを核酸単離試薬（トリゾール試薬）１ｍｌに加え、ついでクロロホルム２５０μｌを加える。この混合物を、ボルテックスなどによって十分に混合する。試料を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して、水相と有機相を分離する。上部水相を慎重に新たな１．５ｍｌ遠心分離管に移す。等容量の７０％エタノールを加え、ボルテックスなどによって試料を混合する。試料を、収集管に取り付けたＨｉＢｉｎｄ遠心カラムに適用し、１０，０００×ｇで１５秒間遠心分離する。流動物を廃棄する。洗浄緩衝液Ｉ ５００μｌをカラムに加え、カラムを１５秒間遠心分離する。カラムを洗浄緩衝液ＩＩ ５００μｌで各々１５秒間ずつ２回洗う。ＲＮアーゼ不含水５０μｌを加えてＲＮＡ／ＤＮＡを溶出し、最大速度で１分間遠心分離する。核酸試料は、この後、以下で述べる増幅工程のために使用し得る。

上述したトリゾール法に加えて、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを単離するための他の方法も使用し得る。代替的実施態様では、ＬＮＡ複合磁気ビーズを使用する。ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）は、その主要識別特徴がリボース環の２’−Ｏと４’−Ｃ原子の間のメチレン架橋の存在である、変化したヌクレオシドを含む核酸のクラスである。ＤＮＡとＲＮＡにおいて現われる５個の共通ヌクレオ塩基（Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｇ）を含むＬＮＡヌクレオシドは、ワトソン−クリック規則に従ってこれらの相補的ヌクレオシドと塩基対合することができる。正常なヌクレオシドとＬＮＡの分子の相違は、ＬＮＡ含有核酸と非ＬＮＡ含有核酸の間で形成される核酸二重鎖の安定性の差を生じさせる。典型的には、組み込まれた各々のＬＮＡヌクレオチドは、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ複合体と比較してＬＮＡ／ＤＮＡヌクレオチド複合体のＴ_ｍを２−６℃上昇させる。疾患因子及び二次疾患因子の核酸に結合することができる（特異的又は非特異的相互作用を通して）ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを、前記核酸を単離するために磁気ビーズに結合し得る。ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドは疾患因子又は二次疾患因子の核酸に結合する。次いで簡単な磁気分離と洗浄工程によって分離を達成し得る。この工程はまた、ＰＣＲ阻害因子の除去も可能にする。ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド／磁気ビーズ複合体は、多重増幅工程における使用のためにＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ試薬と直接混合することができる。ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド磁気ビーズを使用して、高容量の患者試料を効率的に処理することができる。ＬＮＡ法は、上述したトリアゾール二元抽出法又は当技術分野で公知の又はＤＮＡ及び／又はＲＮＡを分離するための本明細書において述べる他の何らかの方法と組み合わせて使用し得る。

（多重増幅）
様々な多重増幅戦略がＭＡＳに関して使用し得る。このような増幅戦略の多くが当技術分野において公知である。多重増幅戦略は、疾患因子及び二次疾患因子に含まれる核酸の種類に依存してＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ又はこれらの組合せを使用し得る。例えばＲＮＡゲノムが存在する場合は、ＲＴ−ＰＣＲを使用し得る。ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲの方法は当技術分野において周知である。１つの実施態様では、ＭＡＳにおいて使用する多重増幅戦略はユニークである。このユニーク多重増幅戦略は標的富化多重ＰＣＲ（Ｔｅｍ−ＰＣＲ）と称され、当技術分野において公知の他の多重増幅方法で必要とされるようなプライマーの組合せ及び増幅条件の広汎な経験的試験なしに、疾患因子及び／又は二次疾患因子からの１又はそれ以上の標的配列の効率的な増幅を可能にする。本明細書の中で使用する、「標的配列」は、増幅すべき及び最終的に検出すべき疾患因子又は二次疾患因子からのヌクレオチド配列である。標的配列は、ここで述べるプライマーセットによって増幅されるより大きな核酸配列内に含まれる。増幅のための各々の標的配列は、検出（以下で述べるような）時に、疾患因子又は二次疾患因子のいずれかが試料中に存在する場合、疾患因子又は二次疾患因子の特定を可能にする。増幅された標的配列の検出（直接又は間接的に−以下の記述参照）は、疾患因子又は二次疾患因子の存在及び同一性を指示し、これによって関連する疾患状態を診断する。１つの実施態様では、試験する各々の疾患因子又は各々の二次疾患因子から増幅のために単一標的配列を選択する。代替的実施態様では、２個以上の標的配列を各々の疾患因子又は各々の二次疾患因子からの増幅のために選択する。さらなる実施態様では、２個以上の標的配列を疾患因子からの増幅のために及び単一標的配列を各々の二次疾患因子からの増幅のために選択する。

Ｔｅｍ−ＰＣＲの原理を図１Ａ及び１Ｂに示す。図１Ａは、標的配列の増幅のための３つのプライマーオリゴヌクレオチド対の使用を示す。プライマーオリゴヌクレオチドは、Ｆ_ｏｕｔ（外側正プライマー）、Ｆ_ｉｎ（内側正プライマー）、Ｒ_ｏｕｔ（外側逆プライマー）、Ｒ_ｉｎ（内側逆プライマー）、ＦＳＰ（正スーパープライマー）及びＲＳＰ（逆スーパープライマー）として示している。図１に示す３つのプライマー対は、標的富化プライマーの２対（Ｆ_ｏｕｔとＲ_ｏｕｔ；及びＦ_ｉｎとＲ_ｉｎ）と標的増幅プライマーの１対（ＦＳＰ及びＲＳＰ）を含む。以下で論じるように、所望に応じて付加的な標的富化プライマー及び標的増幅プライマーを組み込み得る。この実施態様では、標的富化プライマー、Ｆ_ｏｕｔとＲ_ｏｕｔ及びＦ_ｉｎとＲ_ｉｎは、標的配列を含む核酸に特異的にハイブリダイズし、図１Ａに示すように標的配列を囲うように設計される。従って、標的富化プライマーの第一セット、Ｆ_ｏｕｔとＲ_ｏｕｔは、標的配列を含む核酸に結合し、標的核酸を囲う（Ｆ_ｏｕｔ及びＲ_ｏｕｔの１つは標的配列の５’側又は左側に位置し、他方は標的配列の３’側又は右側に位置する。）。標的富化プライマーの第二セット、Ｆ_ｉｎとＲ_ｉｎは、標的富化プライマーの第一セットについて述べたように標的配列を含む核酸に結合し、標的核酸を囲う。図１Ａに示すように、標的富化プライマーの第二セットは標的富化プライマーの第一セットの内側に結合する。この位置は、標的配列の近位と定義される。言い換えると、標的富化プライマーの第二セットは、標的富化プライマーの第二セットが第一セットの標的富化プライマーに比べて標的配列により近接して位置するように標的配列を含む核酸に結合する。

第一又は第二濃縮プライマー対の少なくとも１つにおける各々のプライマーは、この５’末端にスーパープライマー結合タグをさらに含む。スーパープライマー結合タグは、標的増幅プライマー（ＲＳＰ及びＦＳＰ）の配列と同一のオリゴヌクレオチド配列である。ＴｅｍＰＣＲ工程における増幅の間に、スーパープライマー結合タグを含むプライマー対はこの相補物にコピーされて、標的配列の対数増幅を可能にする標的増幅プライマー（ＲＳＰ及びＦＳＰ）の少なくとも１つの対のための結合部位を創造する。図１Ａに示す実施態様では、第二標的富化プライマー対はスーパープライマー結合タグを含み、Ｆ_ｉはＦＳＰの配列と同一のスーパープライマー結合タグを含み、Ｒ_ｉはＲＳＰの配列と同一のスーパープライマー結合タグを含む。外側プライマーは所望するスーパープライマーオリゴヌクレオチドタグを含むことができ、操作原理は上述したのと同じである。

標的富化プライマー及びこれらの核酸配列の間でのハイブリダイゼーションの特異性は、当技術分野で公知であるように、ハイブリダイゼーションの原因となるプライマー配列の長さを上昇させる又は低下させることによって調節できる。一般に、より短いプライマー配列は特異性を上昇させ、より長いプライマー配列はより大きいハイブリダイゼーション効率を提供する。さらに、ハイブリダイゼーションの原因となるプライマー配列の長さを上昇させる又は低下させることはまた、ＴｅｍＰＣＲ増幅工程の様々な段階でいずれのプライマーが活性であるかを判定し得る（以下の記述参照）。１つの実施態様では、標的富化プライマーの長さは１０−５０ヌクレオチドである。代替的実施態様では、標的富化プライマーの長さは１０−４０ヌクレオチドである。さらにもう１つの代替的実施態様では、標的富化プライマーの長さは１０−２０ヌクレオチドである。標的富化プライマーの各々のセット中のプライマーは、所望する場合は、異なる長さであり得る。例えば１つの実施態様では、標的富化プライマーＦ_ｏｕｔとＲ_ｏｕｔは１５−２５ヌクレオチドの長さであり、標的富化プライマーＦ_ｉｎとＲ_ｉｎは３５−４５ヌクレオチドの長さである（このような長さはスーパープライマー結合タグを含まない。）。

標的増幅プライマーの第一セット、図１Ａ及び１ＢにおけるＦＳＰ及びＲＳＰは、共通プライマー配列であり、標的富化工程の間に増幅された核酸（標的核酸を含む）のユニバーサル増幅のために使用される。１つの実施態様では、標的増幅プライマーの長さは１０−５０ヌクレオチドである。代替的実施態様では、標的増幅プライマーの長さは１０−４０ヌクレオチドである。さらにもう１つの代替的実施態様では、標的増幅プライマーの長さは１０−２０ヌクレオチドである。

標的富化プライマーは標的配列の濃縮（すなわち制限増幅）のために低濃度で使用され、一方標的増幅プライマーは標的配列の対数増幅のために高濃度で使用される。増幅及び検出のために便利ないかなる標的配列も選択できるので、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーの配列は標的配列の側面に位置する核酸配列の性質によってのみ指令される。従って、標的富化プライマーはこれらの組成物に関して最小限の制約で設計することができる。オリゴヌクレオチドタグを含まない少なくとも１セットの入れ子プライマー（図１ＡにおけるＦ_ｏｕｔ及びＲ_ｏｕｔのような）の使用は、初期逆転写反応の効率を上昇させ得る。多数のセットの標的富化プライマーは、入れ子プライマーが標的配列濃縮を与えるように共同して働くためのより多くの機会と組合せを可能にすることにより、アッセイの感受性と特異性を高め得る。加えて、標的富化プライマーは低濃度で存在し、標識されておらず、標的配列の対数増幅の責任を担わないので、標的富化プライマーの設計は、標的富化プライマーの様々な組合せに関する適合性について重大な問題を生じさせない。以下で論じるように、対数増幅によって実施される。Ｔｅｍ−ＰＣＲのこの側面は、付加的な疾患因子及び二次疾患因子を検出するためのアッセイの簡単で迅速な改変を可能にする。

図１Ａ及び１Ｂに示す実施態様は、標的配列を含む所与の核酸を増幅するための標的富化プライマーの１又は２セットの使用を示すが、所望する場合は標的富化プライマーの３セット以上も使用し得る。１つの実施態様では、標的富化プライマーの３−６セットをＴｅｍ−ＰＣＲ反応において使用する。さらなる実施態様では、標的富化プライマーの３−５セットを使用する。代替的実施態様では、標的富化プライマーの３−４セットを使用する。

標的増幅プライマーの２セット以上も使用し得る。標的増幅プライマーの２セット以上を使用するときは、標的増幅プライマーの多数のセットを、これらが対数増幅段階で互いに適合性であるように選択する。言い換えると、スーパープライマーの多数のセットは、増幅された標的核酸上のスーパープライマー結合タグに結合するとき同様のＴ_ｍを有し、同様の増幅効率を有する。１又はそれ以上の疾患因子又は二次疾患因子が異なる力価／濃度で存在するときは、多重標的増幅プライマーを使用し得る。力価に有意の差がある場合は、標的増幅プライマーの１セットだけを使用すると、高い力価の病原因子の選択的増幅が起こり得る。これは、低力価で存在する病原因子に関して偽陰性診断をもたらすことがある。標的増幅プライマーの多重セットを使用することによってこのような偏った増幅を回避し得る。１つの実施態様では、標的増幅プライマーの２−８セットを使用する。代替的実施態様では、標的増幅プライマーの２−６セットを使用する。さらにもう１つの代替的実施態様では、標的富化プライマーの２−４セットを使用する。

