KR20240067091A - 다양한 내부 변형을 갖는 루프형 프라이머 및 표적 탐지를 위한 루프-디-루프 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 바이오센서-표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적 핵산을 검출하는 신규한 루프-디-루프 방법을 제공한다. 더욱이 방법에 사용하기 위한 다양한 내부 변형이 있는 루프형 프라이머와 키트가 본 명세서에 제공된다.
Description
관련된 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2021년 9월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/243,625에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출되었고 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된 XXX 서열을 갖는 서열 목록을 함유한다. XXXX에서 생성된 상기 ASCII 카피의 이름은 53034WO_sequencelisting.txt이고 크기는 XXX 바이트이다.
핵산 서열의 상보성을 사용하여 표적 핵산을 검출하는 방법은 전통적인 서던 혼성화에서부터 현재까지 다양하게 개선되거나 변형되어 왔다. 특히, 폴리머라제연쇄반응(PCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 핵산 서열-기반 증폭(NASBA), 롤링 서클 증폭(RCA), 루프-매개된 등온 증폭(LAMP)과 같은 다양한 시험관내 핵산 증폭 방법의 확립은 더 적은 양의 표적 핵산을 검출할 수 있게 되었다. 방법은 감염의 의학적 진단, 돌연변이체 유전자형의 결정, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 및 점 돌연변이의 검출 등을 위해 샘플에서 표적 핵산의 서열-특이적 검출 및 정량화에 사용되어 왔다. 핵산 증폭 방법은 그 높은 특이성과 민감도로 인해 시험에 대한 황금 표준이 되었다.
그러나, 현재의 핵산 증폭 방법은 증폭 반응 및 신호 검출이 제어된 환경과 고가의 장비를 사용한 정밀한 측정을 요하기 때문에 한계가 있다. 따라서, 방법은 현장 치유 상황에서 사용하기에는 종종 비용이 많이 든다. 추가로, 방법은 단일 환자 샘플에서 다중화된 표적의 검출에 대해 최적화되어 있지 않다. 다중화된 표적의 검출은 단일-포트 반응에서의 신호 다중화(형광 스펙트럼 다중화, 전기화학 검출기의 배열), 고유한 반응 용기로 다중 반응의 물리적 분리, 또는 이의 조합에 의해 성취될 수 있다. 그러나, CLIA 면제 테스트의 경우, 단일 환자 샘플을 사용하여 핵산 표적의 패널을 동시에 쿼리하기 위해 3개 이하의 간단한 단계만이 사용자에 의해 요구되어야 한다. 따라서, 복잡한 디바이스나 일회용이 자동으로 처리를 처리하지 않는 한, CLIA 면제 테스트에 대해 별도의 챔버로 샘플의 물리적 분리는 빠르게 불가능해진다. 형광을 이용한 스펙트럼 다중화는 핵산 표적의 패널을 표적화하기 위해 필요한 고유한 반응의 수를 줄일 수 있지만, 스펙트럼 다중화 LAMP 반응은 검정 속도나 신호 강도에서 극적인 희생을 요구하므로 POC 시험에 성공적인 적용에 대한 전망이 약화된다.
따라서, 낮은 비용에서 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산, 특히 다중화된 표적의 용이한 증폭 및 검출을 가능하게 하는 새로운 방법의 개발이 요구된다.
본 개시내용은 폐쇄계에서 표적 핵산의 용이한 검출을 가능하게 하는 새로운 증폭 방법을 제공한다. 방법은 바이오센서 쌍을 갖는 루프형 프라이머를 사용하여 높은 특이성과 민감도로 소량의 표적 핵산의 검출을 허용한다. 바이오센서 쌍은 예를 들어 형광/소광제 FRET 기술을 사용하여 루프형 프라이머의 형태 변화를 검출함에 의해 표적 서열의 루프-디-루프("LDL") 증폭의 결정을 허용한다. 구체적으로, 핵산 증폭은 루프형 프라이머의 제1 클램핑 서열과 제2 클램핑 서열 사이의 상호작용과 경쟁하여, 신호 생성 형광/소광제 쌍이 분리되게 하고 관찰된 신호(예를 들어, 형광)에 측정가능한 변화가 발생한다.
부가적으로, 다양한 바이오센서를 갖는 다중 루프형 프라이머의 사용은 단일 튜브에서 다중화된 표적의 검출을 가능하게 한다. 루프형 프라이머는 루프-매개된 등온 증폭(LAMP)뿐만 아니라 가닥 대체 폴리머라제를 활용하는 다른 핵산 증폭 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
출원인은 루프-디-루프 증폭 방법이 DARQ(소광의 해제에 의한 증폭의 검출) 및 OSD(1-단계 변위) 프로브와 같은 억제성 형광 프로브를 포함하는 이전에 공지된 방법에 비해 더 빠른 선회 시간에서 개선된 민감도 및 특이성으로 표적 핵산 분자의 서열-특이적 증폭을 허용한다는 것을 입증했다. 더욱이, 루프-디-루프 증폭 방법은 QUASR(통합되지 않은 증폭 신호 리포터의 소광)과 달리 증폭 신호의 실시간 검출을 허용한다. 루프-디-루프 방법은 조 샘플에서도 강력한 신호를 제공하므로 방법은 낮은-비용 장비에 의해 수행될 수 있다.
본 개시내용은 루프-디-루프("LDL") 증폭 방법에 사용될 수 있는 2가지 유형의 루프형 프라이머 ― NBM-루프형 프라이머 및 BM-루프형 프라이머를 제공한다. NBM-루프형 프라이머와 BM-루프형 프라이머 둘 모두는 형광/소광제 쌍 ― 서로 충분히 가까워서 형광 신호를 적절하게 소광시키고 그 상호작용의 변경 시 증폭 신호를 제공하는 제1(외부) 센서 분자와 제2(내부) 센서 분자를 포함한다. 그러나, NBM-루프형 프라이머(도 1) 및 BM-루프형 프라이머(도 23)는 내부 클램핑 올리고뉴클레오티드에 비해 다른 위치에서의 내부 센서 분자 및 표적 서열에 상보적인 프라이머 서열을 포함한다. NBM-루프형 프라이머는 내부 클램핑 올리고뉴클레오티드와 프라이머 서열 사이에 내부 센서 분자를 포함하는 반면, BM-루프형 프라이머는 내부 클램핑 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 내부 센서 분자를 포함한다.
NBM-루프형 프라이머는 내부 클램핑 올리고뉴클레오티드와 프라이머 서열 사이에 내부 센서 분자를 포함하기 때문에, 일부 내부 센서는 도 27에 예시된 바와 같이 Bst 2.0 WarmStart(New England Biolabs)와 같은 가닥 대체 폴리머라제의 내부 클램핑 올리고뉴클레오티드 방향으로의 전방향 진행을 차단하거나 방해할 수 있다.
NBM-루프형 프라이머와 달리, BM-루프형 프라이머는 내부 클램핑 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 내부 센서 분자를 포함하므로, 등온 증폭 검정에서 가닥 대체 폴리머라제는 내부 센서 분자에 도달하기 전에 표적 서열에 대한 연속적인 상보적 서열 및 내부 클램핑 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다(도 23). 이는 내부 센서 분자가 가닥 대체 폴리머라제의 진행을 차단하는 경우에도 표적 서열 및 내부 클램핑 올리고뉴클레오티드의 증폭을 허용한다. 이를 통해 그 차단 효과에 관계없이 다양한 내부 센서 분자를 사용할 수 있다. 이는 다중 표적의 동시 검출을 위해 다중 루프형 프라이머가 함께 사용되고 다양한 센서 분자의 사용이 필요한 경우 특히 중요하다.
BM-루프형 프라이머를 사용한 증폭으로부터 생성된 이중 가닥 DNA 분자는 클램핑 서열보다 더 높은 용융 온도를 갖는 경향이 있고, 따라서 개방 루프 구성이 훨씬 더 유리하다. 이는 NBM-루프형 프라이머를 사용하여 달성되는 것과 유사한 밝은 형광을 초래한다. 추가적으로, BM-루프형 프라이머의 개방형 구성은 실온을 포함한 넓은 온도 범위에 걸쳐서 안정적이다. 이 특성은 내부 변형이 차단된 경우에도 형광에 의해 평가변수 결정을 허용한다.
본 개시내용은 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭을 위해 NBM-루프형 프라이머 또는 BM-루프형 프라이머를 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, NMB-루프형 프라이머 및 BM-루프형 프라이머는 단일 반응에서 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, NMB-루프형 프라이머 또는 BM-루프형 프라이머는 단일 반응에서 개별적으로 사용된다. 본 개시내용은 또한 증폭 방법을 위한 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 표적 서열의 루프-디-루프 증폭(LdL)을 위한 BM-루프형 프라이머를 제공한다. 일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 5'에서 3'으로 다음을 포함한다:
제1 센서 분자;
제1 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제1 이격 올리고뉴클레오티드;
제2 센서 분자,
여기서, 제1 센서 분자 및 제2 센서 분자는 제1 바이오센서 쌍임;
선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드;
제2 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제1 프라이머 서열.
일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 제1 이격 올리고뉴클레오티드 또는 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 구조에서 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 프라이머 서열은 중첩된다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 프라이머 서열은 중첩되지 않다.
일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 제2 이격 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 이격 올리고뉴클레오티드 및 제2 이격 올리고뉴클레오티드 둘 모두는 헤어핀 구조에서 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 15개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 10개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 9개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 8개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 7개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 6개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 제1 센서 분자와 선택적인 제2 센서 분자는 9 내지 100Å 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 제1 센서 분자와 선택적인 제2 센서 분자는 10 내지 50Å 떨어져 있다.
일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 10개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 18개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 19개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 제1 바이오센서 쌍은 에너지 공여체 및 수용체 쌍이다. 일부 실시형태에서, 제1 바이오센서 쌍은 형광 공명 에너지 전달(FRET) 또는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)을 위한 에너지 공여체 및 수용체 쌍이다.
