JP2013528049A - 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は2010年5月19日付けで出願された米国仮特許出願第61/346,218号(その内容全体が参照により本明細書に援用される)に対する優先権を主張する。
核酸が存在し得る任意のサンプルを出発点として使用することができ、これには臨床生物学的サンプル及び研究用生物学的サンプルを含む検体又は培養物(例えば細胞培養物、微生物培養物及びウイルス培養物);環境サンプル、例えば水、粉塵、土及び空気のサンプル;食品サンプル及び農業サンプル;並びに精液、毛髪、血液、皮膚及び唾液のサンプルを含む法医学的サンプルが含まれるが、これらに限定されない。生物学的サンプルはヒトを含む動物由来のもの、流体、固体(例えば糞便)、又は組織、並びに乳製品、野菜、食肉及び食肉副産物等の液体又は固体の食品及び飼料の製品及び原料、並びに廃棄物であり得る。環境サンプルとしては、表層物質、土壌、水及び産業サンプル等の環境物質、並びに食品及び乳製品の加工用の機器、装置、設備、器具、使い捨て及び使い捨てではない(non-disposable)製品から得られるサンプルが挙げられる。
一態様では、配列特異的な精製工程は、(1)少なくとも1つの標的核酸に特異的な少なくとも1つの核酸プローブを標的核酸とハイブリダイズすることにより標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを生成することと、(2)サンプルから二本鎖核酸ハイブリッドを分離し、精製された標的核酸を生成する、分離することとを含む。
少なくとも1つの標的核酸を精製したら、これを増幅する。この時点で増幅を行い、少なくとも1つの標的核酸の量を増大させることにより、本方法の感度を増大させる。
標的核酸は、(1)その標的核酸を複数のポリヌクレオチド検出プローブを含む少なくとも1つの検出プローブセットと、検出プローブのそれぞれをその相補体とハイブリダイズするのに十分な条件下で接触させること、(2)ポリヌクレオチド検出プローブの少なくとも1つのハイブリダイゼーションを検出すること、及び(3)標的核酸とハイブリダイズしたポリヌクレオチド検出プローブの融解温度(Tm)を決定することにより、増幅された核酸のプールから検出される。検出プローブセットのポリヌクレオチド検出プローブは完全長DNA、切断DNA若しくは合成DNA、又は完全長RNA、切断RNA若しくは合成RNAであり得る。少なくとも1つの捕捉プローブは少なくとも1つの標的核酸の同一性とは関係なしにDNA、RNA、synRNA又はPNAであり得る。ポリヌクレオチド検出プローブは、検出可能な標識を受容し得るように検出可能に標識又は適合するものとする。さらに、検出プローブセットは、(1)複数の検出プローブの内の少なくとも2つが同じ検出可能な標識を有し、(2)複数の検出プローブの内の少なくとも2つが異なる検出可能な標識を有し、(3)同じ検出可能な標識を有する複数の検出プローブのいずれもが異なる融解温度(Tm)を有するように構築されるものとする。
(1)少なくとも1つのハイブリッド捕捉プローブ、抗DNA−RNAハイブリッド抗体及び固体支持体からなる群から選択される少なくとも1つのハイブリッド捕捉成分と、(2)少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの検出プローブを含む検出プローブセットとを含むキットも開示される。
i.少なくとも1つのポリヌクレオチドハイブリッド捕捉プローブ、
ii.抗ハイブリッド抗体、
iii.ポリメラーゼ、
iv.検出プローブセット、
v.任意で抗ハイブリッド抗体に結合するように適合させた常磁性ビーズ、
vi.任意で変性試薬、
vii.任意でヘリカーゼ、及び
viii.任意で増幅された核酸を断片化するための試薬
を含むか、これからなるか、又はこれから本質的になる、サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸の検出のためのキットも提供される。
Claims (23)
- サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸を検出する方法であって、
A.該少なくとも1つの標的核酸を精製することであって、
A1.該少なくとも1つの標的核酸を該少なくとも1つの標的核酸に特異的な少なくとも第1の核酸プローブを含むハイブリッドプローブセットとハイブリダイズすることにより、該少なくとも1つの標的核酸の二本鎖核酸ハイブリッドを生成すること、及び、
A2.該サンプルから該二本鎖核酸ハイブリッドを分離し、少なくとも1つの精製された核酸を生成する、分離すること、
により、該少なくとも1つの標的核酸を精製することと、
B.該少なくとも1つの精製された核酸の少なくとも一部分を増幅し、増幅された核酸を生成する、増幅することと、
C.該標的核酸を検出することであって、
C1.該増幅された核酸を少なくとも1つの検出プローブセットと接触させることであって、
C1(a).該検出プローブセットの各検出プローブが検出可能な標識を有し、
C1(b).該検出プローブセットの少なくとも2つの検出プローブが同じ検出可能な標識を保有し、
C1(c).同じ検出可能な標識を保有する各プローブが同じ標識を有する他のプローブとは異なる融解温度(Tm)を有する、
該増幅された核酸を少なくとも1つの検出プローブセットと接触させること、