標的増幅プライマーは高濃度で使用する。標的増幅プライマーの配列は、標的増幅プライマーの１セットを使用する場合、増幅すべき各々の標的配列について同じであり、または標的増幅プライマーの多数のセットを使用する場合、増幅すべき各々の標的配列について類似の増幅特性を共有するように設計する。１つの実施態様では、標的増幅プライマーの両方が、増幅産物を検出する及び／又は操作する以下で述べるようなことを可能にする、検出のための手段を組み込んでいる。代替的実施態様では、２個の標的増幅プライマーの１個だけが検出のための手段を組み込んでいる。さらにもう１つの代替的実施態様では、標的増幅プライマーのＲＳＰだけが検出のための手段を組み込んでいる。本明細書の中で使用する、検出のための手段は、化学的エレメント、酵素エレメント、蛍光エレメント又は放射標識エレメントなどの、当技術分野で公知のいかなるエレメントでもあり得る。１つの実施態様では、検出のための手段は、Ｃｙ−３標識などの、但しこれに限定されない、蛍光エレメントであり得る。蛍光エレメントはスーパープライマー配列に直接結合し得るか又は間接的に結合し得る。間接結合の場合は、検出のための手段はビオチン分子（すなわち化学的エレメント）であり得、蛍光エレメントはアビジン又はストレプトアビジン分子に結合し得る。検出手段は以下で述べるように操作し得る。

Ｔｅｍ−ＰＣＲ法において使用する標的富化プライマーは、入れ子プライマー適用に関して当技術分野で一般的に知られるような２段階ＰＣＲ反応では使用されない。Ｔｅｍ−ＰＣＲでは、１段階ＰＣＲ反応において標的富化プライマーを使用する。標的富化プライマー低濃度で存在するので、標的富化プライマーは、標的増幅のためではなく標的富化のために働く。標的富化プライマーの濃度は標的配列の対数増幅のためには十分でない。標的富化プライマーはまた、局所鋳型構造を明らかにするのに役立ち、これ故増幅の感受性及び／又は効率を高める。センス標的配列の対数増幅はＦＳＰ及びＲＳＰを用いて達成される。

本明細書の中で使用する、標的富化プライマーの濃度を表すために用いるときの「低濃度」は、所与の標的配列の対数増幅には十分でないが、所与の標的配列の標的富化には十分であるプライマーの濃度を意味する。この低濃度は、増幅すべき標的配列を含む核酸のヌクレオチド配列に依存して異なり得る。１つの実施態様では、標的富化プライマーの濃度は０．００２μＭ−０．２μＭ未満の範囲内である。もう１つの実施態様では、標的富化プライマーの濃度は０．００２μＭ−０．１５μＭの範囲内である。代替的実施態様では、標的富化プライマーの濃度は０．００２μＭ−０．１μＭの範囲内である。さらにもう１つの代替的実施態様では、標的富化プライマーの濃度は０．００２μＭ−０．０５μＭの範囲内である。増幅すべき標的配列を含む核酸配列の性質が、対数増幅を伴わない標的富化のために規定した範囲より低い又は高い標的富化プライマー濃度を必要とする場合は、上述した範囲の外側の他の濃度範囲も使用し得る。様々な標的富化プライマーを異なる濃度（すなわち比率）で又は同じ濃度で使用し得る。

本明細書の中で使用する、標的増幅プライマー（ＦＳＰ及びＲＳＰ）の濃度を表すために用いるときの「高濃度」は、所与の標的配列の対数増幅のために十分であるプライマーの濃度を意味する。標的増幅プライマーの濃度は０．２μＭ−２．０μＭの範囲内である。もう１つの実施態様では、標的増幅プライマーの濃度は０．２μＭ−１．０μＭの範囲内である。代替的実施態様では、標的増幅プライマーの濃度は０．２μＭ−０．８μＭの範囲内である。さらにもう１つの代替的実施態様では、標的増幅プライマーの濃度は０．２μＭ−０．４μＭの範囲内である。増幅すべき標的配列を含む核酸配列の性質が、対数増幅のために規定した範囲より低い又は高い標的増幅プライマー濃度を必要とする場合は、上述した範囲の外側の他の濃度範囲も使用し得る。スーパープライマーは異なる濃度（すなわち比率）で又は同じ濃度で使用し得る。

原則として、所与の標的配列の対数増幅を達成するために、０．２μＭの範囲のプライマー濃度が一般にプライマー濃度についての出発点として使用される。標的富化プライマー及び標的増幅プライマーは、ここで論じるように互いに対して様々な比率で使用し得る。

標的富化プライマーの２セットを使用するときの増幅工程において（図１Ａ）、標的富化プライマーの２セットは４個の可能な増幅産物を生産し、これらの各々は標的配列：Ｆ_ｏｕｔ／Ｒ_ｏｕｔ；Ｆ_ｏｕｔ／Ｒ_ｉｎ；Ｆ_ｉｎ／Ｒ_ｏｕｔ；及びＦ_ｉｎ／Ｒ_ｉｎを含む。スーパープライマー結合タグは、図１ＡにおけるＦ_ｉｎ又はＲ_ｉｎプライマーのような、スーパープライマー結合タグを含む標的富化プライマーを用いて増幅される増幅産物に組み込まれる。しかし、スーパープライマー結合タグは標的増幅プライマーの配列と同一であるので、スーパープライマー結合タグは、この時点では標的増幅プライマーによる対数増幅のために有用でない。スーパープライマー結合部位を作製するためには、スーパープライマー結合タグを含む増幅産物を１回目の増幅とは反対の方向で２回目の増幅をしなければならない。多重増幅プロトコール（以下で述べる）は、増幅産物へのスーパープライマー結合タグの組込みを可能にする多段階手順を利用する。これらの段階を標的富化工程及び選択的増幅工程と称する。標的富化工程は、それ自体で又は選択的増幅工程と組み合わせて使用し得る。標的富化及び選択的増幅工程は、低濃度の標的富化プライマーが標的富化のためにこれらプライマーのハイブリダイゼーション標的にハイブリダイズするのに必要な条件を与えるように最適化される。これらの工程は、標的増幅プライマーによって実施される対数増幅手順のための基礎として役立つ十分な増幅産物を生産する。したがって、使用する低濃度において、標的富化プライマーは、スーパープライマー結合タグがその中に組み込まれた標的特異的配列を生産する。これらのスーパープライマー結合タグは、標的配列の対数増幅のために標的増幅プライマーが使用するためのスーパープライマー結合配列を生産する。生じた増幅された標的配列は、以下で述べるような標的特異的レポーターオリゴヌクレオチド（検出オリゴヌクレオチドとも称される。）を用いて検出することができる。

Ｔｅｍ−ＰＣＲ増幅手順の結果は、標的富化プライマーによる標的配列の特異的濃縮、及び続く、スーパープライマー結合タグを含む増幅産物をコピーすることによって提供されるスーパープライマー結合部位を利用した標的増幅プライマーによる標的配列の対数増幅である。標的配列の各々の対数増幅は、標的増幅プライマーの１又はそれ以上のセットによって実施されるので、増幅条件は、標的増幅プライマーだけを考慮して標準化し、最適化することができる。従って、現在当技術分野で公知の多重増幅法の場合のように、対数増幅反応条件の不適合性を懸念する必要はない。

Ｔｅｍ−ＰＣＲ増幅戦略は、標的増幅プライマーだけが高濃度で存在するので、低いバックグラウンドを生じる。結果として、プライマー二量体の形成及び関連する現象の発生が低下する。低いバックグラウンドに加えて、スーパープライマー（又はスーパープライマーの各々のセットの１個）だけが検出のための手段と結合するので、プライマー二量体形成が起こった場合でも、これはレポーターオリゴヌクレオチドによって検出されない。低いバックグラウンドは偽陽性診断の可能性を低下させる。

Ｔｅｍ−ＰＣＲ増幅法において使用する標的富化プライマー（Ｆ_ｏｕｔ、Ｆ_ｉｎ、Ｒ_ｏｕｔ及びＲ_ｉｎ）の比率は変化させ得る。異なる病原体ゲノムは異なる標的富化プライマー必要条件を有し得る。先に述べたように、一部の疾患因子及び二次疾患因子はＤＮＡゲノム又はＲＮＡゲノム（プラス又はマイナス鎖）を有し得る。加えて、特にスーパープライマーの１個だけを検出手段に結合させる場合は、標的増幅プライマーの濃度はやはり変化させ得る。標的富化プライマー又はスーパープライマーの少なくとも１個を１：１以外の比率で使用する場合の多重増幅を非対称多重増幅と称する。

様々な、標的富化プライマー及び標的増幅プライマー比率を使用して実施した実験において、一連のプライマー濃度でマイナス鎖ＲＮＡゲノム由来の標的配列の増幅上昇が起こると判定された。１つの実施態様では、Ｆ_ｏｕｔの濃度が残りの標的富化プライマーの濃度よりも１．０−８倍高かった。比率の一例は、Ｆ_ｏｕｔ：Ｆ_ｉｎ：Ｒ_ｏｕｔ：Ｒ_ｉｎについて４：１：１：１である。マイナス鎖ＲＮＡウイルスに関しては、ゲノムマイナス鎖ＲＮＡに相補的なプラスＲＮＡ鎖の初期増幅を与えるためにＦ_ｏｕｔの量を残りの入れ子プライマーの比率より高くし得る。１つの実施態様では、標的増幅プライマーの濃度がＦ_ｏｕｔの濃度より約１．２５−３２倍高いとき増幅上昇が認められた。比率の一例は、Ｆ_ｏｕｔ：Ｆ_ｉｎ：Ｒ_ｏｕｔ：Ｒ_ｉｎ：ＦＳＰ：ＲＳＰについてそれぞれ４：１：１：１：１０：４０である。個々の標的増幅プライマーの比率は、互いに対しても変化させ得る。この非対称変化は、検出工程で高い感受性を提供することが示された（表４参照）。１つの実施態様では、検出手段を組み込んだスーパープライマーをこの他のスーパープライマーより高い濃度で加える。１つの実施態様では、ＲＳＰが検出のための手段を含み、より高い濃度で添加される。ＲＳＰの濃度がＦＳＰの濃度より１．２５−１６倍高いとき標的配列の増幅上昇が認められた。比率の一例は、ＦＳＰ：ＲＳＰについてそれぞれ１０：４０である。

プラス鎖ＲＮＡゲノムを有する疾患因子及び二次疾患因子からの標的配列の増幅のために、付加的なプライマー比率を使用し得る。１つの実施態様では、Ｒ_ｏｕｔの濃度が残りの入れ子プライマーの濃度よりも１．０−８倍高かった。比率の一例は、Ｆ_ｏｕｔ：Ｆ_ｉｎ：Ｒ_ｏｕｔ：Ｒ_ｉｎについて１：１：４：１である。プラス鎖ＲＮＡウイルスに関しては、標的配列を含むＲＮＡ鎖の増幅上昇を与えるためにＲ_ｏｕｔの量を残りの標的富化プライマーの比率より高くし得る。１つの実施態様では、標的増幅プライマーの濃度がＲ_ｏｕｔの濃度より約１．２５−３２倍高いとき増幅上昇が認められた。比率の一例は、Ｆ_ｏｕｔ：Ｆ_ｉｎ：Ｒ_ｏｕｔ：Ｒ_ｉｎ：ＦＳＰ：ＲＳＰについてそれぞれ１：１：４：１：１０：４０である。個々の標的増幅プライマーの比率は、互いに対しても変化させ得る。この非対称変化は、検出工程で高い感受性を提供することが示された（表４参照）。１つの実施態様では、検出手段を組み込んだスーパープライマーをこの他のスーパープライマーより高い濃度で加える。１つの実施態様では、ＲＳＰが検出のための手段を含み、より高い濃度で添加される。ＲＳＰの濃度がＦＳＰの濃度より１．２５−１６倍高いとき標的配列の増幅上昇が認められた。比率の一例は、ＦＳＰ：ＲＳＰについてそれぞれ１０：４０である。