일부 실시형태에서, 제1 센서 분자는 FRET 형광단이고, 제2 센서 분자는 FRET 소광제이다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자는 FRET 소광제이고, 제2 센서 분자는 FRET 형광단이다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자는 BRET 에너지 공여자이고, 제2 센서 분자는 BRET 에너지 수용체이다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자는 BRET 에너지 수용체이고, 제2 센서 분자는 BRET 에너지 공여자이다.
일부 실시형태에서, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 검출가능한 광 신호를 생성하는 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자 및 제2 센서 분자는 헤어핀 구조가 형성될 때 유의하게 감소된 광 신호를 생성한다.
일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 티미딘(T) 또는 디옥시티미딘(dT)에 부착된다.
일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 60℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 65℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 80℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70 내지 80℃이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70 내지 75℃이다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 약 72℃이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60℃ 미만이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60 내지 65℃이다.
일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 (i) 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 선택된 핵염기, (ii) 잠금 핵산, (iii) 2' O-메틸 RNA 염기, (iv) 포스포로티오화된 DNA 염기, (v) 포스포로티오화된 RNA 염기, (vi) 포스포로티오화된 2'-O-메틸 RNA 염기, 또는 (vii) 이의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 루프형 프라이머의 5' 말단에 제1 추가 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 제1 센서 분자와 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드 사이에 제2 추가 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 추가 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열이다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 병원체 게놈에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 클라미디아 트라코마티스에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 orf8 또는 cds2로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 서열번호: 15의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 나이세리아 고노레아에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 porA 또는 glnA로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 서열번호: 5 또는 7의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 바이러스에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 호모 사피엔스에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 RNA 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 POP7b를 인코딩하는 RNA 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 tbc1d3으로부터의 것이다. 일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 서열번호: 22의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 루프형 프라이머를 포함하는, 표적 서열의 루프-디-루프 증폭을 위한 프라이머 혼합물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 전방 내부 프라이머(FIP), (ii) 후방 내부 프라이머(BIP), (iii) 전방 프라이머(F3) 및 후방 프라이머(B3)를 추가로 포함하며, 여기서 FIP, BIP, F3 및 B3는 표적 서열 상의 6개의 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 루프 전방 프라이머(LF) 및 (ii) 루프 후방 프라이머(LB)를 추가로 포함하며, 여기서 LF와 LB는 표적 서열 상의 2개의 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, FIP, BIP, F3, B3, LF 또는 LB는 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, FIP는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물 중 FIP와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1이다. 일부 실시형태에서, BIP는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물 중 BIP와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1이다. 일부 실시형태에서, LF는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물 중 LF와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1이다. 일부 실시형태에서, LB는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물 중 LB와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1이다.
일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, BIP는 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LF는 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 8의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 11의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, BIP는 서열번호: 12의 올리고뉴클레오티드를 포함거나, LF는 서열번호: 13의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 14의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 11의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 13의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 14의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 16의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 17의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 18의 올리고뉴클레오티드를 포함거나, BIP는 서열번호: 19의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LF는 서열번호: 20의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 21의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 16의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 17의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 19의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 20의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 21의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 제2 루프형 프라이머를 추가로 포함하며, 여기서 제2 루프형 프라이머는 5'에서 3'으로 다음을 포함한다:
제3 센서 분자;
제3 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제3 이격 올리고뉴클레오티드;
제4 센서 분자,
여기서, 제3 센서 분자 및 제4 센서 분자는 제2 바이오센서 쌍이고, 제2 바이오센서 쌍은 제1 바이오센서 쌍과 상이함;
선택적인 제4 이격 올리고뉴클레오티드;
제4 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제3 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제3 이격 올리고뉴클레오티드, 제4 센서 분자, 선택적인 제4 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제3 및 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
제2 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제2 프라이머 서열.
일부 실시형태에서, 제3 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적이다.
일부 실시형태에서, 표적 서열과 제2 표적 서열은 동일하다. 일부 실시형태에서, 표적 서열과 제2 표적 서열은 상이하다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 제2 전방 내부 프라이머(SFIP), (ii) 제2 후방 내부 프라이머(SBIP), (iii) 제2 전방 프라이머(SF3), 및 (iv) 제2 후방 프라이머(SB3)를 추가로 포함하며, 여기서 SFIP, SBIP, SF3 및 SB3는 제2 표적 서열 상의 6개의 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 제2 루프 전방 프라이머(SLF) 및 (ii) 제2 루프 후방 프라이머(SLB)를 추가로 포함하며, 여기서 SLF와 SLB는 제2 표적 서열 상의 2개의 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 제3 루프형 프라이머를 추가로 포함하며, 여기서 제3 루프형 프라이머는 5'에서 3'으로 다음을 포함한다:
제5 센서 분자;
제5 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제5 이격 올리고뉴클레오티드;
제6 센서 분자,
여기서, 제5 센서 분자 및 제6 센서 분자는 제3 바이오센서 쌍이고, 제3 바이오센서 쌍은 제1 바이오센서 쌍 및 제2 바이오센서 쌍과 상이함;
선택적인 제6 이격 올리고뉴클레오티드;
제6 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제5 이격 올리고뉴클레오티드, 제6 센서 분자, 선택적인 제6 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제5 및 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
제3 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제3 프라이머 서열.
일부 실시형태에서, 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열, 제2 표적 서열 및 제3 표적 서열은 동일하다. 일부 실시형태에서, 표적 서열, 제2 표적 서열 및 제3 표적 서열은 상이하다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 제3 전방 내부 프라이머(TFIP), (ii) 제3 후방 내부 프라이머(TBIP), (iii) 제3 전방 프라이머(TF3), 및 (iv) 제3 후방 프라이머(TB3)를 추가로 포함하며, 여기서 TFIP, TBIP, TF3 및 TB3는 제3 표적 서열 상의 6개의 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 제3 루프 전방 프라이머(TLF) 및 (ii) 제3 루프 후방 프라이머(TLB)를 추가로 포함하며, 여기서 TLF와 TLB는 제3 표적 서열 상의 2개의 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 제4 루프형 프라이머를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 제5 루프형 프라이머를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 루프형 프라이머 또는 프라이머 혼합물을 동결건조시켜 얻은 건조된 프라이머 혼합물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 루프형 프라이머, 프라이머 혼합물 또는 건조된 프라이머 혼합물을 포함하는, 표적 서열의 루프-디-루프 증폭용 키트를 제공한다.
일부 실시형태에서, 폴리머라제는 선택적으로 바실러스 스테아로테르모필루스 폴리머라제이다. 일부 실시형태에서, 키트는 dNTP, MgSO4 및 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 역전사효소를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 RNase 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, RNase 억제제는 돼지(porcine) 또는 쥐(murine) RNase 억제제이다.
본 개시내용은 다음 단계를 포함하는 샘플에서 표적 서열을 검출하는 방법을 추가로 개시한다:
샘플을 제공하는 단계;
(i) 프라이머, (ii) 프라이머 혼합물, 또는 (iii) 건조된 프라이머 혼합물을 재수화하여 얻은 재구성된 프라이머 혼합물과 폴리머라제를 샘플에 첨가하고, 이에 의해 반응 혼합물을 생성하는 단계; 및
반응 혼합물을 50-85℃에서 인큐베이션하는 단계.
일부 실시형태에서, 인큐베이션은 50-70℃에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 60-65℃에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 62-65℃에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 폴리머라제는 바실러스 스테아로테르모필루스 폴리머라제이다.
일부 실시형태에서, 방법은 반응 혼합물로부터 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 신호는 형광 신호이다. 일부 실시형태에서, 검출하는 단계는 인큐베이션의 단계 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플 내 표적 서열의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 샘플을 준비하는 이전 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플을 준비하는 단계는 RNA 분자를 역전사효소와 상호작용시켜 DNA 분자를 포함하는 샘플을 생성하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플을 준비하는 단계는 역전사효소와의 상호작용 전 또는 상호작용 중에 RNA 분자를 예열하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 RNase 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, RNase 억제제는 돼지(porcine) 또는 쥐(murine) RNA 억제제이다.
일부 실시형태에서, 샘플은 정제된 RNA, 정제된 DNA, 전체 SARS-CoV-2 바이러스, 전체 인간 세포, 타액 또는 비강 면봉, 또는 비강 또는 비인두 면봉을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 질 면봉으로부터의 게놈 DNA, 합성 DNA, 전체 박테리아 또는 전체 인간 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 표적 서열의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 표적 서열 또는 제3 표적 서열의 부재 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1은 NBM-루프형 프라이머의 구조와 NBM-루프형 프라이머를 사용한 루프-디-루프 방법에서 DNA 증폭이 어떻게 진행되는지를 예시한다.
도 2a는 인터칼레이팅 염료(SYTO)로 시각화된 클라미디아 트라코마티스(CT) 및 나이세리아 고노레아(NG)에 대한 LAMP 검정 결과를 제공한다. CT의 경우 적어도 5로그의 [DNA], NG의 경우 6로그 이상으로 증폭이 빠르다(<30분). NG 검정 분석 민감도(LOD50)는 PROBIT 분석에 의한 35cp/10μL 반응이다.
도 2b는 신규한 NBM-루프형 프라이머를 사용한 표적 증폭으로부터 판독을 제공한다. 결과는 SYTO 염료에 비해 최소한의 억제와 강화된 특이성으로 표적의 극도로 밝은 실시간 검출을 보여준다.
2c는 신규한 NBM-루프형 프라이머를 사용한 나이세리아 고노레아의 검출을 제공한다. 결과는 방법이 반복가능하며 빠르고 강력하며 높은 신호-대-잡음비 증폭을 생성한다는 것을 보여준다. 프로브는 허위 양성을 제거한다.