C2.該増幅された核酸とハイブリダイズした検出プローブの該検出可能な標識を検出及び特定すること、並びに、
C3.該検出プローブが該増幅された核酸から解離する温度を検出すること、
により、該標的核酸を検出することと、
を含み、
該標的核酸の同一性を、該検出可能な標識及び該検出プローブが該増幅された核酸から解離する温度の特定により決定することができる、サンプルにおける少なくとも1つの標的核酸を検出する方法。 - 二本鎖核酸ハイブリッドが、該二本鎖核酸ハイブリッドをハイブリッド特異的な分子と接触させることにより該サンプルから分離される、請求項1に記載の方法。
- ハイブリッド特異的な分子の結合により、該標的核酸が固相に固定される、請求項2に記載の方法。
- ハイブリッド特異的な分子が固体支持体と結合するか、又は固体支持体と結合するように適合される、請求項2又は3に記載の方法。
- 標的核酸を該固相に固定させたままで増幅する、請求項3又は4に記載の方法。
- 二本鎖核酸ハイブリッドがDNA:RNAハイブリッドであり、該ハイブリッド特異的な分子が抗DNA:RNAハイブリッド抗体又はその断片である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸を等温増幅により増幅する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 等温増幅が、(a)鎖置換活性を有するポリメラーゼと、(b)ランダムプライマーとを利用する、請求項7に記載の方法。
- 等温増幅が全ゲノム増幅を含む、請求項7又は8に記載の方法。
- 同じ検出可能な標識を含む各プローブがその融解温度に関して、少なくとも0.1℃、又は0.5℃〜10℃、又は約1℃〜約5℃、又は約5℃異なる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 検出プローブセットの各プローブが、
c1(d):365±20nmの励起源により励起し、460±15nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
c1(e):470±10nmの励起源により励起し、510±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
c1(f):530±5nmの励起源により励起し、555±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
c1(g):585±5nmの励起源により励起し、610±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
c1(h):625±10nmの励起源により励起し、660±10nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、及び、
c1(i):680±5nmの励起源により励起し、712nmのロングパス検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォア、
からなる群から選択される少なくとも1つのフルオロフォアを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - 検出プローブセットが、プローブの少なくとも3つの群を含み、前記少なくとも3つの群のそれぞれの各プローブが、
α)c1(d)〜c1(i)に記載の単一群内のフルオロフォアを含み、
β)同じ群の他のいかなるプローブとも少なくとも0.1℃異なる融解温度を有する、請求項11に記載の方法。 - 検出プローブセットが、
c1(d):gyrA、gyrB−1、gyrB−2、parC及びparEからなる群から選択されるシプロフロキサシン耐性標的に特異的な少なくとも1つの検出プローブ、並びに、
c1(e):capB2、capB4、pXO1、pXO2、PLA、PIM、CAF1、tul4及びfopAからなる群から選択されるゲノム標的又はプラスミド標的に特異的な少なくとも1つの検出プローブ、
を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 検出プローブセットが、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、ストレプトコッカス属細菌、シュードモナス属細菌、赤痢菌属細菌、カンピロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、A型呼吸器合胞体ウイルス、B型呼吸器合胞体ウイルス;アデノウイルス、HSV1、HSV2、A型/B型インフルエンザウイルス、hMPV、1型〜4型パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、ボカウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、HIV、H1N1ウイルス、クラジミア、ナイセリア・ゴノレア、トリコモナス・バギナリス、スタフィロコッカス・アウレウス、SARS関連コロナウイルス、大腸菌、バシラス・アンスラシス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、エルシニア・ペスティス、ビブリオ・コレレ、フランシセラ・ツラレンシス、ブルセラ属細菌、コクシエラ・バーネッティ、マクポウイルス、コクシジオイデス・イミチス、コクシジオイデス・ポサダシ、バークホルデリア・マレイ、バークホルデリア・シュードマレイ、赤痢菌亜種細菌、リケッチア・リケッチイ、リケッチア・プロワツェキイ、クラミドフィラ・シタッシ、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡からなる群から選択される病原菌から誘導される核酸に特異的な少なくとも1つの検出プローブを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅された核酸を検出前に及び/又は検出中に断片化する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅された核酸を、