ＤＮＡゲノムを有する疾患因子及び二次疾患因子からの標的配列の増幅のために、付加的なプライマー比率を使用し得る。１つの実施態様では、標的富化プライマーの濃度は基本的に等しい。代替的実施態様では、Ｆ_ｏｕｔ又はＲ_ｏｕｔの１つの濃度が残りの入れ子プライマーの濃度よりも１．０−４倍高かった。比率の一例は、Ｆ_ｏｕｔ：Ｆ_ｉｎ：Ｒ_ｏｕｔ：Ｒ_ｉｎについて１：１：１：１である。１つの実施態様では、標的増幅プライマーの濃度がＲ_ｏｕｔの濃度より約１．２５−１２８倍高いとき増幅上昇が認められた。比率の一例は、Ｆ_ｏｕｔ：Ｆ_ｉｎ：Ｒ_ｏｕｔ：Ｒ_ｉｎ：ＦＳＰ：ＲＳＰについてそれぞれ１：１：１：１：１０：４０である。個々の標的増幅プライマーの比率は、互いに対しても変化させ得る。この非対称変化は、検出工程で高い感受性を提供することが示された（表４参照）。１つの実施態様では、検出手段を組み込んだスーパープライマーをこの他のスーパープライマーより高い濃度で加える。１つの実施態様では、ＲＳＰが検出のための手段を含み、より高い濃度で添加される。ＲＳＰの濃度がＦＳＰの濃度より１．２５−１６倍高いとき標的配列の増幅上昇が認められた。比率の一例は、ＦＳＰ：ＲＳＰについてそれぞれ１０：４０である。

標的富化プライマーの１対だけを使用する実施態様では、プライマーを上述した種々の比率（上述した標的増幅プライマー比率を含む）で、標的富化プライマーの一対中の対応するプライマーについての比率として働くＦ_ｏｕｔ又はＲ_ｏｕｔプライマーの比率でもって、使用できる。標的富化プライマーの濃度は基本的に等しい。

かわるがわるの説明に縛られることはないが、標的富化プライマーの濃度を上昇させたとき、標的配列は、検出のための手段なしで増幅され、ＦＳＰ及び／又はＲＳＰによって増幅される検出手段を含む標的配列によりレポーターオリゴヌクレオチドへの結合を完了させることができる。標的増幅プライマーを使用した非対称増幅はまた、検出手段を含むスーパープライマーをより高い濃度で使用するとき、標的配列を含むより多くの増幅産物及び検出手段が生産され、検出のために使用可能となるので、増幅の効率と感受性を上昇させ得る。表１は、Ｆ_ｏｕｔ、Ｆ_ｉｎ、Ｒ_ｏｕｔ及びＲ_ｉｎ並びにＦＳＰ及びＲＳＰの濃度についての１セットの例示的な比率を示す。

上述したように、標的増幅プライマーは各々の標的配列の対数増幅のために使用する。標的増幅プライマーの配列は、これらがいかなる公知のＧｅｎＢａｎｋ配列とも明らかな相同性を共有しないように選択する。加えて、標的増幅プライマーの配列は、効率的な増幅反応を与えるために増幅産物内のスーパープライマー結合部位への結合に関して比肩し得るＴｍを共有するように選択する。最後に、標的増幅プライマーの配列は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関するプライミング能力が、増幅すべき各々の標的配列に特異的な標的富化プライマーを上回るように選択し得る。

多重増幅は当技術分野で公知の標準手順に従って実施する。１つの実施態様では、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲを増幅工程として使用する。ＰＣＲ酵素は、Ｔａｑポリメラーゼなどの、逆転写とポリメラーゼ機能の両方を有する酵素であり得る。さらに、ＰＣＲ酵素は、当技術分野で公知のように「ホットスタート」反応用であり得る。ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲのための条件は当技術分野において公知である。しかし、出願人は、ＴｅｍＰＣＲ法で使用するために設計された最適化セットのＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ条件を作製した。的確な時間と温度は、当業者には公知のように、以下で述べる目的を達成するように変化させ得る。１つの実施態様では、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲ条件は以下の通りである。以下の方法は、標的富化機能を提供する第一増幅反応のための第一増幅条件及び標的増幅機能を含む第二増幅反応のセットを含む。増幅のための試薬を含む試料を、以下のようにプログラムしたサーモサイクラーに入れた：（ｉ）逆転写−５０℃、３０分間；（ｉｉ）初期ＰＣＲ活性化−９５℃、１５分間；（ｉｉｉ）１回目の３段階サイクリング（標的富化）を含む第一増幅反応−９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間；少なくとも２回の完全なサイクル、好ましくは１０−１５回の完全なサイクル；（ｉｖ）２回目の３段階サイクリング（標的増幅）を含む第二増幅反応−９２−９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７０−７２℃における１５−３０秒間；少なくとも２回の完全なサイクル、好ましくは１０−４０回の完全なサイクル；及び（ｖ）最終延長−７２℃における３分間。

工程（ｉ）は、疾患因子及び／又は二次疾患因子の核酸がＤＮＡではない場合に逆転写反応が起こることを可能にする。工程（ｉｉ）は、ＰＣＲ酵素機能を活性化させる。この手法は、より低い温度（５０℃）ではＰＣＲ酵素機能は逆転写反応を実施することのみ適格であるが、高温ではＰＣＲ酵素機能がポリメラーゼ機能を果たすことができる、「ホットスタート」ＰＣＲとして知られている。ポリメラーゼ機能の阻害を解除するためにＰＣＲ酵素機能のインキュベーションが必要である。工程（ｉｉｉ）の第一増幅は、標的富化プライマーがこれらの標的にハイブリダイズして、標的富化工程をプライムするように設計する。明白であるように、標的富化プライマーがこれらの標的にハイブリダイズするための付加的な時間が必要である（工程（ｉｖ）の５０−５５℃、１５秒間と比較して５０−５５℃で２．５分間）。標的富化プライマーはより低温で使用するので、より長い時間を用いる。工程（ｉｖ）の標的増幅反応は、標的増幅プライマーを使用する（より高濃度で）対数増幅相である。標的増幅プライマーは高濃度で存在するので、標的増幅プライマーと標的の間で長いハイブリダイゼーション時間は必要としない。工程（ｖ）は、完全な二本鎖増幅産物を生産するための最終延長工程である。工程（ｖ）は随意であり、必ずしも含める必要はない。

代替的実施態様では、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲ条件は以下の通りである。増幅のための試薬を含む反応チューブを、以下のようにプログラムしたサーモサイクラーに入れた：（ｉ）逆転写−５０℃、３０分間；（ｉｉ）初期ＰＣＲ活性化−９５℃、１５分間；（ｉｉｉ）１回目の３段階サイクリング（標的富化）−９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間）；少なくとも２回の完全なサイクル、好ましくは１０−１５回の完全なサイクル；及び２回目の２段階サイクリング（選択的増幅）−９２−９４℃における１５−３０秒間、７０−７２℃における１−２分間；少なくとも２回の完全なサイクル、好ましくは１０−４０回の完全なサイクル、を含む第一増幅反応；（ｉｖ）３回目の３段階サイクリング（標的増幅）を含む第二増幅反応−９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間；少なくとも２回の完全なサイクル、好ましくは１０−４０回の完全なサイクル；及び（ｖ）最終延長−７２℃、３分間。

この実施態様において、様々な工程の目的は上述した通りである。しかし、第一増幅反応は、最終的にスーパープライマー結合部位を含む増幅産物を生じさせる、スーパープライマー結合タグを組み込んだ増幅産物の生産を上昇させるために加えられた付加的な３段階サイクリング工程を含む。付加される３段階サイクリング工程では、ハイブリダイゼーション温度を７０−７２℃に上昇させる（工程（ｉｉｉ）の５０−５５℃に比較して）。ハイブリダイゼーション時間も、低濃度の標的富化プライマーがこれらの標的にハイブリダイズする機会を与えるために上述したように上昇させる。この高いハイブリダイゼーション温度は、一定の長さの標的富化プライマーだけがこれらの標的にハイブリダイズするのに十分なだけ安定であることを許容する。この実施態様では、Ｆ_ｏｕｔ及びＲ_ｏｕｔプライマーは２０ヌクレオチド以下の長さを持つように選択され、一方Ｆ_ｉｎ及びＲ_ｉｎプライマー（この実施態様ではスーパープライマー結合タグを含む）は少なくとも３０−４０ヌクレオチドの長さである。従って、Ｆ_ｏｕｔ及びＲ_ｏｕｔプライマーは７０−７２℃で熱安定ではなく、これらが標的にハイブリダイズしないことを意味する。しかし、Ｆ_ｉｎ及びＲ_ｉｎプライマーがより長いことは、これらのプライマーが７０−７２℃で熱安定であり、標的にハイブリダイズすることを確実にする。この選択的増幅工程では、Ｆ_ｉｎ及びＲ_ｉｎプライマーは、増幅によって創造された増幅産物の初期セット中の相補的配列に、これらの長さ全体（４０ヌクレオチド）に沿って、Ｆ_ｉｎ及びＲ_ｉｎプライマーを組み込んだ初期増幅産物の反対方向にハイブリダイズする。標的富化工程において、Ｆ_ｉｎ及びＲ_ｉｎプライマーは、工程（ｖ）において対数増幅の量を上昇させる、スーパープライマー結合タグを含む高い量の増幅産物を生産する。従って、工程（ｉｖ）は、スーパープライマー結合タグを含む増幅産物を生産する方向に偏った選択的増幅工程である。この選択的増幅は、より高いＧＣ含量を構築する必要なしに又は熱安定性を高めるための修飾ヌクレオチドを使用する必要なしに実施される。次に、工程（ｉｖ）の増幅産物を上述した対数増幅に供する。

（多重検出）
豊富な標的配列多重増幅法が、感受性の高い特異的な多重検出のための基礎を提供する。ＭＡＳにおいて使用する多重検出法は、多重増幅を補って、増幅した標的配列の検出においてバランスのとれた感受性と特異性を与える。感受性と特異性は診断試験又は鑑別診断試験の成功にとって重要な問題である。

ＭＡＳにおける使用のための多重検出法は、直接検出又は間接多重検出法であり得る。標的配列の性質は、直接又は間接検出のいずれを使用するかを部分的に決定する。例えば標的配列が互いに広汎な相同性を共有しない場合は、必要とされる感受性及び特異性は、レポーターオリゴヌクレオチドを標的配列に直接ハイブリダイズさせることによって入手し得る。例えば疾患因子に関する診断試験又は疾患因子と少なくとも１つの二次疾患因子に関する鑑別診断試験において、多重増幅は、直接検出を使用できるように、疾患因子及び二次疾患因子から増幅される標的配列の各々が広汎な相同性を共有しないように設計し得る。しかし、増幅される標的配列が互いに広汎な相同性を共有する場合は、必要な感受性と特異性が得られるように、相同な配列の間に付加的な識別を与えるための追加工程を多重検出工程に組み込み得る。例えば個体の対立遺伝子内の１又はそれ以上の一塩基多型の存在を判定するための診断試験において、直接ハイブリダイゼーションは、１個のヌクレオチドだけが異なる標的配列を特異的に検出するために必要な対立遺伝子識別を提供することができないと考えられる。この場合は、付加的な識別力を与えるために間接検出法を使用し得る。

図２は、直接検出法の１つの実施態様を示す。多重増幅反応からの標的配列（６）を含む増幅された核酸（１）を検出のために提供する（増幅工程はここで述べるＴｅｍ−ＰＣＲ工程であり得る）。既知の標的配列（６）に特異的なハイブリダイゼーションドメイン（３）を含むレポーターオリゴヌクレオチド（２）を与え、第一シグナル生成のための手段（４）に結合させる。第一シグナル生成のための手段は、検出可能な第一シグナルを生産することができる。第一シグナル生成のための手段（４）は、検出工程で用いる技術プラットフォームに依存して異なり得る。例えばＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームを検出工程における技術プラットフォームとして使用する場合は、第一シグナル生成のための手段（４）は、図２に示すような内的にカラーコード化された、スペクトルで指定可能なミクロスフェアであり得る。以下で述べる直接検出法の変法は、同時係属中の米国特許出願第１０／２８４，６５６号に述べられており、このような変法の実施は当業者には明白である。

レポーターオリゴヌクレオチド（２）は、上述した多重増幅工程によって与えられた特異的標的配列（６）に特異的にハイブリダイズするように設計される。レポーターオリゴヌクレオチド（２）と標的配列（６）の間のハイブリダイゼーションの特異性は、レポーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションドメイン（３）の長さを上昇させる又は低下させることによって調節できる。一般に、より短いハイブリダイゼーションドメイン（３）は高い特異性を与え、標的配列（６）とハイブリダイゼーションドメイン（３）の間のミスマッチとしての識別は、ハイブリダイゼーション効率に有意の影響を及ぼす。より長いハイブリダイゼーションドメイン（３）は低い特異性を与えるが、より大きなハイブリダイゼーション効率、従ってより高い感受性を提供する。標的配列（６）の性質はハイブリダイゼーションドメイン（３）の構成に影響を及ぼす。当業者は、標的配列（６）へのハイブリダイゼーションドメイン（３）の結合の所望特異性及び感受性を達成するようにハイブリダイゼーションドメイン（３）のパラメータを変化させることができる。１つの実施態様では、ハイブリダイゼーションドメイン（３）は１０−５０ｂｐの長さである。代替的実施態様では、ハイブリダイゼーションドメイン（３）は２０−４０ｂｐの長さである。さらにもう１つの代替的実施態様では、ハイブリダイゼーションドメイン（３）は１５−２５ｂｐの長さである。