도 3은 50% 치환에서 FAM-표지된 LF 프라이머를 갖는 루프-디-루프 방법을 사용하여 클라미디아 트라코마티스의 표적 핵산의 증폭을 나타내는 시간에 걸친 실시간 형광 신호의 플롯이다. 양성 샘플과 음성 샘플 둘 모두는 오른쪽 표에 표시된 대로 테스트되었다. y-축 상의 각 "주기"는 섭씨 65도에서 30초의 경과 시간을 나타낸다.
도 4는 50% 치환에서 FAM-표지된 LF 프라이머를 갖는 루프-디-루프 방법을 사용하여 나이세리아 고노레아의 표적 핵산의 증폭을 나타내는 시간에 걸친 실시간 형광 신호의 플롯이다. 양성 샘플과 음성 샘플 둘 모두는 오른쪽 표에 표시된 대로 테스트되었다. y-축 상의 각 "주기"는 섭씨 65도에서 30초의 경과 시간을 나타낸다.
도 5는 50% 치환에서 FAM-표지된 LF 프라이머를 갖는 루프-디-루프 방법을 사용하여 호모 사피엔스의 표적 핵산의 증폭을 나타내는 시간에 걸친 실시간 형광 신호의 플롯이다. 양성 샘플과 음성 샘플 둘 모두는 오른쪽 표에 표시된 대로 테스트되었다. y-축 상의 각 "주기"는 섭씨 65도에서 30초의 경과 시간을 나타낸다.
도 6은 NBM-루프형 프라이머로 4개의 양성(왼쪽) 및 4개의 음성(오른쪽) 반응을 함유하는 튜브의 이미지를 제공한다. 형광은 파란색 LED로 여기되고 파란색 젤 필터를 통해 빛나고 방출은 카메라폰에 올려진 호박색 플라스틱 필터로 시각화되었다.
도 7은 PCR 튜브에서 동결건조에 의해 제조된 클라미디아 트라코마티스(상단), 나이세리아 고노레아(중앙) 및 호모 사피엔스(하단)에 대한 NBM-루프형 프라이머 검정을 위한 건조된(동결건조된) 혼합물을 함유한 튜브의 이미지를 제공한다.
도 8은 사용 전 재구성된 도 7의 건조된 혼합물을 사용한 루프-디-루프 반응에서 클라미디아 트라코마티스, 나이세리아 고노레아 및 호모 사피엔스의 표적 핵산의 증폭을 나타내는 실시간 형광 신호를 제공한다. 결과는 건조된 다음 재구성된 프라이머의 유지된 검정 활성 및 민감도를 보여준다.
도 9a(제1 테스트) 및 9b(제2 테스트)는 다양한 온도에 설정된 POP7b(H. 사피엔스 RNA 전사체) 또는 ORF1ab(SARS-CoV-2 게놈 RNA) 프라이머를 사용하여 루프-디-루프 LAMP 반응으로부터 결과를 얻는데 필요한 시간을 플롯팅한다.
도 10은 H. 사피엔스, C. 트라코마티스, N. 고노레아 또는 SARS-CoV-2로부터 DNA를 표적화하는 NBM-루프형 프라이머의 용융 곡선을 제공한다. NBM-루프형 프라이머는 반응 온도인 65℃보다 약 10℃ 높게 풀리도록 설계되었다. 곡선은 루프-디-루프 프라이머의 스템-루프 서열이 형광 신호를 담당한다는 것을 입증한다.
도 11은 25%, 50% 또는 100% 강도에서 NBM-루프형 프라이머를 사용한 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 이 맥락에서 "강도"는 루프-디-루프 방법에 대해 프라이머가 루프 버전으로 치환되는 정도이다. 데이터는 더 강한 프라이머가 결과까지의 시간에서 1-2분의 감속 대신 더 큰 신호를 제공하는 경향이 있다는 것을 보여준다. 100% 강도에서 루프-디-루프 프라이머는 검정을 느리게 했지만 다른 실시간 LAMP 변위 프로브 방법의 정도에는 거의 미치지 못했다. y-축 상의 각 "주기"는 섭씨 65도에서 30초의 경과 시간을 나타낸다.
도 12는 0.4μM NBM-루프형 프라이머와 2μM SYTO 인터칼레이팅 염료 둘 모두를 포함하는 루프-디-루프 반응으로부터의 상대 형광 신호를 제공한다. 2-채널 형광 데이터는 인터칼레이팅 염료(SYTO) 및 루프-디-루프 신호의 전개에 대한 타이밍이 동일함을 입증한다. 루프-디-루프 대 인터칼레이팅 염료로는 신호 지연이 없었으며 루프-디-루프 반응은 SYTO보다 더 큰 신호를 제공했다.
도 13a 및 13b는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 클라미디아 트라코마티스의 표적 서열의 증폭으로부터 실시간 형광 신호를 보여준다. 도 13a는 신선하게 혼합된 반응 혼합물로부터 결과이고, 도 13b는 동결-건조된 반응 혼합물로부터 결과이다. 동결-건조된 검정 혼합물은 3개월 초과 안정적이었고 양호한 판독값을 제공했다. 검정은 검정(20.7 카피/μL)의 LoD95(낮은 양성)에서 각각의 Ct E BOUR(클라미디아 트라코마티스 균주) 14회 반복 플러스 2개의 주형 없음 대조군(NTC)으로 실행되었다. 신선한 반응 혼합물과 동건-조된된 반응 혼합물 사이에 민감도(LoD95에서 각각 12/14) 또는 결과까지 평균 시간(16분, T-테스트, P-값 = 0.66)에는 변화가 없었다.
도 14a, 14b 및 14c는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 단일 튜브 반응(단일 포트)에서 SARS-CoV-2 및 인간 표적 서열의 루프-디-루프 증폭으로부터 스펙트럼적으로 이중화된 형광 신호를 보여준다. 점선 신호는 SARS-CoV-2(FAM)로부터의 것이고 실선 신호는 인간 내부 대조군(Cy5)으로부터의 것이다. 3가지 유형의 샘플이 사용되었다 ― 표적 서열이 없는 대조군 샘플(도 14a), 조 인간 비강 면봉(도 14b), 및 열-불활성화된 SARS-CoV-2(게놈 RNA 표적 서열이 있는 온전한 바이러스)와 조합된 조 인간 비강 면봉(도 14c). 데이터는 표적 서열의 존재에서만 특정 증폭 신호를 보여준다. 데이터는 단일 반응 용기에서 루프-디-루프 방법으로 반응의 스펙트럼 다중화를 추가로 입증한다.
도 15a는 다양한 농도의 POP7b 프라이머에서 루프-디-루프 증폭으로부터의 실시간 형광 신호를 보여준다. POP7b 프라이머의 농도가 감소함에 따라 신호 강도가 감소했다(화살표). 단일 반응 부피에 하나 초과의 프라이머 세트를 갖는 다중화 적용에서, 프라이머 100%가 단일 세트에 속하는 반응에 비해 임의의 주어진 프라이머 세트의 농도가 감소했다. 도 15b는 다양한 농도의 POP7b 프라이머에서 결과까지의 시간(분)을 플롯팅한다. 프라이머 농도가 40% 미만으로 떨어지면 결과까지의 시간이 영향을 받았는데, 이는 단일 튜브에서 2개 초과의 표적을 다중화하는 이점이 속도에 대한 임상적 또는 시장-기반 요구보다 더 큰 많은 적용에 대해 허용될 수 있다. 반응에서는, 21μL 반응 부피에 10-4gBlock DNA가 사용되었다.
도 16은 코로나바이러스-양성 대상체로부터 얻은 처리되지 않은 비강 면봉에서, SARS-CoV-2(ORF1ab)에 특이적인 RNA 표적 서열, 호모 사피엔스(POP7b)에 특이적인 RNA 표적 서열, 두 표적 모두, 또는 어느 표적도 없는 루프-디-루프 RT-LAMP 증폭으로부터의 실시간 형광 신호를 보여준다. 비강 면봉을 루프-디-루프 RT-LAMP 시약 안으로 직접적으로 용리하고 반응 혼합물 안으로 4가지 농도로 희석했다. 1x 면봉은 이 테스트 구성에 사용된 샘플의 표준 농도를 단위 부피당 용리된 면봉의 단위로 나타낸다. 이 경우 SARS-CoV-2와 인간 RNA 프라이머 세트는 단일 튜브에 이중화되었다. 각 프라이머 세트에는 1개의 NBM-루프형 프라이머가 함유되어 있으며, 각각은 동일한 형광단 및 소광제 쌍(단일 형광 채널)으로 표지되어 있다. 그 결과는 SARS-CoV-2와 인간 RNA 둘 모두가 검출된 반응이 이중-증폭 신호를 특징으로 했다는 것이다. 두 표적이 모두 검출된 희석은 "이중 양성"으로 표지되고; 두 표적 중 하나의 검출을 초래한 것은 "단일 양성"; 두 표적 모두 검출되지 않은 것은 "이중 음성"으로 표지된다. 이 데이터는 이 코로나바이러스-양성 지원자의 면봉 샘플에 대해 실시간 루프-디-루프 RT-LAMP 검정이 반응에서 두 표적 모두를 검출하는데 필요한 것보다 적어도 370배 더 민감하다는 것을 입증하였다.
도 17은 음성 대상체로부터 얻은 비강 면봉에서 SARS-CoV-2에 특이적인 표적 서열의 루프-디-루프 증폭으로부터 얻은 실시간 형광 신호를 보여준다.
도 18은 SARS-CoV-2 및 인간 표적 서열의 다중화된 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여주고 루프-디-루프 반응의 특이성을 입증한다. SARS-CoV-2 및 인간 프라이머 세트 둘 모두는 FAM-표지된 프라이머를 사용하여 루프-디-루프에 대해 변형되었으므로 이중 양성 대조군은 2개 증폭 이벤트를 보여준다. RPPOS는 22개 비-표적 호흡기 병원체로부터의 유전 물질을 함유한 호흡기 병원체 패널 양성(Exact Diagnostics LLC)이다. PRNEG는 핵산이 없는 RPPOS 생성물에 대한 배경 매트릭스 대조군이다. 데이터는 SARS-CoV-2와 인간 표적을 검출하기 위한 루프-디-루프 RT-LAMP 반응이 표적-외 핵산을 증폭하지 않는다는 것을 보여준다.