A.該増幅された核酸を制限酵素若しくはヌクレアーゼ、又はその断片に接触させること、
B.ランダムリボヌクレオチド一リン酸を該増幅された核酸に組み込むとともに、得られる増幅された核酸をアルカリ処理に供すること、並びに、
C.超音波処理、噴霧及び流体力学的剪断からなる群から選択される手法により、該増幅された核酸を物理的に断片化すること、
からなる群から選択される少なくとも1つの手法により断片化する、請求項15に記載の方法。 - 増幅と検出とを同時に行う、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 検出プローブが該増幅された核酸から解離する該温度を、該増幅された核酸を二本鎖核酸特異的な色素と接触させることにより決定する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖核酸特異的な色素が、SYBR(商標) Green I、SYBR(商標) Gold、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、Pico Green、Hoechst 33258、YO−PRO−I及びYO−YO−I、SYTO(商標)9、LC Green(商標)、LC Green(商標) Plus+、並びにEvaGreen(商標)からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- それぞれが検出可能な標識を含む少なくとも3つの核酸プローブを含む検出プローブセットであって、
A.該核酸プローブの少なくとも2つが同じ検出可能な標識を含み、
B.各プローブが同じ検出可能な標識を含む他のいかなるプローブとも異なる融点を有する、
それぞれが検出可能な標識を含む少なくとも3つの核酸プローブを含む検出プローブセット。 - 融点が少なくとも0.1℃、又は0.5℃〜10℃、又は約1℃〜約5℃、又は約5℃異なる.請求項20に記載の検出プローブセット。
- (a1):各プローブが、365±20nmの励起源により励起し、460±15nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
(a2):各プローブが、470±10nmの励起源により励起し、510±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
(a3):各プローブが、530±5nmの励起源により励起し、555±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
(a4):各プローブが、585±5nmの励起源により励起し、610±5nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
(a5):各プローブが、625±10nmの励起源により励起し、660±10nmの検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、及び、
(a6):各プローブが、680±5nmの励起源により励起し、712nmのロングパス検出フィルターを用いて検出することが可能であるフルオロフォアを含むプローブセット、
からなる群から選択される少なくとも2つのプローブセットを含む、請求項20又は21に記載の検出プローブセット。 - 標的核酸を検出するためのキットであって、
A.少なくとも1つのハイブリッド捕捉プローブ、及び、
B.請求項20〜22のいずれか一項に記載の検出プローブセットを含み、
任意で、
C.ポリメラーゼ、又は鎖置換活性を有するポリメラーゼ、
D.二本鎖核酸特異的な色素、又は少なくとも50%、少なくとも80%若しくは少なくとも99%の飽和度を有する、若しくはSYBR(商標) Green I、SYBR(商標) Gold、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、Pico Green、Hoechst 33258、YO−PRO−I、YO−YO−I、SYTO(商標)9、LC Green(商標)、LC Green(商標) Plus+、及びEvaGreen(商標)からなる群から選択される、二本鎖核酸特異的な色素、
E.抗DNA−RNAハイブリッド抗体、並びに、
F.該抗ハイブリッド抗体に結合するように適合した固体支持体、
G.変性試薬、
H.ヘリカーゼ、並びに、
I.増幅された核酸を断片化するための試薬、
の内の1つ又は複数を含む、標的核酸を検出するためのキット。
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