ハイブリダイゼーションドメイン（３）を介して既知の標的配列（６）に特異的にハイブリダイズする各々のレポーターオリゴヌクレオチド（２）は、第一シグナル生成のための公知の手段（４）（カラーコード化ビーズなど）を伴っている。従って、第一シグナル生成のための手段（４）の同一性を判定することにより、標的配列（６）の同一性を判定することができ、したがって疾患因子又は二次疾患因子の個体同一性を判定することができる。

標的配列（６）を含む増幅された核酸（１）は、所望する場合は、多重検出工程の前又は検出工程の間に変性し得る。変性は必ずしも必要ではない。非対称増幅条件（４０：１０比率のような、ＦＳＰより高い濃度で存在するＦＳＰなど）を使用するＴｅｍＰＣＲ増幅反応は、変性が必要工程ではない検出反応のために十分な一本鎖増幅産物を生産する。変性は、この工程及び本開示の中で言及する他の工程において、十分な温度に加熱することによって又は化学的手段（５Ｎ ＮａＯＨのような作用物質の添加など、但しこれらに限定されない）によって起こり得る。以下の実施態様に関して、標的配列（６）を含む増幅された核酸（１）の変性は使用しなかった。しかし、以下の工程で具体化される原理は、変性工程を加えた場合も異ならない。

レポーターオリゴヌクレオチド（２）を、適切なハイブリダイゼーション緩衝液（１×ＴＭＡＣ又は１×ＴＥ）中の変性され増幅された核酸（１）に加える。レポーターオリゴヌクレオチド（２）の添加は変性の前又は後のいずれでもよい（使用する場合は）。レポーターオリゴヌクレオチド（２）は、ハイブリダイゼーションドメイン（３）を通して増幅された核酸（１）上の標的配列に結合し、核酸−レポーターオリゴヌクレオチド複合体（Ｉ）を形成する。５２℃で１５分間のインキュベーションなどの、当技術分野で公知のハイブリダイゼーション条件を使用し得る。ハイブリダイゼーションが完了した後、遠心分離などによって複合体Ｉを単離し、非結合レポーターオリゴヌクレオチド（２’）及び非結合増幅された核酸（１’）を除去する。次に複合体Ｉを、適切な検出プラットフォームを使用した検出に供し得る。１つの実施態様では、第一シグナル生成のための手段（４）は、内的にカラーコード化されたスペクトルで指定可能なビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）であり、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを検出のために使用する。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームは、第一シグナル生成のための手段（４）を刺激して検出可能な第一シグナルを生じさせる。第一シグナルは記録され、解析される。第一シグナル生成のための手段（４）及び生成された第一シグナルを使用して、レポーターオリゴヌクレオチド（２）が結合した標的配列（６）の同一性を判定する。ひとたび標的配列（６）が特定されれば、検出された疾患因子又は二次疾患因子の個体同一性がわかる。

しかし、増幅された核酸（１）は、ＦＳＰ又はＲＳＰの少なくとも１個によって提供された検出のための手段（８）を含み得る。この検出手段（８）は上述した通りであり得、直接又は間接的に増幅された核酸（１）に結合し得る。図２において、標的増幅プライマーの一つによって提供されたビオチン分子を検出のための手段（８）が示される。検出手段（８）は、検出可能な第二シグナルを生産することができる第二シグナル生成のための手段（１０）を組み込むために使用し得る。１つの実施態様では、第二シグナル生成のための手段（１０）は、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射性標識などの検出可能な標識に結合したストレプトアビジン分子であり得る。適切な蛍光標識は、ＰＥ又はＣｙ−３を含むが、これらに限定されない。１つの実施態様では、第二シグナル生成のための手段（１０）はストレプトアビジン−ＰＥ複合体である。代替的実施態様では、第二シグナル生成のための手段（１０）は、検出手段の成分として増幅された核酸産物に直接結合し得る。第二シグナル生成のための手段（１０）を核酸−レポーターオリゴヌクレオチド複合体に添加し、インキュベートして、複合体（ＩＩ）を形成するように結合させる。１つの実施態様では、インキュベーションは５２℃で５分間であるが、当技術分野で公知のように他の時間及び温度も使用し得る。

次に、適切なプラットフォームを使用して複合体（ＩＩ）を分析し得る。１つの実施態様では、第一シグナル生成のための手段（４）は、内的にカラーコード化されたスペクトルで指定可能なビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）であり、第二シグナル生成のための手段（１０）は蛍光ＰＥ標識である。この実施態様では、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを検出のために使用する。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームは、第一（４）及び第二（１０）シグナル生成のための手段を刺激して、それぞれ検出可能な第一及び第二シグナルを生じさせる。第一及び第二シグナル生成手段は、第一及び第二シグナルが各々他方の存在下で検出できるように選択する。第一及び第二シグナルを記録し、解釈する。第一シグナル生成のための手段及び生成された第一シグナルを使用して、レポーターオリゴヌクレオチド（２）によって結合された標的配列（６）の同一性を判定する。第二シグナル生成のための手段（１０）及び第二シグナルを使用して、レポーターオリゴヌクレオチド（２）と組み合わせて標的配列（６）の存在を確認する（遊離レポーターオリゴヌクレオチド（２）からのシグナル生成を防ぐため）。ひとたび標的配列（６ａ）が特定されれば、検出された疾患因子又は二次疾患因子の個体同一性がわかる。しかし、複合体Ｉは上述したように検出に供し得ることに留意すべきである。

さらなる技術プラットフォームも同様に直接検出工程において使用し得る。代替的実施態様では、レポーターオリゴヌクレオチド上の第一シグナル生成手段は、検出及び分析のための適切な装置内に置いたとき検出可能な物理的第一シグナルを生産し得る。物理的シグナルは、色の変化、励起時の所与の波長の光の放出又は伝導率などの電気的性質の変化、又は電磁的又は化学的性質の変化であり得る。他の物理的シグナルも使用し得る。１つの実施態様では、第一シグナル生成のための手段は、固体支持体上の位置のように、空間的な性質であり得る。例えばレポーターオリゴヌクレオチドは、チップ又は他の固体支持体などの収集手段上の公知の位置で空間的に分割され得る。従って、第一シグナルは空間的性質である。標的配列を含む増幅産物がレポーターオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするとき、この結合は、増幅された核酸上の第二シグナル生成手段によって生成される第二シグナルの存在によって判定し得る。第二シグナル空間的位置（第一シグナル）を検出することにより、標的配列及び疾患因子／二次疾患因子の同一性を判定する。代替的実施態様では、レポーターオリゴヌクレオチドを、１つは空間的であり、１つは非空間的である２つの第一シグナルが生成されるように付加的な第一シグナル生成手段に結合し得る。従って、第二シグナル生成手段によって生成される第二シグナルは、レポーターオリゴヌクレオチドへの標的核酸の結合を指示する。代替的実施態様では、レポーターオリゴヌクレオチドへの標的配列の結合は、レポーターオリゴヌクレオチドの性質の検出可能な変化（伝導率などの電気的性質の変化を含むがこれに限定されない）を生じさせ得る。この性質の変化が、次に、第二シグナルとして働く。

間接検出プロトコールの１つの実施態様では、ＲＯＣＡＳＨ（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｏｌｉｇｏ Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ Ａｆｔｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、特異的ハイブリダイゼーション後のレポーターオリゴ捕獲）と称する新規方法を使用する。ＲＯＣＡＳＨ法は、全部がここで述べられているかのごとくに参照によりここに組み込まれる、同時係属中の米国特許出願第１０／２８４，６５６号に述べられている。明瞭さのために、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｘ−Ｍａｐテクノロジーを用いたＲＯＣＡＳＨ法の１つの実施態様を述べる。間接検出の他の方法も、当技術分野で公知のように使用し得る。ＲＯＣＡＳＨ法の変法は、同時係属中の米国特許出願第１０／２８４，６５６号に述べられているように包含され得ることが了解される。先行技術の方法と異なり、ＲＯＣＡＳＨ法においては、レポーターオリゴヌクレオチドと標的配列の間のハイブリダイゼーションの特異性及び標的配列の検出の感受性は、ＲＯＣＡＳＨ法の異なる段階でハイブリダイズするレポーターオリゴヌクレオチドの異なる核酸配列によって提供される。従って、これらの重要工程のための条件は、検出段階で高い特異性と感受性を与えるように互いに独立して最適化し得る。

Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｘ−Ｍａｐテクノロジー及び関連テクノロジーは、当技術分野及び米国特許第６，５２４，４７３号、同第６，５１４，２９５号、同第６，４４９，５６２号、同第６，４１１，９０４号、同第６，３６６，３５４号、同第６，２６８，２２２号、同第６，１３９，８００号、同第６，０５７，１０７号、同第６，０４６，８０７号及び同第５，７３６，３３０号に述べられている。ｘＭＡＰテクノロジーは、標的捕獲試薬（以下で定義するように、ｃＲＴと称する）に共有結合した、内的にカラーコード化された複数のミクロスフェアを使用する。このような捕獲試薬はオリゴヌクレオチドであり得るが（以下で述べるｃＲＴの場合のように）、領域タグと特異的に相互作用するように設計されたポリペプチド又は化学成分であってもよい。選択的捕獲試薬を使用するとき、レポーターオリゴヌクレオチド上の領域タグは、相補的結合パートナーを与えるように変化させ得る。内的カラーコード化は、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームによって励起されたとき各々のセットのビーズについてユニークなシグナルを生産する。

ＲＯＣＡＳＨ法は、２つの主要成分：（ｉ）レポーターオリゴヌクレオチド；及び（ｉｉ）収集のための手段、を含むと考えられる。レポーターオリゴヌクレオチドは、上記多重増幅工程によって与えられる標的配列に特異的に結合するように設計される。レポーターオリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズするように設計された可変的長さのハイブリダイゼーションドメイン（特異性及び感受性へのハイブリダイゼーションドメインの長さの作用に関する上記記述参照）、収集のための手段へのハイブリダイゼーションのための領域タグと称される核酸配列、及び第一シグナル生成のための手段を含む。１つの実施態様では、レポーターオリゴヌクレオチド上の領域タグは各々のハイブリダイゼーションドメインについてユニークである。言い換えると、標的配列「Ａ」に結合するハイブリダイゼーションドメインを有するレポーターオリゴヌクレオチドと標的配列「Ｂ」に結合するハイブリダイゼーションドメインを有するレポーターオリゴヌクレオチドは、異なる領域タグを有する。収集のための手段は、この実施態様ではｃＲＴ（相補的領域タグ）と称する、複数の捕獲試薬及び第二シグナル生成のための手段を含む。ｃＲＴは、レポーターオリゴヌクレオチド内に含まれる領域タグに相補的な核酸配列である。第一及び第二シグナル生成のための手段は、検出プラットフォームにおいて使用するテクノロジーの性質に依存して異なり得る。Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｘ−Ｍａｐテクノロジーを使用するとき、第一シグナル生成のための手段は、ＰＥ又はＣｙ−３などの蛍光タグであり得、第二シグナル生成のための手段は、内的にカラーコード化された、空間的に指定可能なミクロスフェアであり得る。レポーターオリゴヌクレオチドの領域タグと収集のための手段のｃＲＴの相互作用を通して、各々のレポーターオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションドメインによって公知の標的配列に特異的である。）は、第二シグナル生成のための公知の手段（カラーコード化されたＬｕｍｉｎｅｘビーズなど）と結合する。従って、第二シグナル生成のための手段の同一性を判定することにより、標的配列の同一性を判定することができ、これは疾患因子又は二次疾患因子の特定を可能にする。従って、特異性は、レポーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションドメインと標的配列の間のハイブリダイゼーションによって達成され（特異性はハイブリダイゼーションドメインの長さを低下させる又は上昇させることによって変化させ得ることに留意しなければならない）、感受性は、レポーターオリゴヌクレオチドの領域タグと収集のための手段のｃＲＴの間のハイブリダイゼーションによって決定される。増幅された核酸配列と相互作用するように設計された、以下で述べるように未使用の増幅された標的核酸の除去を助ける精製のための手段も使用し得る。