도 19는 높은 C. 트라코마티스(Ct)(반응당 10,000 카피 상당) 및 높은 N. 고노레아(Ng)(반응당 10,000 카피 상당)를 함유하는 샘플의 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여준다.
도 20은 높은 C. 트라코마티스(Ct)(반응당 10,000 카피 당량) 및 낮은 N. 고노레아(Ng)를 함유하는 샘플의 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여준다.
도 21은 낮은 C. 트라코마티스(Ct) 및 낮은 N. 고노레아(Ng)을 함유하는 샘플의 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여준다.
도 22는 음성 대조군 ― 면봉 단독 대조군(왼쪽 2개 패널) 또는 완충액 단독 대조군(오른쪽 2개 패널)의 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여준다.
도 23은 BM-루프형 프라이머의 구조 및 BM-루프형 프라이머를 사용한 루프-디-루프 방법에서 DNA 증폭이 어떻게 진행되는지를 예시한다.
도 24는 플루오레세인(FAM)으로 표지된 내부 dT를 포함하는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 증폭으로부터의 용융 곡선을 제공한다. 용융 곡선은 비-증폭된 반응에 대해 양의 기울기(-d(RFU)/dT<0)를 나타내고, 양의 증폭에 대해 음의 기울기를 나타낸다.
도 25는 NBM-루프형 프라이머, 인간 POP7b-LB-Cy5를 사용한 증폭으로부터의 용융 곡선을 제공한다. 내부 Cy5는 가닥-대체 폴리머라제의 전방향 진행을 차단하므로 NBM-루프형 프라이머 구조와 함께 사용되는 차단 내부 변형이다.
도 26은 내부 Zen 소광제가 있는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 증폭으로부터의 용융 곡선을 제공한다. 내부 Zen 소광제는 가닥-대체 폴리머라제의 전방향 진행을 차단하므로 NBM-루프형 프라이머 구조와 함께 사용되는 차단 내부 변형이다.
도 27은 비-차단(상단) 또는 차단(하단) 변형이 있는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 가닥-대체 폴리머라제로의 증폭을 예시한다.
도 28a는 5'-FAM 형광단 및 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터의 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 28b는 5'-FAM 형광단 및 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 29a는 5'-HEX 형광단 및 내부 Onyx A(OQA) 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 29b는 5'-HEX 형광단 및 내부 Onyx A(OQA) 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 30a는 5'-VIC 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 30b는 5'-VIC 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 31a는 5'-ABY 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 31b는 5'-ABY 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 32a는 5'-QSY7 소광제 및 내부 dT-TAMRA를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 32b는 5'-QSY7 소광제 및 내부 dT-TAMRA를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 33a는 5'-JUN 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 33b는 5'-JUN 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 34a는 5'-QSY7 소광제 및 내부 dT-FAM 형광단; 또는 5'-FAM 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 34b는 5'-QSY7 소광제 및 내부 dT-FAM 형광단; 또는 5'-FAM 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 35a는 5'-HEX 형광단 및 내부 Onyx A(OQA) 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 35b는 5'-HEX 형광단과 내부 Onyx A(OQA) 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 36a는 5'-VIC 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 31b는 5'-VIC 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 37a는 5'-ABY 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 31b는 5'-ABY 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 38a는 5'-JUN 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM-루프형 프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 38b는 5'-JUN 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 39a는 5'-Yakima Yellow(YY) 형광단 및 내부 Zen 소광제를 함유하는 NBM- 또는 BM-루프형 프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 가닥 대체 폴리머라제가 제2 클램핑 및 선택적 스페이서 서열의 역 상보체를 합성한 후에 BM-루프형 프라이머 헤어핀이 열리므로 BM-루프형 프라이머로부터의 신호는 NBM-루프형 프라이머의 신호보다 더 밝아, 도 23에 묘사된 구성을 초래한다. NBM-루프형 프라이머에서 폴리머라제는 내부 Zen 소광제에 의해 차단되고 제2 클램핑 서열의 역상보체를 합성할 수 없어, 도 27에 묘사된 구성을 초래한다. 도 31b는 5'-Yakima Yellow(YY) 형광단 및 내부 Zen 소광제를 함유하는 NBM- 또는 BM-루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다. 용융 곡선은 제2 센서 분자가 Zen과 같은 차단 변형인 경우 BM-루프형 프라이머가 표적의 존재에서 실온으로 냉각된 경우에도 안정적인 개방형 프라이머 구성을 생성한다는 것을 입증한다. 대조적으로, NBM-루프형 프라이머는 실온으로 냉각될 때 형광을 발하지 않는 안정적인 헤어핀 구성을 유지한다.
도면은 단지 예시의 목적으로 본 발명의 다양한 실시형태를 묘사한다. 당업자는 본 명세서에 예시된 구조 및 방법의 대안적인 실시형태가 본 명세서에 기술된 발명의 원리로부터 벗어나지 않고 이용될 수 있다는 것을 다음의 논의로부터 쉽게 인식할 것이다.
도 2a는 인터칼레이팅 염료(SYTO)로 시각화된 클라미디아 트라코마티스(CT) 및 나이세리아 고노레아(NG)에 대한 LAMP 검정 결과를 제공한다. CT의 경우 적어도 5로그의 [DNA], NG의 경우 6로그 이상으로 증폭이 빠르다(<30분). NG 검정 분석 민감도(LOD50)는 PROBIT 분석에 의한 35cp/10μL 반응이다.
도 2b는 신규한 NBM-루프형 프라이머를 사용한 표적 증폭으로부터 판독을 제공한다. 결과는 SYTO 염료에 비해 최소한의 억제와 강화된 특이성으로 표적의 극도로 밝은 실시간 검출을 보여준다.
2c는 신규한 NBM-루프형 프라이머를 사용한 나이세리아 고노레아의 검출을 제공한다. 결과는 방법이 반복가능하며 빠르고 강력하며 높은 신호-대-잡음비 증폭을 생성한다는 것을 보여준다. 프로브는 허위 양성을 제거한다.
도 3은 50% 치환에서 FAM-표지된 LF 프라이머를 갖는 루프-디-루프 방법을 사용하여 클라미디아 트라코마티스의 표적 핵산의 증폭을 나타내는 시간에 걸친 실시간 형광 신호의 플롯이다. 양성 샘플과 음성 샘플 둘 모두는 오른쪽 표에 표시된 대로 테스트되었다. y-축 상의 각 "주기"는 섭씨 65도에서 30초의 경과 시간을 나타낸다.
도 4는 50% 치환에서 FAM-표지된 LF 프라이머를 갖는 루프-디-루프 방법을 사용하여 나이세리아 고노레아의 표적 핵산의 증폭을 나타내는 시간에 걸친 실시간 형광 신호의 플롯이다. 양성 샘플과 음성 샘플 둘 모두는 오른쪽 표에 표시된 대로 테스트되었다. y-축 상의 각 "주기"는 섭씨 65도에서 30초의 경과 시간을 나타낸다.
도 5는 50% 치환에서 FAM-표지된 LF 프라이머를 갖는 루프-디-루프 방법을 사용하여 호모 사피엔스의 표적 핵산의 증폭을 나타내는 시간에 걸친 실시간 형광 신호의 플롯이다. 양성 샘플과 음성 샘플 둘 모두는 오른쪽 표에 표시된 대로 테스트되었다. y-축 상의 각 "주기"는 섭씨 65도에서 30초의 경과 시간을 나타낸다.
도 6은 NBM-루프형 프라이머로 4개의 양성(왼쪽) 및 4개의 음성(오른쪽) 반응을 함유하는 튜브의 이미지를 제공한다. 형광은 파란색 LED로 여기되고 파란색 젤 필터를 통해 빛나고 방출은 카메라폰에 올려진 호박색 플라스틱 필터로 시각화되었다.
도 7은 PCR 튜브에서 동결건조에 의해 제조된 클라미디아 트라코마티스(상단), 나이세리아 고노레아(중앙) 및 호모 사피엔스(하단)에 대한 NBM-루프형 프라이머 검정을 위한 건조된(동결건조된) 혼합물을 함유한 튜브의 이미지를 제공한다.
도 8은 사용 전 재구성된 도 7의 건조된 혼합물을 사용한 루프-디-루프 반응에서 클라미디아 트라코마티스, 나이세리아 고노레아 및 호모 사피엔스의 표적 핵산의 증폭을 나타내는 실시간 형광 신호를 제공한다. 결과는 건조된 다음 재구성된 프라이머의 유지된 검정 활성 및 민감도를 보여준다.
도 9a(제1 테스트) 및 9b(제2 테스트)는 다양한 온도에 설정된 POP7b(H. 사피엔스 RNA 전사체) 또는 ORF1ab(SARS-CoV-2 게놈 RNA) 프라이머를 사용하여 루프-디-루프 LAMP 반응으로부터 결과를 얻는데 필요한 시간을 플롯팅한다.
도 10은 H. 사피엔스, C. 트라코마티스, N. 고노레아 또는 SARS-CoV-2로부터 DNA를 표적화하는 NBM-루프형 프라이머의 용융 곡선을 제공한다. NBM-루프형 프라이머는 반응 온도인 65℃보다 약 10℃ 높게 풀리도록 설계되었다. 곡선은 루프-디-루프 프라이머의 스템-루프 서열이 형광 신호를 담당한다는 것을 입증한다.
도 11은 25%, 50% 또는 100% 강도에서 NBM-루프형 프라이머를 사용한 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 이 맥락에서 "강도"는 루프-디-루프 방법에 대해 프라이머가 루프 버전으로 치환되는 정도이다. 데이터는 더 강한 프라이머가 결과까지의 시간에서 1-2분의 감속 대신 더 큰 신호를 제공하는 경향이 있다는 것을 보여준다. 100% 강도에서 루프-디-루프 프라이머는 검정을 느리게 했지만 다른 실시간 LAMP 변위 프로브 방법의 정도에는 거의 미치지 못했다. y-축 상의 각 "주기"는 섭씨 65도에서 30초의 경과 시간을 나타낸다.
도 12는 0.4μM NBM-루프형 프라이머와 2μM SYTO 인터칼레이팅 염료 둘 모두를 포함하는 루프-디-루프 반응으로부터의 상대 형광 신호를 제공한다. 2-채널 형광 데이터는 인터칼레이팅 염료(SYTO) 및 루프-디-루프 신호의 전개에 대한 타이밍이 동일함을 입증한다. 루프-디-루프 대 인터칼레이팅 염료로는 신호 지연이 없었으며 루프-디-루프 반응은 SYTO보다 더 큰 신호를 제공했다.
도 13a 및 13b는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 클라미디아 트라코마티스의 표적 서열의 증폭으로부터 실시간 형광 신호를 보여준다. 도 13a는 신선하게 혼합된 반응 혼합물로부터 결과이고, 도 13b는 동결-건조된 반응 혼합물로부터 결과이다. 동결-건조된 검정 혼합물은 3개월 초과 안정적이었고 양호한 판독값을 제공했다. 검정은 검정(20.7 카피/μL)의 LoD95(낮은 양성)에서 각각의 Ct E BOUR(클라미디아 트라코마티스 균주) 14회 반복 플러스 2개의 주형 없음 대조군(NTC)으로 실행되었다. 신선한 반응 혼합물과 동건-조된된 반응 혼합물 사이에 민감도(LoD95에서 각각 12/14) 또는 결과까지 평균 시간(16분, T-테스트, P-값 = 0.66)에는 변화가 없었다.
도 14a, 14b 및 14c는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 단일 튜브 반응(단일 포트)에서 SARS-CoV-2 및 인간 표적 서열의 루프-디-루프 증폭으로부터 스펙트럼적으로 이중화된 형광 신호를 보여준다. 점선 신호는 SARS-CoV-2(FAM)로부터의 것이고 실선 신호는 인간 내부 대조군(Cy5)으로부터의 것이다. 3가지 유형의 샘플이 사용되었다 ― 표적 서열이 없는 대조군 샘플(도 14a), 조 인간 비강 면봉(도 14b), 및 열-불활성화된 SARS-CoV-2(게놈 RNA 표적 서열이 있는 온전한 바이러스)와 조합된 조 인간 비강 면봉(도 14c). 데이터는 표적 서열의 존재에서만 특정 증폭 신호를 보여준다. 데이터는 단일 반응 용기에서 루프-디-루프 방법으로 반응의 스펙트럼 다중화를 추가로 입증한다.
도 15a는 다양한 농도의 POP7b 프라이머에서 루프-디-루프 증폭으로부터의 실시간 형광 신호를 보여준다. POP7b 프라이머의 농도가 감소함에 따라 신호 강도가 감소했다(화살표). 단일 반응 부피에 하나 초과의 프라이머 세트를 갖는 다중화 적용에서, 프라이머 100%가 단일 세트에 속하는 반응에 비해 임의의 주어진 프라이머 세트의 농도가 감소했다. 도 15b는 다양한 농도의 POP7b 프라이머에서 결과까지의 시간(분)을 플롯팅한다. 프라이머 농도가 40% 미만으로 떨어지면 결과까지의 시간이 영향을 받았는데, 이는 단일 튜브에서 2개 초과의 표적을 다중화하는 이점이 속도에 대한 임상적 또는 시장-기반 요구보다 더 큰 많은 적용에 대해 허용될 수 있다. 반응에서는, 21μL 반응 부피에 10-4gBlock DNA가 사용되었다.
도 16은 코로나바이러스-양성 대상체로부터 얻은 처리되지 않은 비강 면봉에서, SARS-CoV-2(ORF1ab)에 특이적인 RNA 표적 서열, 호모 사피엔스(POP7b)에 특이적인 RNA 표적 서열, 두 표적 모두, 또는 어느 표적도 없는 루프-디-루프 RT-LAMP 증폭으로부터의 실시간 형광 신호를 보여준다. 비강 면봉을 루프-디-루프 RT-LAMP 시약 안으로 직접적으로 용리하고 반응 혼합물 안으로 4가지 농도로 희석했다. 1x 면봉은 이 테스트 구성에 사용된 샘플의 표준 농도를 단위 부피당 용리된 면봉의 단위로 나타낸다. 이 경우 SARS-CoV-2와 인간 RNA 프라이머 세트는 단일 튜브에 이중화되었다. 각 프라이머 세트에는 1개의 NBM-루프형 프라이머가 함유되어 있으며, 각각은 동일한 형광단 및 소광제 쌍(단일 형광 채널)으로 표지되어 있다. 그 결과는 SARS-CoV-2와 인간 RNA 둘 모두가 검출된 반응이 이중-증폭 신호를 특징으로 했다는 것이다. 두 표적이 모두 검출된 희석은 "이중 양성"으로 표지되고; 두 표적 중 하나의 검출을 초래한 것은 "단일 양성"; 두 표적 모두 검출되지 않은 것은 "이중 음성"으로 표지된다. 이 데이터는 이 코로나바이러스-양성 지원자의 면봉 샘플에 대해 실시간 루프-디-루프 RT-LAMP 검정이 반응에서 두 표적 모두를 검출하는데 필요한 것보다 적어도 370배 더 민감하다는 것을 입증하였다.
도 17은 음성 대상체로부터 얻은 비강 면봉에서 SARS-CoV-2에 특이적인 표적 서열의 루프-디-루프 증폭으로부터 얻은 실시간 형광 신호를 보여준다.
도 18은 SARS-CoV-2 및 인간 표적 서열의 다중화된 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여주고 루프-디-루프 반응의 특이성을 입증한다. SARS-CoV-2 및 인간 프라이머 세트 둘 모두는 FAM-표지된 프라이머를 사용하여 루프-디-루프에 대해 변형되었으므로 이중 양성 대조군은 2개 증폭 이벤트를 보여준다. RPPOS는 22개 비-표적 호흡기 병원체로부터의 유전 물질을 함유한 호흡기 병원체 패널 양성(Exact Diagnostics LLC)이다. PRNEG는 핵산이 없는 RPPOS 생성물에 대한 배경 매트릭스 대조군이다. 데이터는 SARS-CoV-2와 인간 표적을 검출하기 위한 루프-디-루프 RT-LAMP 반응이 표적-외 핵산을 증폭하지 않는다는 것을 보여준다.
도 19는 높은 C. 트라코마티스(Ct)(반응당 10,000 카피 상당) 및 높은 N. 고노레아(Ng)(반응당 10,000 카피 상당)를 함유하는 샘플의 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여준다.
도 20은 높은 C. 트라코마티스(Ct)(반응당 10,000 카피 당량) 및 낮은 N. 고노레아(Ng)를 함유하는 샘플의 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여준다.
도 21은 낮은 C. 트라코마티스(Ct) 및 낮은 N. 고노레아(Ng)을 함유하는 샘플의 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여준다.
도 22는 음성 대조군 ― 면봉 단독 대조군(왼쪽 2개 패널) 또는 완충액 단독 대조군(오른쪽 2개 패널)의 루프-디-루프 증폭으로부터의 형광 신호를 보여준다.
도 23은 BM-루프형 프라이머의 구조 및 BM-루프형 프라이머를 사용한 루프-디-루프 방법에서 DNA 증폭이 어떻게 진행되는지를 예시한다.
도 24는 플루오레세인(FAM)으로 표지된 내부 dT를 포함하는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 증폭으로부터의 용융 곡선을 제공한다. 용융 곡선은 비-증폭된 반응에 대해 양의 기울기(-d(RFU)/dT<0)를 나타내고, 양의 증폭에 대해 음의 기울기를 나타낸다.
도 25는 NBM-루프형 프라이머, 인간 POP7b-LB-Cy5를 사용한 증폭으로부터의 용융 곡선을 제공한다. 내부 Cy5는 가닥-대체 폴리머라제의 전방향 진행을 차단하므로 NBM-루프형 프라이머 구조와 함께 사용되는 차단 내부 변형이다.
도 26은 내부 Zen 소광제가 있는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 증폭으로부터의 용융 곡선을 제공한다. 내부 Zen 소광제는 가닥-대체 폴리머라제의 전방향 진행을 차단하므로 NBM-루프형 프라이머 구조와 함께 사용되는 차단 내부 변형이다.
도 27은 비-차단(상단) 또는 차단(하단) 변형이 있는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 가닥-대체 폴리머라제로의 증폭을 예시한다.
도 28a는 5'-FAM 형광단 및 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터의 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 28b는 5'-FAM 형광단 및 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 29a는 5'-HEX 형광단 및 내부 Onyx A(OQA) 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 29b는 5'-HEX 형광단 및 내부 Onyx A(OQA) 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 30a는 5'-VIC 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 30b는 5'-VIC 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 31a는 5'-ABY 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 31b는 5'-ABY 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 32a는 5'-QSY7 소광제 및 내부 dT-TAMRA를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 32b는 5'-QSY7 소광제 및 내부 dT-TAMRA를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 33a는 5'-JUN 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 33b는 5'-JUN 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 BM 또는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 34a는 5'-QSY7 소광제 및 내부 dT-FAM 형광단; 또는 5'-FAM 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 34b는 5'-QSY7 소광제 및 내부 dT-FAM 형광단; 또는 5'-FAM 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 35a는 5'-HEX 형광단 및 내부 Onyx A(OQA) 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 35b는 5'-HEX 형광단과 내부 Onyx A(OQA) 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 36a는 5'-VIC 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 31b는 5'-VIC 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 37a는 5'-ABY 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 31b는 5'-ABY 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 38a는 5'-JUN 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM-루프형 프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 도 38b는 5'-JUN 형광단 및 내부 dT-QSY7 소광제를 함유하는 NBM 루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다.