ＲＯＣＡＳＨ手順の１つの実施態様を図３に示す。多重増幅反応からの標的配列（６ａ）を含む増幅された核酸（１ａ）を検出のために提供する（増幅工程はここで述べるＴｅｍ−ＰＣＲ工程であり得る）。標的配列（６ａ）を含む増幅された核酸（１ａ）は、所望する場合は変性し得る。変性工程は、しかしながら、選択的である。図３は、変性工程後の増幅された核酸（１ａ）を示す。上述したように、増幅された核酸の逆鎖は、ＦＳＰ又はＲＳＰの少なくとも１個によって与えられる検出のための手段（８ａ）を含む。この検出のための手段（８ａ）は、ＦＳＰ及び／又はＲＳＰ又は上述したような当技術分野で公知の他のこのような手段に結合したビオチン分子であり得る。精製のための手段（９ａ）は、検出のための手段（８ａ）と相互作用するように選択される。１つの実施態様では、精製のための手段（９ａ）はストレプトアビジンに結合した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ２７０磁気ビーズなど）であり、検出のための手段（８ａ）はビオチン標識である。精製のための手段（９ａ）を、これが検出手段（８ａ）に結合して核酸−精製手段複合体（複合体Ｉ）を形成するように、増幅された核酸（１ａ）に添加する。複合体Ｉを洗って非結合核酸及び残存成分を除去し、当技術分野で公知であり、精製のための手段に比肩し得る分離手法を用いて単離する。精製のための手段が磁気ビーズである場合は、磁気分離手法を使用し得る。ハイブリダイゼーションの準備のために１×ＴＭＡＣ又は１×ＴＥなどのハイブリダイゼーション緩衝液を複合体Ｉに添加する。

次にレポーターオリゴヌクレオチド（２ａ）を複合体Ｉに添加する。レポーターオリゴヌクレオチドは事前工程で添加し得るが、所望する場合は、増幅された核酸の変性の前又は後に添加してもよい。レポーターオリゴヌクレオチド（２ａ）はハイブリダイゼーションドメイン（３ａ）を通して標的配列に結合し、精製手段−核酸−レポーターオリゴヌクレオチド複合体（複合体ＩＩ）を形成する。レポーターオリゴヌクレオチド（２ａ）はまた、領域タグ（１２ａ）及び第一シグナル生成のための手段（４ａ）も含む。ハイブリダイゼーションは、５２℃で１５分間のインキュベーションなどによって、当技術分野で公知のように起こり得る。結合後、複合体ＩＩを洗浄し（温かい１×ＳＳＣ中などで）、上述したような適切な分離手法を用いて単離する。非結合レポーターオリゴヌクレオチドの除去後、複合体（ＩＩ）を変性条件に供して、標的配列（６ａ）からレポーターオリゴヌクレオチド（２ａ）を放出させる。核酸−精製手段複合体を、上述したような適切な分離手法によって除去する。

収集のための手段（２０ａ）を、溶液中の残存するレポーターオリゴヌクレオチド（２ａ）と混合する。収集のための手段は、ｃＲＴ（２２ａ）及び第二シグナル生成のための手段（１０ａ）を含む。収集のための手段（２０ａ）のｃＲＴ（２２ａ）は、レポーターオリゴヌクレオチドの領域タグ（１２ａ）と相互作用して、収集手段−レポーターオリゴヌクレオチド複合体（複合体ＩＩＩ）を形成する。ｃＲＴ（２２ａ）及び領域タグ（１２ａ）は、各々のｃＲＴ／領域タグの相補的対が互いに対する結合に関して類似のＴ_ｍを有するように選択される。従って、各々の領域タグ（１２ａ）の、この相補的ｃＲＴ（２２ａ）へのハイブリダイゼーション条件は普遍的である。１セットのハイブリダイゼーション条件を使用するので、これは、特に多重検出環境において、検出の感受性上昇を可能にする。上述したようなハイブリダイゼーション条件並びに当技術分野で公知の他のハイブリダイゼーション条件を使用し得る。この後複合体（ＩＩＩ）を単離し、適切な検出プラットフォームを使用して分析する。

１つの実施態様では、第一シグナル生成のための手段（４ａ）は蛍光ＰＥ標識であり、第二シグナル生成のための手段（１０ａ）は内的にカラーコード化されたスペクトルで指定可能なビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）である。この実施態様では、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを検出のために使用する。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームは、第一（４ａ）及び第二（１０ａ）シグナル生成のための手段を刺激して、それぞれ検出可能な第一及び第二シグナルを生じさせる。第一及び第二シグナルを記録し、解釈する。第一及び第二シグナル生成手段は、第一及び第二シグナルが各々他方の存在下で検出できるように選択する。第一シグナル生成のための手段及び生成された第一シグナルを使用して、レポーターオリゴヌクレオチド（２ａ）によって結合された標的配列（６ａ）の同一性を判定する。第一シグナル生成のための手段（１０ａ）及び第二シグナルを使用して、標的配列（６ａ）の存在を間接的に確認する（遊離収集手段（１０ａ）からのシグナル生成を防ぐため）。ひとたび標的配列（６ａ）が特定されれば、疾患因子又は二次疾患因子の個体同一性が検出される。

（ＭＡＳの実施態様を使用した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の診断）
以下は、ＳＡＲＳ（これらの実施例ではＳＡＲＳ−ＣｏＶ）に関する鑑別診断アッセイを提供するための本開示の教示を利用したＭＡＳのいくつかの例である。この実施例では、ＳＡＲＳが疾患因子であり、二次疾患因子は以下の１又はそれ以上を含む：呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ａ型及びＢ型、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）１型及び３型、インフルエンザ（ＩＮＦ）Ａ型及びＢ型、アデノウイルス（ＡＤＶ）、Ｃ．ニューモニエ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びＭ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロウイルス（ＥＮＴ）、及びコクサッキーウイルスＡ型（ＣＶＡ）、コクサッキーウイルスＢ型（ＣＶＢ）、ライノウイルス（ＲｈＶ）及びエコーウイルスなどのエンテロウイルス型。上述したように、これらの実施例は単に例示として提供するものであり、他の疾患因子及び二次疾患因子からの他の標的配列も増幅し、検出し得るので、本発明の開示をここで開示されている鑑別診断に限定することを意図しない。

表２及び３は、疾患因子及び二次疾患因子からの標的配列、並びにレポーターオリゴヌクレオチド（Ｄｅと称する）の核酸配列を増幅するためにＴｅｍＰＣＲ法において使用する標的富化プライマー（Ｆ_ｏｕｔ、Ｆ_ｉｎ、Ｒ_ｏｕｔ及びＲ_ｉｎについてそれぞれＦ_Ｏ、Ｆ_Ｉ、Ｒ_Ｏ、及びＲ_Ｉと称し、このような用語はここで定義されている。）の配列を列挙する。表２及び３において、Ｆ_ｉ及びＲ_ｉプライマーはスーパープライマー結合タグを含んだ。表２はまた、疾患因子及び二次疾患因子の核酸配列並びに前記プライマー及びレポーターオリゴヌクレオチドによって結合される核酸の領域についてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を示す。標的増幅プライマー（ＦＳＰ及びＲＳＰ）の配列を表２及び３の下部に示す。

これらの実施例では、ＳＡＲＳウイルスゲノムからの３つの標的配列を増幅し、検出した。ＳＡＲＳウイルスは高い突然変異率を有することが知られている。プライマー結合部位又は検出ハイブリダイゼーション部位で突然変異が起こる場合、偽陰性結果が導入され得る。ＳＡＲＳ病原体から３個の標的を検出することは、検出感受性を高め、偽陰性結果を低下させる。二次疾患因子については、それぞれの核酸の各々から１つの領域の核酸を増幅し、検出した。表２に列挙する標的富化プライマーは、ある場合には、病原体の多数の株を検出するために使用し得る。例えばインフルエンザＡ型を増幅するために使用する標的富化プライマーは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ６、Ｈ５Ｎ１及びＨ９Ｎ２を含むがこれらに限定されない、様々な株の検出と鑑別（適切な検出オリゴヌクレオチドを使用して）のために十分な標的配列を含む増幅された核酸を生産する。インフルエンザＢ型を増幅するために使用する標的富化プライマーは、Ｌｅｅ４０、Ｍｅｍｐｈｉｓ９７、Ｓａｙａ９９及びＴａｉｗａｎ９９を含むがこれらに限定されない、様々な株の検出と鑑別（適切な検出オリゴヌクレオチドを使用して）のために十分な標的配列を含む増幅された核酸を生産する。アデノウイルスを増幅するために使用するプライマーは、アデノウイルス株３、４、７、１４及び２１の検出と鑑別（適切な検出オリゴヌクレオチドを使用して）のために十分な標的配列を含む増幅された核酸を生産する。上記の場合の各々では、個々の株を特定するために検出工程において各々の株に特異的な検出オリゴヌクレオチドを使用することができる。ＲＳＰは、ビオチンなどの検出のための手段で標識する（上述したように他の標識分子も使用し得る）。

表３に列挙する標的富化プライマーはまた、ある場合には、病原体の多数の株を検出するために使用し得る。表４は、表３に示す標的富化プライマーによって様々な病原体から増幅される遺伝子を示す。非構造遺伝子（ＮＳ）をインフルエンザＡ型ウイルスからの増幅として選択した。４個の標的富化プライマーの設計のため、及びＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ４、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ５、Ｎ１１Ｎ１、Ｎ１１Ｎ８及びＨ１１Ｎ９（現在蔓延している鳥インフルエンザＡ型株、Ｈ５Ｎ１を含む）を含むがこれらに限定されない様々な株の検出と鑑別（適切な検出オリゴヌクレオチドを使用して）のために十分な標的配列を含む増幅された核酸を生産するために、保存された領域を選択した。非構造遺伝子はまた、インフルエンザＢ型ウイルスの増幅と検出のための標的としても選択した。少なくとも５１の公知の血清型のアデノウイルスが存在する。ヘキソン遺伝子内の保存された領域を、一連の標的富化プライマーの設計のため及び血清型３、４、７、１４及び２１を含むがこれらに限定されない様々な株（呼吸器感染に一般的に関連する血清型を含む。）の検出と鑑別（適切な検出オリゴヌクレオチドを使用して）のために十分な標的配列を含む増幅された核酸を生産するために選択した。検出オリゴヌクレオチドＡＤＶ３−３Ｄｅは株３、７及び２１を検出し、ＡＤＶ４−３Ｄｅは株４を検出し、ＡＤＶｌ４−３Ｄｅは株１４を検出する。様々なエンテロウイルス種及びファミリー成員の５’ＵＴＲ領域からの保存された配列を増幅のために選択した。エンテロウイルス及びライノウイルスは、ピコルナウイルス科ファミリーの成員である。エンテロウイルスはまた、コクサッキーウイルス及びエコーウイルスなどの種々の属を含む。これらのウイルスは全て呼吸器感染に結びつく。エンテロウイルスクラスの様々な成員の検出のために、Ｔｓ、ｌａ、ｌｂ、２、９、１４、１５、１６、３９、４９、５０、８５及び８９を含むがこれらに限定されないライノウイルス；Ａ２１及びＡ２４を含むがこれらに限定されないコクサッキーウイルスＡ型；Ｂ４及びＢ５を含むがこれらに限定されないコクサッキーウイルスＢ型；１１、２０及び２５を含むがこれらに限定されないエコーウイルスの様々な株の検出と鑑別（適切な検出オリゴヌクレオチドを使用して）のために十分な標的配列を含む増幅された核酸を生産する、一連の標的富化プライマーを設計した。検出オリゴヌクレオチドＲｈｖ２はライノウイルスの検出に特異的であり、検出オリゴヌクレオチドＣＶＥ２はコクサッキーウイルスＡ型及びＢ型及びエコーウイルスを検出する。

ヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子（Ｎ遺伝子）からの保存された配列を、パラインフルエンザ１型及び３型ウイルスからの増幅のために選択した。非構造遺伝子配列をＲＳウイルスＡ型及びＢ型についての標的として選択した。バックグラウンド増幅及び偽陽性検出を低下させるために、ｒＲＮＡ遺伝子は、列挙した細菌種からの増幅のために選択しなかった。この代わりに、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのシタトヘシン（ｃｙｔａｄｈｅｓｉｎ）Ｐ１遺伝子及びクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのウリジンキナーゼ遺伝子を増幅のために選択した。ＲＳＰは、ビオチンなどの検出のための手段で標識する（上述したように他の標識分子も使用し得る。）。

本検出方法において使用するプライマー配列は、上記で詳述したように変化させ得る。加えて、他の病原因子も、この病原因子に特異的なプライマーを設計することにより、開示する方法における検出のために包含し得る。このような変更は、ＳＡＲＳ様疾患状態を引き起こす新しい病原因子が発見される場合又は付加的なＳＡＲＳ変異体が単離される場合に望ましいであろう。

この実施例では、各々の疾患因子及び二次疾患因子からの核酸配列をここで述べるように入手し、単離した。各因子からの核酸をここで述べるＴｅｍ−ＰＣＲ法によって増幅した。各々の病原因子についての核酸を別々の反応チューブに入れ、表２に記載するプライマーの完全混合物をＲＴ−ＰＣＲのための試薬と共に添加した。各病原因子について表５に記載する３つのプライマー比率の各々に関して別々の反応を実施した。ＲＴ−ＰＣＲのための当技術分野で公知のいかなる手順も使用し得るが、この実施例では以下の手順を用いた。５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合物（各々のｄＮＴＰ４００μＭを含有する）、表５に記載する比率での表２に示すプライマーの完全混合物及びＲＴ−ＰＣＲ酵素製剤を含有するマスターＲＴ−ＰＣＲ混合物を調製した。所望する場合は、ＲＮアーゼ阻害因子も５−１０単位／反応濃度で添加し得る。増幅のために十分な各々の疾患因子及び二次疾患因子からの標的配列を含む核酸配列又はその部分を、ＲＴ−ＰＣＲマスター混合物を含む個別反応チューブに加えた。１つの反応チューブに核酸鋳型の代わりにＲＮアーゼ不含水を添加することによってＲＴ−ＰＣＲブランクを作製した。反応チューブを、以下のようにプログラムしたサーモサイクラーに入れた：（ｉ）逆転写−５０℃、３０分間；（ｉｉ）初期ＰＣＲ活性化−９５℃、１５分間；（ｉｉｉ）１回目の３段階サイクリング（標的富化）を含む第一増幅反応−９４℃における１分間、５５℃における２．５分間及び７２℃における１分間の１０回の完全なサイクル；（ｉｖ）２回目の３段階サイクリング（標的増幅）−９４℃における３０秒間、５５℃における１５秒間及び７２℃における１５秒間の４０回の完全なサイクル；及び（ｖ）最終延長−７２℃、３分間。

増幅産物のアリコートを、上述した、図２に示す直接検出法を用いた検出に供した。この実施例では、検出すべき各々の病原因子において増幅された標的配列に特異的な検出オリゴヌクレオチド（表２に列挙する）をＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェアに結合させた。増幅産物のアリコートを、別々のチューブにおいて、１×ＴＥ、ハイブリダイゼーション緩衝液及び検出可能なシグナルを生産するのに十分な量の各検出オリゴヌクレオチドを含有する反応混合物に添加した。この実施例では、表２の各病原因子に関する検出オリゴヌクレオチドが、増幅された核酸産物を含む各々の反応に存在した。検出オリゴヌクレオチド陰性対照に関しては、増幅産物の代わりに１×ＴＥを添加した。検出オリゴヌクレオチドと標的配列間のハイブリダイゼーションのために試料を直ちに５２℃で１５分間保持した。試料を遠心分離して、非結合検出オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチドが結合しなかった核酸を除去した。次に試料を、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを用いる検出に供した。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームは、検出オリゴヌクレオチドに結合したミクロスフェア（第一シグナル生成手段）を刺激して検出可能なシグナルを生産した。この実施例では、検出のための第二手段を含めなかったが、上述したように第二シグナルを組み込んでもよい。

結果を表３に示す。列は、初期増幅反応においてその核酸が使用された疾患因子又は二次疾患因子の同一性及び増幅工程で使用したプライマーの比率を示す。行は、検出工程で使用した検出オリゴヌクレオチドを示す。例えば第５列（ＲＳＶＢ４：１：１：１：８：１６と示されている）は、ＲＳウイルスＢ型の核酸を増幅反応において使用し、入れ子プライマー及びスーパープライマーを４：１：１：１：８：１６の比率で使用したことを示す。第２列（ＲＳＶＢと示されている）は、ＲＳウイルスＢ型標的配列に特異的な検出オリゴヌクレオチドを検出工程において使用したことを示す。第１行（Ｌｕｍブランクと示されている）は、増幅産物を含まない検出オリゴヌクレオチド陰性対照を示す。第３−５列（それぞれブランク４：１：８：１６、ブランク４：１：８：２４及びブランク４：１：８：３２）は、特定核酸配列を含まないが、各々の特定標的配列の増幅のためのプライマーを指示されている比率で含む増幅陰性対照を示す。

表４からわかるように、所与の疾患因子又は二次疾患因子に特異的な検出オリゴヌクレオチドは、多数の増幅標的配列の存在下で疾患因子又は二次疾患因子からの核酸に特異的に結合した。この結果は、標的富化プライマーが、標的配列に特異的でない多数のプライマーセットの存在下で正確な標的核酸配列を増幅したこと及び標的増幅プライマー（ＦＳＰ及びＲＳＰ）が既述の標的配列を増幅するために正しく機能し、適切な検出オリゴヌクレオチドは検出しようとする標的配列にハイブリダイズできることを示す。検出オリゴヌクレオチド陰性対照および増幅陰性対照はバックグランド読取りを提供し、試験した全ての試料において過度のバックグランドシグナルを示さなかった。

一例として、ＲＳＶＢに特異的な検出オリゴヌクレオチドは、ＲＳＶＢに由来する標的配列だけに特異的に結合し、他の病原因子には結合しなかった。加えて、ＲＳＰの濃度が上昇すると共に検出のレベルも上昇し、非対称増幅が検出工程の感受性を上昇させ得ることを示した。さらに、アデノウイルスの場合、表４は、標的富化プライマー及び標的増幅プライマーが正しいアデノウイルス標的配列を増幅したこと及び特異的検出オリゴヌクレオチドはアデノウイルス株を識別できることを示す。

この実施例において、各々の疾患因子及び二次疾患因子からの核酸配列をここで述べるように得て、単離した。各因子からの核酸をここで述べるＴｅｍ−ＰＣＲ法によって増幅した。各々の因子についての核酸を別々の反応チューブに入れ、表３に記載するプライマーの完全混合物をＲＴ−ＰＣＲのための試薬と共に添加した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、上記実施例１で述べた通りであった。この実施例で使用したプライマー比率は１：１：１：１：１０：４０（Ｆ_ｏｕｔ：Ｆ_ｉｎ：Ｒ_ｉｎ：Ｒ_ｏｕｔ：ＦＳＰ：ＲＳＰ）であった。

標的配列を含む増幅産物の検出は、実施例１で述べたＬｕｍｉｎｅｘビーズを使用する直接検出法について説明したように実施した。表３に列挙する各々の因子についての検出オリゴヌクレオチドを各々の検出反応に添加した。

表６は、表３に開示する標的富化及び標的増幅プライマーを使用したこの実験の結果を示す。列は、初期増幅反応においてこの核酸を使用した疾患因子又は二次疾患因子の同一性及び増幅工程で使用したプライマーの比率を示す。行は、検出工程で使用した検出オリゴヌクレオチドを示す。この実施例において、試料番号１は標的富化プライマー及び標的増幅プライマーの混合物を含むＲＴ−ＰＣＲブランクであり、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズに連結された検出オリゴヌクレオチドは鋳型を含まないＲＴ−ＰＣＲにハイブリダイゼされた。陽性反応についてのカットオフ値を決定するためにバックグラウンドシグナルを使用する。ＴｅｍＰＣＲを用いるＭＡＳなどの多重システムにおいては、各々のビーズセットは、実のところ、それ自身のミクロ系である。最終シグナルは、バックグラウンドと同様、捕獲オリゴヌクレオチドをビーズセット上に連結するカップリング反応の効率、多重ＴｅｍＰＣＲ反応における標的増幅の効率、及び検出の間のハイブリダイゼーションの効率を含む多くの因子によって影響される。結果として、各病原体（各々のビーズセットによって表わされる。）についてのカットオフ値を個別に決定しなければならない。このバックグラウンドシグナル（ＲＴ−ＰＣＲブランクと標的因子を含まないことがわかっている試料から得た値を平均することによって決定される。）を決定し、標準偏差を得た。この標準偏差に５を乗じて、この値を平均バックグラウンドに加算した。平均バックグラウンドより高い値を、特定病原因子の存在を示す陽性結果とみなす。

試料２−４は、それぞれアデノウイルス亜型４、７及び２１であった。試料５−１１は、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＣＰＮ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＭＰＮ）、インフルエンザＡ型（ＩＮＦＡ）、インフルエンザＢ型（ＩＮＦＢ）、パラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ−１）、パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ−３）、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であった。試料１２はＳＡＲＳ−ＣｏＶであった。検出感受性を高め、標的の突然変異によって引き起こされる偽陽性検出を最小限に抑えるために、我々はＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムから３つの異なる標的配列を増幅と検出のために選択した。試料１３−１６は、コクサッキーウイルスＡ型（ＣＶＡ）、コクサッキーウイルスＢ型（ＣＶＢ）、ライノウイルス（ＲｈＶ）及びエコーウイルス（ＥＶ）を含む種々のエンテロウイルスであった。アデノウイルス及びエンテロウイルス種の検出のために、アデノウイルス及びエンテロウイルス種に関する各々の特異的検出ヌクレオチドを検出工程に添加した。

表６からわかるように、本開示のＴｅｍＰＣＲ法は標的配列の特異的増幅を提供し、標的配列は対応する検出オリゴヌクレオチドによって特異的に検出された。高い検出特異性は、各々のビーズセットから得られた高いシグナル対バックグラウンド比によって明らかであった。この結果は、標的富化プライマーが、標的配列に特異的でない多数のプライマーセットの存在下で正しい標的核酸配列を増幅したこと及び標的増幅プライマー（ＦＳＰ及びＲＳＰ）がここで述べたように標的配列を増幅するために正しく機能し、適切な検出オリゴヌクレオチドは検出しようとする標的配列にハイブリダイズできることを示す。

上記実施例１及び２においては、核酸試料一つだけを各々の反応に加えた（但し多数の病原因子に特異的な標的富化プライマーの存在下で）。表７は、多数の病原体からの核酸試料を、多重増幅及び続く検出のために単一試料中に含めたときのＴｅｍＰＣＲ増幅法の特異性を示す。この実施例では、表３に列挙する各々の生物についての標的富化プライマーを、標的増幅プライマー及び表示されている病原体からの核酸と共に、各々の試料中に含めた。表７の列は、多重検出工程において検出された検出オリゴヌクレオチド（表３に列挙する全ての生物についての標的配列に特異的な検出オリゴヌクレオチドを各検出反応に含めたことに留意しなければならない。）を示し、一方表６の列は、各々の試料に添加した病原体核酸の同一性を示す。ＴｅｍＰＣＲ増幅条件及び多重検出は、上記実施例２で述べたように実施した。

試料１は、鋳型核酸をＲＴ−ＰＣＲに含めなかった陰性対照である。試料２は、３つの病原体、ＳＡＲＳ、ＣＰＮ及びＩＮＦＡを含んだ。試料３は、ＡＤＶ−７、ＲＳＶＢ及びＩＮＦＢを含んだ。試料４は、ＰＩＶ−３、ＣＰＮ及びＩＮＦＡを含んだ。試料５は、ＡＤＶ−２１、ＲＳＶＢ及びＩＮＦＢを含んだ。試料６は、ＲｈＶ及びＰＩＶ１を含んだ。試料７は、ＳＡＲＳ及びＩＮＦＢを含んだ。及び試料８は、ＡＤＶ−７及びＰＩＶ１を含んだ。この実施例では表６に示すカットオフ値を使用し、カットオフ値より高い値を表７で強調した。

結果は、ＴｅｍＰＣＲが各々の因子から正しい標的配列を正しく増幅したこと及び増幅された標的配列が、試料中に存在する病原因子の正確で特異的な読取りを提供するように検出できたことを示す。一例として、第２列では、ＳＡＲＳ、ＣＰＮ及びＩＮＦＡからの核酸を増幅反応に添加した。表３の全ての因子に特異的な標的富化プライマーの存在下で、開示したプライマーを用いたＴｅｍＰＣＲ法は、正しい標的配列を正しく増幅した。３つの病原因子の正しい多重増幅を得るためにＴｅｍＰＣＲ増幅条件の修正又は最適化は必要なかった。重要な点として、同じセットのＴｅｍＰＣＲ多重増幅条件は、標準化増幅プロトコールを使用した様々な病原因子の特異的検出を可能にした。ここで述べるＴｅｍＰＣＲ法は、高度に特異的であり、様々な組合せの特異的病原体を検出することができる。偽陽性又は偽陰性は認めなかった。