도 39a는 5'-Yakima Yellow(YY) 형광단 및 내부 Zen 소광제를 함유하는 NBM- 또는 BM-루프형 프라이머를 사용하여 루프-디-루프 반응으로부터 실시간 형광 신호를 제공한다. 가닥 대체 폴리머라제가 제2 클램핑 및 선택적 스페이서 서열의 역 상보체를 합성한 후에 BM-루프형 프라이머 헤어핀이 열리므로 BM-루프형 프라이머로부터의 신호는 NBM-루프형 프라이머의 신호보다 더 밝아, 도 23에 묘사된 구성을 초래한다. NBM-루프형 프라이머에서 폴리머라제는 내부 Zen 소광제에 의해 차단되고 제2 클램핑 서열의 역상보체를 합성할 수 없어, 도 27에 묘사된 구성을 초래한다. 도 31b는 5'-Yakima Yellow(YY) 형광단 및 내부 Zen 소광제를 함유하는 NBM- 또는 BM-루프형-프라이머의 용융 곡선을 제공한다. 용융 곡선은 제2 센서 분자가 Zen과 같은 차단 변형인 경우 BM-루프형 프라이머가 표적의 존재에서 실온으로 냉각된 경우에도 안정적인 개방형 프라이머 구성을 생성한다는 것을 입증한다. 대조적으로, NBM-루프형 프라이머는 실온으로 냉각될 때 형광을 발하지 않는 안정적인 헤어핀 구성을 유지한다.
도면은 단지 예시의 목적으로 본 발명의 다양한 실시형태를 묘사한다. 당업자는 본 명세서에 예시된 구조 및 방법의 대안적인 실시형태가 본 명세서에 기술된 발명의 원리로부터 벗어나지 않고 이용될 수 있다는 것을 다음의 논의로부터 쉽게 인식할 것이다.
6.1. 정의
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용된 다음 용어는 아래에 부여된 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 용어 "바이오센서 쌍"은 두 센서 분자 사이의 특정 물리적 상호작용 시 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 센서 분자의 쌍을 지칭한다. 예를 들어, 바이오센서 쌍은 형광 공명 에너지 전달(FRET)과 같은 푀르스터 공명 에너지 전달에 사용되는 공여체 분자와 수용체 분자의 쌍일 수 있다. 이 경우, 형광 신호는 공여체 분자에서 수용체 분자로의 거리-의존적 에너지 전달에 의해 생성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 바이오센서 쌍은 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)에 사용되는 한 쌍의 센서 분자이다. 이 경우, 생물발광 신호는 공여체 분자에서 수용체 분자로의 거리-의존적 에너지 전달에 의해 생성될 수 있다. 당업계에 공지된 다른 바이오센서 쌍이 본 개시내용의 다양한 실시형태에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "루프-디-루프 증폭" 또는 "LdL 증폭"은 거리-의존적 에너지 전달에 의해 형광 신호를 생성할 수 있는 루프형 프라이머를 사용한 표적 핵산의 증폭을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "루프형 프라이머"는 본 명세서에 기술된 LdL 증폭에 사용될 수 있는 프라이머를 지칭한다. 루프형 프라이머는 거리-의존적 에너지 전달에 의해 형광 신호를 생성할 수 있는 바이오센서 쌍을 포함한다. 루프형 프라이머는 BM-루프형 프라이머 또는 NBM-루프형 프라이머일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "NBM-루프형 프라이머"는 5'에서 3'으로 다음을 포함하는 루프형 프라이머를 지칭한다:
제1 센서 분자;
제1 클램핑 올리고뉴클레오티드;
이격 올리고뉴클레오티드;
제2 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 이격 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음;
제2 센서 분자,
여기서, 제1 센서 분자 및 제2 센서 분자는 제1 바이오센서 쌍임; 및
표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제1 프라이머 서열.
NBM-루프형 프라이머는 비-차단 변형에는 적합하지만 차단 변형에는 적합성이 낮거나 적합하지 않은 형태로 된다.
LdL 증폭이 NBM-루프형 프라이머로 수행되는 경우, 제2 센서 분자는 가닥 대체 폴리머라제의 전방향 진행을 차단할 수 있다. 따라서, 필수는 아니지만 제2 바이오센서로서 폴리머라제의 진행을 차단하지 않는 센서 분자(예를 들어, 화학적 부착을 위한 백본으로서 뉴클레오티드 염기(예를 들어, dT)를 활용하는 센서)를 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, NBM-루프형 프라이머에는 가닥 대체 폴리머라제의 전방향 진행을 부분적으로 차단하는 센서 분자가 포함된다. 일부 실시형태에서, NBM-루프형 프라이머에는 가닥 대체 폴리머라제의 전방향 진행을 차단하지 않는 센서 분자가 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "BM-루프형 프라이머"는 5'에서 3'으로 다음을 포함하는 루프형 프라이머를 지칭한다:
제1 센서 분자;
제1 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제1 이격 올리고뉴클레오티드;
제2 센서 분자,
여기서, 제1 센서 분자 및 제2 센서 분자는 제1 바이오센서 쌍임;
선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드;
제2 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제1 프라이머 서열.
BM-루프형 프라이머는 차단 변형과 비-차단 변형 둘 모두와 호환가능한 형태로 된다. 따라서, 일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 차단 변형(예를 들어, 폴리머라제의 진행을 차단하는 제2 센서 분자)을 포함한다. 일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 비-차단 변형(예를 들어, 폴리머라제의 진행을 차단하지 않는 제2 센서 분자)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "LOD"는 검출 한계를 지칭한다. 예를 들어 LOD95는 검출 한계, 95번째 백분위수이다. 이는 검정이 시간의 95% 양성 결과를 검출할 것으로 통계적으로 예상되는 표적의 농도이다.
6.2. 기타 해석 규칙
본 명세서에 언급된 범위는 언급된 평가변수를 포함하여 범위 내의 모든 값을 약칭하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 구성된 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
달리 명시하지 않는 한, 하나 이상의 입체중심을 갖는 화합물에 대한 언급은 각각의 입체이성질체, 및 그 입체이성질체의 모든 조합을 의도한다.
6.3. 루프형 프라이머
본 개시내용은 본 명세서에 기술된 LdL 증폭에 사용될 수 있는 루프형 프라이머를 제공한다. 루프형 프라이머는 거리-의존적 에너지 전달에 의해 형광 신호를 생성할 수 있는 바이오센서 쌍을 포함한다. 루프형 프라이머는 BM-루프형 프라이머 또는 NBM-루프형 프라이머일 수 있다.
NBM-루프형 프라이머
일 양태에서, 본 발명은 루프-디-루프 증폭을 위한 NBM-루프형 프라이머를 제공한다. NBM-루프형 프라이머는 5'에서 3'으로 다음을 포함한다:
제1 센서 분자;
제1 클램핑 올리고뉴클레오티드;
이격 올리고뉴클레오티드;
제2 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 이격 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음;
제2 센서 분자,
여기서, 제1 센서 분자 및 제2 센서 분자는 제1 바이오센서 쌍임; 및
표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제1 프라이머 서열.
일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있지만 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적이지는 않다.
제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 서로 상보적이어서 서로 결합할 수 있다. 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 이격 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 65℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 70℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 80℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 70 내지 80℃이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 72.5 내지 77.5℃이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 약 75℃이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60℃ 미만이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60 내지 65℃이다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 가닥 대체 폴리머라제를 사용한 검정의 연장 온도보다 10℃ 더 높다. 일부 실시형태에서, 용융 온도는 검정의 연장 온도보다 낮거나, 같거나, 임의의 양만큼 더 높다.
Tm이 반응의 연장 온도보다 낮을 때, 실시간 검출은 평가변수 검출(클램핑 서열의 Tm 근처 또는 그 이하로 반응을 냉각함)로 대체될 수 있으며, NBM-루프형 프라이머를 완전한 강도(100% 치환)로 사용하는 경우에도 반응이 억제되지 않을 수 있다.
Tm이 반응의 연장 온도와 동일할 때, 실시간 검출은 여전히 실행가능하지만 평가변수 결정을 위해 반응을 냉각할 때까지 배경 형광이 더 높을 수 있다.
Tm이 반응의 연장 온도보다 높을 때, 실시간 검출이 지배적인 작동 모드일 수 있으며 배경 형광이 최소화될 것이다.
일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 3 내지 10-뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 3 내지 7-뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 6-뉴클레오티드 길이이다. 전형적인 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 동일한 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 이격 올리고뉴클레오티드는 5 내지 35-뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 이격 올리고뉴클레오티드는 10 내지 20-뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 이격 올리고뉴클레오티드는 13 내지 18-뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 이격 올리고뉴클레오티드는 13-뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 함께 15 내지 35-뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 함께 20 내지 30-뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 함께 23 내지 28-뉴클레오티드 길이이다.
루프형 프라이머는 (i) 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 선택된 핵염기, (ii) 잠금 핵산, (iii) 2' O-메틸 RNA 염기, (iv) 포스포로티오화된 DNA 염기, (v) 포스포로티오화된 RNA 염기, (vi) 포스포로티오화된 2'-O-메틸 RNA 염기, 또는 (vii) 이의 조합을 포함할 수 있다. 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 이격 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 (i) 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 선택된 핵염기, (ii) 잠금 핵산, (iii) 2' O-메틸 RNA 염기, (iv) 포스포로티오화된 DNA 염기, (v) 포스포로티오화된 RNA 염기, (vi) 포스포로티오화된 2'-O-메틸 RNA 염기, 또는 (vii) 이의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, NBM-루프형 프라이머는 루프형 프라이머의 5' 말단에 제1 추가 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, NBM-루프형 프라이머는 제1 센서 분자와 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드 사이에 제2 추가 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 추가 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열이다.