ＴｅｍＰＣＲの感受性を確認するために、血清試料１ｍｌを、表８に列挙する種々の量のウイルス又は細菌因子と共に作製した。各々の病原因子について、４つの濃度：１０^４ｐｆｕ／ｍｌ、１０^３ｐｆｕ／ｍｌ、１０^２ｐｆｕ／ｍｌ及び１０^１ｐｆｕ／ｍｌを調製した。アッセイの再現性を観測するために、４つの濃度の各々で、３つの試料を作製し、分析した。ＡＤＶ４及びＲｈＶなどの一部の試料は使用可能な高い力価の保存溶液を有しておらず、出発濃度は１０^３ｐｆｕ／ｍｌであった。ＳＡＲＳに関しては、ウイルス保存溶液が限られており、そのため、各々の濃度について２つの試料だけを（３つではなく）検査した。各病原体について、高濃度の陽性対照試料（血清中にスパイクしない）も含めた。

スパイクした試料血清各１ｍｌについて、核酸単離のために２００μｌを使用した。核酸単離は、ここで述べたようなトリアゾール法を用いて実施した。単離工程の終了時に、核酸をＲＮアーゼ不含水５０μｌに溶出した。この溶出から５μｌの容量を続くＴｅｍＰＣＲ反応における鋳型として使用した。従って、出発濃度が１０^４ｐｆｕ／ｍｌである場合、ＴｅｍＰＣＲ増幅反応は病原体ゲノムの約２００コピーだけを含んだ。同様に、１０^３ｐｆｕ／ｍｌレベルでは、２０コピーだけが反応系に含まれ、以下同様であった。ＴｅｍＰＣＲ増幅反応のための条件は実施例２において上述した通りであり、多重検出は、直接検出法を用いて実施例２で述べたように実施した。

表８は感受性試験の結果を示す。カットオフ値は各々の標的について個別に決定し、カットオフ値が平均プラス標準偏差の５倍になるように設定した。カットオフ値を上回る値を陽性とみなし、表８において強調した。一般に、アッセイは、血清試料中に存在する２０−２００コピーの病原体を検出することができた。この実施例で使用したＴｅｍＰＣＲ条件は、ここで述べた選択的増幅工程を組み込んでいなかったことに注目しなければならない。選択的増幅工程の使用は反応の感受性を有意に上昇させると期待される。

実施例５は、ＴｅｍＰＣＲ法の代替的実施態様を使用した実験の結果を示す。この実施例では、各々の疾患因子及び二次疾患因子からの核酸配列をここで述べるように得て、単離した。各因子からの核酸をＴｅｍ−ＰＣＲ法によって増幅した。この実施例では、ＴｅｍＰＣＲのための増幅反応条件を、標的富化工程と選択的増幅工程を含むように変更した。各々の因子についての核酸を別々の反応チューブに入れ、表３に記載するプライマーの完全混合物をＲＴ−ＰＣＲのための試薬と共に添加した。この実施例で使用したプライマー比率は１：１：１：１：１０：４０（Ｆ_ｏｕｔ：Ｆ_ｉｎ：Ｒ_ｉｎ：Ｒ_ｏｕｔ：ＦＳＰ：ＲＳＰ）であった。

増幅条件を以下に示す。反応チューブを、以下のようにプログラムしたサーモサイクラーに入れた：（ｉ）逆転写−５０℃、３０分間；（ｉｉ）初期ＰＣＲ活性化−９５℃、１５分間；（ｉｉｉ）１回目の３段階サイクリング（標的富化）−９４℃において０．５分間、５２℃において１分間及び７２℃において１分間の１５回の完全なサイクル、及び２回目の２段階サイクリング（選択的増幅）−９４℃において１５秒間において７０℃、１．５分間の６回の完全なサイクル、好ましくは４−８回の完全なサイクルを含む第一増幅反応；及び（ｉｖ）３回目の３段階サイクリング（標的増幅）を含む第二増幅反応−９４℃において１５−３０秒間、５０−５５℃において１５−３０秒間及び７２℃において１５−３０秒間の少なくとも２回の完全なサイクル、好ましくは１０−４０回の完全なサイクル；及び（ｖ）最終延長−７２℃、３分間。標的配列を含む増幅産物の検出は、実施例１で説明し、図２に示す、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを使用した直接検出法について述べたように実施した。表３に列挙する各々の因子についての検出オリゴヌクレオチドを各々の検出反応に添加した。

表９は、表３に開示する標的富化及び標的増幅プライマーを使用したこの実験の結果を示す。列は、初期増幅反応において核酸が使用された疾患因子又は二次疾患因子の個体同一性を示す。表９からわかるように、選択的増幅戦略を使用したＴｅｍＰＣＲ法は標的配列の特異的増幅を提供し、標的配列は対応する検出オリゴヌクレオチドによって特異的に検出された。高い検出特異性は、各々のビーズセットから得られた高いシグナル対バックグラウンド比によって明らかであった。この結果は、標的富化プライマーが、標的配列に特異的でない多数のプライマーセットの存在下で正しい標的核酸配列を増幅したこと及び標的増幅プライマー（ＦＳＰ及びＲＳＰ）がここで述べたように標的配列を増幅するために正しく機能し、適切な検出オリゴヌクレオチドは検出しようとする標的配列にハイブリダイズできることを示す。

本開示の１つの主題はまた、例示した全ての実施態様において開示方法を実施するために必要な成分を含むキットである。このキットは以下の１又はそれ以上を含み得る。すなわち、疾患因子を保有することが疑われる個体からの試料中の疾患因子及び二次疾患因子からの標的配列を増幅するための少なくとも１セットのプライマー、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ又は両方）の単離のための試薬、前記試料からの標的核酸の増幅（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ又は当技術分野において公知の他の手法による）のための試薬、捕獲試薬（１つの実施態様では、ｃＲＴ）に連結された又は連結されていないミクロスフェア、標的配列特異的検出オリゴヌクレオチド、陽性／陰性対照及び第一及び第二シグナルの生成のために必要な試薬。

ここで引用する全ての参考文献（論文、特許及びｕｒｌアドレスを含む。）は、許容される範囲で参照によりここに組み込まれる。ここで述べる参考文献は、本出願の出願日以前のこれらの開示に関してのみ提供される。ここに含まれるいかなる内容も、本発明者が先行開示によってこのような開示に先行している資格がないことを是認したと解釈されるべきではない。以下の特許請求の範囲は国外優先権のためにのみ添付される。

図１Ａ及び１Ｂは、Ｔｅｍ−ＰＣＲ増幅工程の２つの実施態様の説明図である。 図１Ａ及び１Ｂは、Ｔｅｍ−ＰＣＲ増幅工程の２つの実施態様の説明図である。 図２は、直接検出法の１つの実施態様の説明図である。 図３は、間接検出法の１つの実施態様の説明図である。

Claims (88)

1. 多重プライマーに基づく増幅のための方法であって、
   前記増幅を、標的富化プライマーの少なくとも第一対及び第二対並びに標的増幅プライマー（前記標的増幅プライマーはＦＳＰ及びＲＳＰを含む。）の少なくとも第一対を含む反応混合物中にて行うことを含み、並びに
   ａ．第一増幅反応［前記第一増幅反応は、
   ｉ）鋳型としての、少なくとも１つの病原因子からの核酸（前記核酸は前記病原因子からの少なくとも１つの標的配列を含む。）；
   ｉｉ）前記核酸にハイブリダイズし、前記少なくとも１つの標的配列を囲う前記標的富化プライマーの第一対；
   ｉｉｉ）前記核酸にハイブリダイズし、前記少なくとも１つの標的配列を囲う前記標的富化プライマーの第二対（前記標的富化プライマーの第二対は少なくとも１つの標的配列に近接して位置し、前記標的富化プライマーの第二対の各々は５’末端に標的増幅プライマーの１つの配列に対応するスーパープライマー結合タグを含む。）；及び
   ｉｖ）第一増幅反応が複数の第一増幅産物を生産するような、第一増幅反応のための増幅試薬と条件（前記第一増幅産物の少なくとも部分はスーパープライマー結合タグの少なくとも１つの相補物を含み、これにより少なくとも１つのスーパープライマー結合部位を形成する。）
   を使用する。］、及び
   ｂ．第二増幅反応［前記第二増幅反応は、
   ｉ）鋳型としての、前記少なくとも１つのスーパープライマー結合部位を含む第一増幅産物の前記部分；
   ｉｉ）第一増幅産物の前記部分上の前記スーパープライマー結合部位に結合する、前記標的増幅プライマーの第一対；及び
   ｉｉｉ）第二増幅反応が少なくとも１つの標的配列を含む複数の第二増幅産物を生産するような、第二増幅反応のための増幅試薬と条件
   を使用する。］
   を含む、前記方法。
2. 前記標的富化プライマーの第一対がＲ_ｏ及びＦ_ｏプライマーを含み、前記標的富化プライマーの第二対がＦ_ｉ及びＲ_ｉプライマーを含み、及び前記標的増幅プライマーの第一対がＦＳＰとＲＳＰを含む、請求項１に記載の方法。
3. Ｆ_ｉ上の前記スーパープライマー結合タグが、ＦＳＰが前記Ｆ_ｉプライマー上のスーパープライマー結合タグの相補物に結合するように、ＦＳＰの配列と同一であり、及びＲ_ｉ上の前記スーパープライマー結合タグが、ＲＳＰが前記Ｒ_ｉプライマー上のスーパープライマー結合タグの相補物に結合するように、ＲＳＰの配列と同一である、請求項２に記載の方法。
4. 標的富化プライマーの第一対の各々の長さが、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド及び１０−２０ヌクレオチドから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
5. 標的富化プライマーの第二対の各々の長さが、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド及び１０−２０ヌクレオチドから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
6. 標的富化プライマーの第一対の各々の長さが１０−２０ヌクレオチドであり、及び標的富化プライマーの第二対の各々の長さが３０−４０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
7. 標的増幅プライマーの第一対の各々の長さが１０−２０ヌクレオチドであり、及び標的富化プライマーの第二対の各々の長さが３０−４０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
8. 標的富化プライマーが低濃度で存在し、及び標的増幅プライマーが高濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
9. 前記低濃度が０．００２μＭ−０．２μＭの濃度であり、及び前記高濃度が０．２μＭ−１．０μＭの濃度である、請求項８に記載の方法。
10. 標的富化プライマーが標的配列の対数増幅には十分でない濃度で存在し、及び標的増幅プライマーが標的配列の対数増幅に十分な濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
11. 標的富化プライマーの各々が同じ濃度で使用する、請求項１に記載の方法。
12. 標的富化プライマーの少なくとも１つを他の標的富化プライマーより高い濃度で使用する、請求項１に記載の方法。
13. 標的増幅プライマーの各々が同じ濃度で使用される、請求項１に記載の方法。
14. 標的増幅プライマーの少なくとも１つが、他の標的増幅プライマーより高い濃度で使用される、請求項１に記載の方法。
15. より高濃度の前記標的増幅プライマーが検出のための手段を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記第一増幅反応についての条件が標的富化工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含み、及び前記第二増幅工程についての条件が標的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
17. 標的富化工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間を含み、及び標的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第一増幅反応についての条件が標的富化工程の少なくとも２回の完全なサイクル及び選択的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含み、及び前記第二増幅工程についての条件が標的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
19. 標的富化工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間を含み、選択的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における１５−３０秒間、７０−７２℃における１−２分間を含み、及び標的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記選択的増幅が、スーパープライマー結合部位を含む第一増幅産物の生産の方に偏る、請求項１９に記載の方法。
21. 標的富化プライマーの第一対の各々の長さが１０−２０ヌクレオチドであり、及び標的富化プライマーの第二対の各々の長さが３０−４０ヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
22. ３又はそれ以上の標的富化プライマー対をさらに含む、請求項１に記載の方法。
23. ２又はそれ以上の標的増幅プライマー対をさらに含む、請求項１に記載の方法。
24. 前記病原因子が、ウイルス及び細菌から成る群より選択される、請求項２４に記載の方法。
25. 前記病原因子が、アデノウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ３型及び呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、及び（コクサッキーウイルスＡ型、コクサッキーウイルスＢ型、ライノウイルス及びエコーウイルスを含む）エンテロウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項２４に記載の方法。
26. 前記病原因子が、マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種から成る群より選択される細菌である、請求項２４に記載の方法。
27. 前記病原因子が、標的富化プライマーの第一対及び第二対の適切な設計によって選択される、請求項２４に記載の方法。
28. 前記正又は逆スーパープライマーの少なくとも１つが、検出のための手段をさらに含む、請求項１に記載の方法。
29. 前記検出のための手段が、化学的エレメント、酵素エレメント、蛍光エレメント又は放射標識エレメントから成る群より選択される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記標的配列を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
31. 検出方法が直接検出方法である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記検出方法が、
    ａ．検出オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのセットを提供すること（検出オリゴヌクレオチドの各々のセットは、前記増幅産物内の特定標的配列に結合することができるヌクレオチド配列を有し、及びシグナル生成のための第一手段を含む。）；
    ｂ．前記検出オリゴヌクレオチドを、前記第二増幅産物と接触させ、インキュベートすること；
    ｃ．シグナル生成のための前記第一手段を刺激して、第一シグナルを生産すること；及び
    ｄ．前記第一シグナルを検出すること
    を含む、請求項３０に記載の方法。
33. 前記第一シグナルが前記病原因子にユニークであり、及び前記第一シグナルが前記病原因子を特定するために使用される、請求項３２に記載の方法。
34. 第一シグナル生成のための前記手段が、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射標識である、請求項３２に記載の方法。
35. 第一シグナル生成のための前記手段が蛍光ミクロスフェアである、請求項３２に記載の方法。
36. 前記方法が間接検出方法である、請求項３０に記載の方法。
37. 多重プライマーに基づく、少なくとも１つの標的配列の増幅のための方法であって、
    前記増幅を、標的富化プライマーの少なくとも第一対及び標的増幅プライマー（前記標的増幅プライマーはＦＳＰ及びＲＳＰを含む。）の少なくとも第一対を含む反応混合物中にて行うことを含み、並びに
    ａ．第一増幅反応［前記第一増幅反応は、
    ｉ）鋳型としての、少なくとも１つの標的配列を含む核酸；
    ｉｉ）前記核酸にハイブリダイズし、前記標的配列を囲う前記標的富化プライマーの第一対（前記標的富化プライマーの第一対の各々は５’末端に標的増幅プライマーの１つの配列に対応するスーパープライマー結合タグを含む。）；及び
    ｉｉｉ）第一増幅反応が複数の第一増幅産物を生産するような、第一増幅反応のための増幅試薬と条件（第一増幅産物の少なくとも部分はスーパープライマー結合タグの少なくとも１つの相補物を含み、これにより少なくとも１つのスーパープライマー結合部位を形成する。）；
    を使用する。］、及び
    ｂ．第二増幅反応［前記第二増幅反応は、
    ｉ）鋳型としての、前記少なくとも１つのスーパープライマー結合部位を含む第一増幅産物の前記部分；
    ｉｉ）第一増幅産物の前記部分上の前記スーパープライマー結合部位に結合する、前記標的増幅プライマーの第一対；及び
    ｉｉｉ）第二増幅反応が標的配列を含む複数の第二増幅産物を生産するような、第二増幅反応のための増幅試薬と条件；
    を使用する。］
    を含む、前記方法。
38. 前記標的富化プライマーの第一対がＦ_ｉ及びＲ_ｉプライマーを含み、及び前記標的増幅プライマーの第一対がＦＳＰとＲＳＰを含む、請求項３７に記載の方法。
39. Ｆ_ｉ上の前記スーパープライマー結合タグが、ＦＳＰが前記Ｆ_ｉプライマー上のスーパープライマー結合タグの相補物に結合するように、ＦＳＰの配列と同一であり、及びＲ_ｉ上のスーパープライマー結合タグが、ＲＳＰが前記Ｒ_ｉプライマー上のスーパープライマー結合タグの相補物に結合するように、ＲＳＰの配列と同一である、請求項３８に記載の方法。
40. 標的富化プライマーの第一対の各々の長さが、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド及び１０−２０ヌクレオチドから成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
41. 標的富化プライマーが低濃度で存在し、及び標的増幅プライマーが高濃度で存在する、請求項３７に記載の方法。
42. 前記低濃度が０．００２μＭ−０．２μＭの濃度であり、及び前記高濃度が０．２μＭ−１．０μＭの濃度である、請求項４１に記載の方法。
43. 標的富化プライマーが標的配列の対数増幅には十分でない濃度で存在し、及び標的増幅プライマーが標的配列の対数増幅に十分な濃度で存在する、請求項３７に記載の方法。
44. 標的富化プライマーの各々が同じ濃度で使用される、請求項３７に記載の方法。
45. 標的富化プライマーの少なくとも１つが他の標的富化プライマーより高い濃度で使用する、請求項３７に記載の方法。
46. 標的増幅プライマーの各々が同じ濃度で使用される、請求項３７に記載の方法。
47. 標的増幅プライマーの少なくとも１つが、他の標的増幅プライマーより高い濃度で使用される、請求項３７に記載の方法。
48. より高濃度の前記標的増幅プライマーが検出のための手段を含む、請求項４７に記載の方法。
49. 前記第一増幅反応についての条件が標的富化工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含み、及び前記第二増幅工程についての条件が標的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含む、請求項３７に記載の方法。
50. 標的富化工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間を含み、及び標的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間を含む、請求項４９に記載の方法。
51. 前記第一増幅反応についての条件が標的富化工程の少なくとも２回の完全なサイクル及び選択的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含み、及び前記第二増幅工程についての条件が標的増幅工程の少なくとも２回の完全なサイクルを含む、請求項３７に記載の方法。
52. 標的富化工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における０．５−１分間、５０−５５℃における１−２．５分間及び７０−７２℃における０．５−１分間を含み、選択的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９２−９４℃における１５−３０秒間、７０−７２℃における１−２分間を含み、及び標的増幅工程が増幅に関する以下の条件：９４℃における１５−３０秒間、５０−５５℃における１５−３０秒間及び７２℃における１５−３０秒間を含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記選択的増幅が、スーパープライマー結合部位を含む第一増幅産物の生産の方に偏る、請求項５２に記載の方法。
54. 標的富化プライマーの第一対の各々の長さが１０−２０ヌクレオチドであり、及び標的富化プライマーの第二対の各々の長さが３０−４０ヌクレオチドである、請求項５２に記載の方法。
55. ２又はそれ以上の標的増幅プライマー対をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
56. 前記病原因子が、ウイルス及び細菌から成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
57. 前記病原因子が、アデノウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ３型及び呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、及び（コクサッキーウイルスＡ型、コクサッキーウイルスＢ型、ライノウイルス及びエコーウイルスを含む）エンテロウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項３７に記載の方法。
58. 前記病原因子が、マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種から成る群より選択される細菌である、請求項３７に記載の方法。
59. 前記病原因子が、標的富化プライマーの第一対及び第二対の適切な設計によって選択される、請求項３７に記載の方法。
60. 前記正又は逆スーパープライマーの少なくとも１つが、検出のための手段をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
61. 前記検出のための手段が、化学的エレメント、酵素エレメント、蛍光エレメント又は放射標識エレメントから成る群より選択される、請求項６０に記載の方法。
62. 前記標的配列を検出することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
63. 検出方法が直接検出方法である、請求項６２に記載の方法。
64. 前記検出方法が、
    ａ．検出オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのセットを提供すること（検出オリゴヌクレオチドの各々のセットは、前記増幅産物内の特定標的配列に結合することができるヌクレオチド配列を有し、及びシグナル生成のための第一手段を含む。）；
    ｂ．前記検出オリゴヌクレオチドを、前記第二増幅産物と接触させ、インキュベートすること；
    ｃ．シグナル生成のための前記第一手段を刺激して、第一シグナルを生産すること；及び
    ｄ．前記第一シグナルを検出すること
    を含む、請求項６２に記載の方法。
65. 前記第一シグナルが前記病原因子に特有であり、及び前記第一シグナルが前記病原因子を特定するために使用される、請求項６４に記載の方法。
66. 第一シグナル生成のための前記手段が、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射標識である、請求項６４に記載の方法。
67. 第一シグナル生成のための前記手段が蛍光ミクロスフェアである、請求項６４に記載の方法。
68. 前記方法が間接検出方法である、請求項６２に記載の方法。
69. ａ．診断を必要とする被験者から、疾患因子を含むことが疑われる試料を提供すること；
    ｂ．前記試料から、前記疾患因子からの標的配列を含む核酸を単離すること；
    ｃ．前記核酸を、請求項１又は３７のいずれかに記載のプライマーに基づく増幅方法に供すること；
    ｄ．前記疾患因子からの前記標的配列を検出すること
    を含む、被験者において疾患因子の存在を診断する方法。
70. 疾患因子が、ウイルス及び細菌から成る群より選択される、請求項６９に記載の方法。
71. 前記疾患因子が、アデノウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ３型及び呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、及び（コクサッキーウイルスＡ型、コクサッキーウイルスＢ型、ライノウイルス及びエコーウイルスを含む）エンテロウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項６９に記載の方法。
72. 前記疾患因子が、マイコプラスマ菌種及びクラミジア菌種から成る群より選択される細菌である、請求項６９に記載の方法。
73. 検出方法が直接検出方法である、請求項６９に記載の方法。
74. 前記検出方法が、
    ａ．検出オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのセットを提供すること（検出オリゴヌクレオチドの各々のセットは、前記増幅産物内の特定標的配列に結合することができるヌクレオチド配列を有し、及びシグナル生成のための第一手段を含む。）；
    ｂ．前記検出オリゴヌクレオチドを、前記第二増幅産物と接触させ、インキュベートすること；
    ｃ．シグナル生成のための前記第一手段を刺激して、第一シグナルを生産すること；及び
    ｄ．前記第一シグナルを検出すること
    を含む、請求項６９に記載の方法。
75. 前記第一シグナルが前記疾患因子に特有であり、及び前記第一シグナルが前記疾患因子を特定するために使用される、請求項７４に記載の方法。
76. 第一シグナル生成のための前記手段が、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射標識である、請求項７４に記載の方法。
77. 第一シグナル生成のための前記手段が蛍光ミクロスフェアである、請求項７４に記載の方法。
78. 前記方法が間接検出方法である、請求項６９に記載の方法。
79. ａ．診断を必要とする被験者から、疾患因子又は二次疾患因子を含むことが疑われる試料を提供すること；
    ｂ．前記試料から、前記疾患因子又は二次疾患因子又はこの両方からの標的配列を含む核酸を単離すること；
    ｃ．前記核酸を、請求項１又は３８のいずれかに記載のプライマーに基づく増幅方法に供すること；
    ｄ．前記疾患因子又は二次疾患因子からの前記標的配列を検出すること
    を含む、被験者において疾患因子及び二次疾患因子の存在を鑑別的に診断するための方法。
80. 疾患因子又は二次疾患因子が、ウイルス及び細菌から成る群より選択される、請求項７９に記載の方法。
81. 前記疾患因子又は二次疾患因子が、アデノウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ３型及び呼吸器合胞体ウイルス、ＳＡＲＳ、及び（コクサッキーウイルスＡ型、コクサッキーウイルスＢ型、ライノウイルス及びエコーウイルスを含む）エンテロウイルスから成る群より選択されるウイルスである、請求項７９に記載の方法。
82. 前記疾患因子又は二次疾患因子が、マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種から成る群より選択される細菌である、請求項７９に記載の方法。
83. 検出方法が直接検出方法である、請求項７９に記載の方法。
84. 前記検出方法が、
    ａ．検出オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのセットを提供すること（検出オリゴヌクレオチドの各々のセットは、前記増幅産物内の特定標的配列に結合することができるヌクレオチド配列を有し、及びシグナル生成のための第一手段を含む。）；
    ｂ．前記検出オリゴヌクレオチドを、前記第二増幅産物と接触させ、インキュベートすること；
    ｃ．シグナル生成のための前記第一手段を刺激して、第一シグナルを生産すること；及び
    ｄ．前記第一シグナルを検出すること
    を含む、請求項７９に記載の方法。
85. 前記第一シグナルが前記疾患因子及び二次疾患因子に特有であり、及び前記第一シグナルが前記疾患因子を特定するために使用される、請求項８４に記載の方法。
86. 第一シグナル生成のための前記手段が、蛍光標識、化学標識、酵素標識又は放射標識である、請求項８４に記載の方法。
87. 第一シグナル生成のための前記手段が蛍光ミクロスフェアである、請求項８４に記載の方法。
88. 前記方法が間接検出方法である、請求項７９に記載の方法。

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