일부 실시형태에서, NBM-루프형 프라이머는 루프형 프라이머의 5' 말단에 추가로 바코드 서열, 프로브 서열 또는 다른 서열을 추가로 포함한다. 추가 서열은 핵염기 또는 이의 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 병원체 게놈에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 클라미디아 트라코마티스에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 orf8 또는 cds2로부터의 것이다. 구체적으로, 표적 결합 부위는 서열번호: 15의 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 나이세리아 고노레아에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 porA 또는 glnA로부터의 것이다. 구체적으로, 표적 결합 부위는 서열번호: 5 또는 7의 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 호모 사피엔스에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 tbc1d3로부터의 것이다. 구체적으로, 표적 결합 부위는 서열번호: 22의 서열을 가질 수 있다.
BM-루프형 프라이머
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 BM-루프형 프라이머를 제공한다. BM-루프형 프라이머는 5'에서 3'으로 다음을 포함한다:
제1 센서 분자;
제1 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제1 이격 올리고뉴클레오티드;
제2 센서 분자,
여기서, 제1 센서 분자 및 제2 센서 분자는 제1 바이오센서 쌍임;
선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드;
제2 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제1 프라이머 서열.
NBM-루프형 프라이머 및 BM-루프형 프라이머는 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드에 비해 다른 위치에서 제2 센서 분자를 포함한다.
NBM-루프형 프라이머와 비교하여, BM-루프형 프라이머는 그것이 헤어핀 구조를 형성할 때 더 먼 거리에서 제1 센서 분자와 제2 센서 분자를 포함한다. 그러나, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 형광 신호를 적절하게 소광시킬 수 있을 만큼 서로 물리적으로 여전히 충분히 가깝다.
제2 센서 분자는 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 있기 때문에, 등온 증폭 검정에서 가닥 대체 폴리머라제는 제2 센서 분자에 도달하기 전에 표적 서열과 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드에 대한 연속적인 상보적 서열을 합성할 수 있다. 생성된 이중 가닥 DNA의 섹션은 클램핑 서열보다 더 높은 용융 온도를 가지고, 개방형 루프(비-헤어핀) 구성이 따라서 훨씬 더 유리하다. 이로 인해 밝은 형광이 발생한다. 부가적으로, 개방형 구성은 실온을 포함한 넓은 온도 범위에 걸쳐서 안정적이다. 이 특성은 등온 증폭 검정에서 가닥 대체 폴리머라제의 전방향 진행을 차단하는 제2 센서 분자가 있는 경우에도 형광에 의한 평가변수 결정을 허용한다.
개방형 루프 구성은 제2 센서 분자와 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 사이에 추가 염기(즉, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드)를 추가함에 의해 더욱 안정화될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 제2 이격 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 제2 이격 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
일부 경우에, BM-루프형 프라이머는 평형 동안 센서 분자 사이의 물리적 거리에 의해 결정되는 소광 효율(효율 또는 푀르스터 공명 에너지 전달)과 개방형 구성에 존재하는 루프형 프라이머 분자의 비율 사이의 상충관계를 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드에 부분적으로 상보적이다.
일부 실시형태에서, 제1 이격 올리고뉴클레오티드 또는 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 구조에서 단일 가닥이다.
일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 프라이머 서열은 중첩된다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 프라이머 서열은 중첩되지 않고 별도의 서열이다.
일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 9개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 8개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 7개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 6개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 150Å 미만 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 9 내지 100Å 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 10 내지 50Å 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 20 내지 40Å 떨어져 있다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 25 내지 35Å 떨어져 있다.
일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 11개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 12개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 적어도 13개, 14개 또는 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 16개, 17개, 또는 18개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 19개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 20개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 60℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 65℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 80℃ 초과이다.
일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 60 내지 80℃이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70 내지 80℃이다. 일부 실시형태에서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70 내지 75℃이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 약 72℃이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60 내지 65℃이다.
일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60℃ 미만이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 70℃ 미만이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 80℃ 미만이다.
일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 (i) 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 선택된 핵염기, (ii) 잠금 핵산, (iii) 2' O-메틸 RNA 염기, (iv) 포스포로티오화된 DNA 염기, (v) 포스포로티오화된 RNA 염기, (vi) 포스포로티오화된 2'-O-메틸 RNA 염기, 또는 (vii) 이의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 (i) 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 및 우라실로부터 선택된 핵염기, (ii) 잠금 핵산, (iii) 2' O-메틸 RNA 염기, (iv) 포스포로티오화된 DNA 염기, (v) 포스포로티오화된 RNA 염기, (vi) 포스포로티오화된 2'-O-메틸 RNA 염기, 및 (vii) 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 루프형 프라이머의 5' 말단에서 제1 추가 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 제1 센서 분자와 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드 사이에 제2 추가 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 추가 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열이다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 병원체 게놈에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 바이러스에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 호모 사피엔스에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 RNA 서열이다. 일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 서열번호: 25의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 서열번호: 26의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 POP7b를 인코딩하는 RNA 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 tbc1d3로부터의 것이다.
센서 분자
당업계에 공지된 다양한 바이오센서가 본 명세서에 기술된 NBM 또는 BM-루프형 프라이머 안으로 통합될 수 있다. 예를 들어, 가까이 근접한 또는 충분한 거리에서 색상을 변경하거나 검출가능한 신호를 생성하는 한 쌍의 분자(예를 들어, 발광 단백질을 기반으로 하는 NanoLuc, Nanobit, NonoBRET 기술)가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 바이오센서 쌍은 에너지 공여체 및 수용체 쌍이다. 일부 실시형태에서, 제1 바이오센서 쌍은 푀르스터 공명 에너지 전달을 위한 에너지 공여체 및 수용체 쌍이다. 일부 실시형태에서, 제1 바이오센서 쌍은 형광 공명 에너지 전달(FRET) 또는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)을 위한 에너지 공여체 및 수용체 쌍이다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자는 FRET 형광단이고, 제2 센서 분자는 FRET 소광제이다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자는 FRET 소광제이고, 제2 센서 분자는 FRET 형광단이다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자는 BRET 에너지 공여체이고, 제2 센서 분자는 BRET 에너지 수용체이다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자는 BRET 에너지 수용체이고, 제2 센서 분자는 BRET 에너지 공여체이다.
일부 실시형태에서, FRET 소광제는 5' Iowa Black® FQ라는 상표명으로 Integrated DNA 기술로부터 이용가능한 5IABkFQ이다. 5' Iowa Black® FQ는 531nm에서 피크 흡광도를 갖는, 420 내지 620nm의 범위인 넓은 흡광도 스펙트럼을 갖는 FRET 소광제이다. 이 소광제는 녹색에서 분홍색 스펙트럼 범위에서 방출되는 플루오레세인 및 기타 형광성 염료와 함께 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 소광제는 임의의 Black Hole Quenchers®(Biosearch Technologies로부터 이용가능), 어느 하나의 Iowa Black® 소광제(Integrated DNA 기술로부터 이용가능), Zen® 소광제(Integrated DNA Technologies로부터 이용가능), 임의의 Onyx® 소광제(Millipore-Sigma로부터 이용가능) 또는 임의의 ATTO® 소광제(ATTO-TEC GmbH로부터 이용가능)이다.
일부 실시형태에서, FRET 형광단은 Int 6-FAM(Azide)이라는 명칭으로 Integrated DNA 기술로부터 이용가능한 i6-FAMK(FAM(플루오레세인) 아지드)이다. 이 형태의 FAM은 클릭 화학을 사용하여 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 이 변형의 내부 버전은 dT 염기를 통해 올리고에 부착될 수 있다. dT 뉴클레오티드는 변형의 위치에 추가될 수 있다. 대안적으로, 여분의 뉴클레오티드 추가를 피하기 위해, 서열에 존재하는 T 뉴클레오티드는 필요한 변형으로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 형광단은 Cy3, Cy5, TAMRA, 또는 Yakima Yellow®(Integrated DNA Technologies로부터 이용가능)이다.
일 실시형태에서, 루프형 프라이머는 내부 소광제(예를 들어, Zen® 또는 Onyx A®) 및 5' 형광단(예를 들어, Yakima Yellow® 또는 HEX)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 검출가능한 광 신호를 생성하는 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 헤어핀 구조가 형성될 때 유의하게 감소된 광 신호를 생성한다.
NBM-루프형 프라이머의 다양한 실시형태에서, 헤어핀 구조에서 제1 센서 분자와 제2 센서 분자 사이의 거리는 0이다. 실시형태에서, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자 사이의 소광은 "접촉 소광"으로 인해 발생할 수 있다.
BM-루프형 프라이머의 다양한 실시형태에서, 헤어핀 구조에서 제1 센서 분자와 제2 센서 분자 사이의 거리는 0보다 크다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자 사이의 거리는 접촉 소광을 보장하기에는 서로 너무 멀리 떨어져 있다. 실시형태에서, 푀르스터 공명 에너지 전달(FRET)이 소광을 위한 지배적인 방법일 수 있다. 일부 실시형태에서, 거리는 5 내지 200 옹스트롬의 범위, 바람직하게는 10 내지 100 옹스트롬의 범위이다. 일부 실시형태에서, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자 사이의 거리의 3 내지 30 염기는 소광 효과를 제공한다.
일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 티민(T)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 티미딘에 부착된다. 제2 센서 분자는 디옥시티미딘에 부착된다.
일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 티민(T) 이외의 부위에 부착된다. 일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 티미딘 이외의 부위에 부착된다. 일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 디옥시티미딘 이외의 부위에 부착된다.
일부 실시형태에서, 제1 센서 및 제2 센서 분자는 제작 효율성 및 상업적 이용가능성을 기반으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 제2 센서는 가닥 대체 폴리머라제의 그 차단을 기반으로 선택된다. 따라서, 제2 센서의 선택은 가닥 대체 폴리머라제에 의존하여 달라질 수 있다.
예를 들어, 제작 과정 동안 내부 소광제가 제2 센서 분자로 바람직할 수 있다. 내부 소광제는 일반적으로 대부분의 올리고뉴클레오티드 제조업체에 의해 제공되고 임의의 합성-후 반응 없이 합성에 추가될 수 있다. 대조적으로, dT(또는 다른 염기, 그러나 훨씬 덜 일반적임)에 내부적으로 올리고뉴클레오티드에 추가된 대부분의 형광단은 합성-후 변형이 필요하다. 형광단이 차단 변형으로 내부로 삽입된 경우, 소광제는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 추가되어야 한다. 5' 소광제 변형은 덜 일반적으로는 제조업체에 의해 제공된다. 이들 이유로 내부 소광제가 제2 센서 분자로 바람직할 수 있다. 이는 결코 방법의 요구사항은 아니지만 상업적인 고려사항이다.
일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 가닥 대체 폴리머라제를 차단할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 가닥 대체 폴리머라제를 차단하지 않는다. 예를 들어, 일부 센서 분자(예를 들어, Thermo Fisher로부터의 QSY7)는 dT 염기에 사전-결합되어 차단하지 않는다. 비-차단 센서 분자가 NBM-루프형 프라이머에 대해 바람직하게 사용되지만 필수는 아니다. BM-루프형 프라이머의 경우, 어느 하나의 차단 또는 비-차단 센서 분자가 제2 센서 분자로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 차단 센서 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, BM-루프형 프라이머는 비-차단 센서 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성 동안 생성하는데 고도로 효율적인, 5' 형광단의 아미다이트 연결(예를 들어, Yakima Yellow 또는 HEX 같은 플루오레세인 유형 형광단의 포스포라미다이트)을 사용하여 생성된다.
일부 실시형태에서, 제2 센서 분자는 티민의 연결 해제 TAMRA(비-차단)이다.
일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 가닥 대체 폴리머라제를 차단할 수 있는 제2 센서 분자를 갖는 HEX, Yakima Yellow 및 TAMRA와 같은 5' 아미다이트 형광단을 포함한다.
6.4. 루프-디-루프 증폭을 위한 프라이머 혼합물
또 다른 양태에서, 본 발명은 루프-디-루프 증폭을 위한 프라이머 혼합물을 제공한다. 프라이머 혼합물은 본 명세서에 제공된 루프형 프라이머를 포함한다. 프라이머 혼합물은 NBM-루프형 프라이머, BM-루프형 프라이머, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 하나의 루프형 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 2개 이상의 루프형 프라이머를 포함한다.
2개 이상의 루프형 프라이머를 함유하는 경우, 혼합물에서 프라이머는 단일 표적 서열 또는 다중 표적 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 루프형 프라이머는 다중 공급원으로부터 표적 서열을 검출하도록 설계된다. 예를 들어, 혼합물은 복수의 병원체로부터 표적 서열을 검출하도록 설계된 복수의 루프형 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 단일 병원체로부터 다중 표적 서열을 검출하도록 설계된 복수의 루프형 프라이머를 포함한다.
일부 실시형태에서, 혼합물에서 모든 루프형 프라이머는 BM-루프형 프라이머이다. 일부 실시형태에서, 혼합물에서 모든 루프형 프라이머는 NBM-루프형 프라이머이다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 하나 이상의 NBM-루프형 프라이머 및 하나 이상의 BM-루프형 프라이머를 포함한다.
프라이머 혼합물은 증폭 반응을 위한 추가 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머 혼합물은 (i) 전방 내부 프라이머(FIP), (ii) 후방 내부 프라이머(BIP), (iii) 전방 프라이머(F3) 및 후방 프라이머(B3)를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 FIP, BIP, F3 및 B3는 표적 서열 상의 6개 서로 다른 결합 부위에 결합한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 루프 전방 프라이머(LF) 및 (ii) 루프 후방 프라이머(LB)를 추가로 포함하며, 여기서 LF와 LB는 표적 서열 상의 2개 서로 다른 결합 부위에 결합한다. 일부 실시형태에서, 추가 프라이머 중 하나, 예를 들어 FIP, BIP, F3, B3, LF 또는 LB는 제1 결합 부위, 즉 루프형 프라이머와 동일한 표적 서열 상의 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 하나의 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 본 명세서에 제공된 루프-디-루프 증폭을 위한 루프형 프라이머(BM-루프형 프라이머 또는 NBM-루프형 프라이머), (i) 전방 내부 프라이머(FIP), (ii) 후방 내부 프라이머(BIP), (iii) 전방 프라이머(F3) 및 (iv) 후방 프라이머(B3)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 (i) 루프 전방 프라이머(LF) 및 (ii) 루프 후방 프라이머(LB)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 본 명세서에 제공된 루프-디-루프 증폭을 위한 루프형 프라이머, 및 (i) 전방 내부 프라이머(FIP), (ii) 후방 내부 프라이머(BIP), (iii) 전방 프라이머(F3) 및 (iv) 후방 프라이머(B3)로부터 선택된 3개의 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, BIP, F3 및 B3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, FIP, F3 및 B3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, FIP, BIP 및 B3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, FIP, BIP 및 F3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 본 명세서에 제공된 루프-디-루프 증폭을 위한 루프형 프라이머, 및 (i) 전방 내부 프라이머(FIP), (ii) 후방 내부 프라이머(BIP), (iii) 전방 프라이머(F3), (iv) 후방 프라이머(B3), (v) 루프 전방 프라이머(LF) 및 (vi) 루프 후방 프라이머(LB)로부터 선택된 5개의 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, BIP, F3, B3, LF 및 LB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, FIP, F3, B3, LF 및 LB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, FIP, BIP, B3, LF 및 LB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, FIP, BIP, F3, LF 및 LB를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, FIP, BIP, F3, B3 및 LF를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 루프형 프라이머, FIP, BIP, F3, B3 및 LB를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 2개의 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서 프라이머 혼합물은 3개의 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 4개 또는 5개의 프라이머 세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 각 프라이머 세트는 고유한 표적 서열을 증폭하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 동일한 표적 서열을 증폭하기 위한 2개 이상의 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 동일한 표적 서열 상의 동일한 결합 부위에 결합하는 2개 이상의 루프형 프라이머를 포함한다.
루프형 프라이머는 증폭 반응에 최적화된 임의의 비율로 추가 프라이머와 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, FIP는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물에서 FIP와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1이다. 일부 실시형태에서, BIP는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물에서 BIP와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1이다. 일부 실시형태에서, LF는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물에서 LF와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1이다. 일부 실시형태에서, LB는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물에서 LB와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1이다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 나이세리아 고노레아에 특이적인 표적 서열을 검출하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, BIP는 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LF는 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 8의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시형태에서, F3는 서열번호: 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 8의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 서열번호: 5 또는 7의 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 클라미디아 트라코마티스에 특이적인 표적 서열을 검출하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 11의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, BIP는 서열번호: 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LF는 서열번호: 13의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 14의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시형태에서, F3는 서열번호: 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 11의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 13의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 14의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 서열번호: 15의 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 호모 사피엔스에 특이적인 표적 서열을 검출하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, F3는 서열번호: 16의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 17의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, BIP는 서열번호: 19의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LF는 서열번호: 20의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 21의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시형태에서, F3는 서열번호: 16의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 17의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 19의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 20의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 21의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프형 프라이머는 서열번호: 22의 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 바이러스에 특이적인 표적 서열을 검출하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 프라이머 혼합물은 다중 표적 서열의 검출을 위해 추가로 조합된다. 일부 실시형태에서, 다중 표적 서열은 다양한 유기체에 특이적이다. 예를 들어, 다중 표적 서열은 다양한 병원체에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 다중 표적 서열은 단일 유기체에 특이적이다.
따라서, 일부 실시형태에서 프라이머 혼합물은 제2 루프형 프라이머를 추가로 포함한다.
제2 루프형 프라이머는 다음을 포함하는 NBM-루프형 프라이머일 수 있다:
제3 센서 분자;
제3 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제3 이격 올리고뉴클레오티드;
제4 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제3 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제3 이격 올리고뉴클레오티드 및 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제3 및 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음;
제4 센서 분자,
여기서, 제3 센서 분자 및 제4 센서 분자는 제2 바이오센서 쌍이고, 제2 바이오센서 쌍은 제1 바이오센서 쌍과 상이함; 및
제2 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제2 프라이머 서열.
제2 루프형 프라이머는 다음을 포함하는 BM-루프형 프라이머일 수 있다:
제3 센서 분자;
제3 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제3 이격 올리고뉴클레오티드;
제4 센서 분자,
여기서, 제3 센서 분자 및 제4 센서 분자는 제2 바이오센서 쌍이고, 제2 바이오센서 쌍은 제1 바이오센서 쌍과 상이함;
선택적인 제4 이격 올리고뉴클레오티드;
제4 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제3 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제3 이격 올리고뉴클레오티드, 제4 센서 분자, 선택적인 제4 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제3 및 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
제2 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제2 프라이머 서열.
일부 실시형태에서, 제3 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 제3 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있지만 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적이지는 않다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 제2 전방 내부 프라이머(SFIP), (ii) 제2 후방 내부 프라이머(SBIP), (iii) 제2 전방 프라이머(SF3), 및 제2 후방 프라이머(SB3)를 추가로 포함하며, 여기서 SFIP, SBIP, SF3 및 SB3는 제2 표적 서열 상의 6개 서로 다른 결합 부위에 결합한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 제2 루프 전방 프라이머(SLF) 및 (ii) 제2 루프 후방 프라이머(SLB)를 추가로 포함하며, 여기서 SLF와 SLB는 제2 표적 서열 상의 2개 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 제3 루프형 프라이머를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제3 루프형 프라이머는 다음을 포함하는 NBM-루프형 프라이머이다:
제5 센서 분자;
제5 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제5 이격 올리고뉴클레오티드;
제6 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서, 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제5 이격 올리고뉴클레오티드 및 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제5 및 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음;
제6 센서 분자,
여기서, 제5 센서 분자 및 제6 센서 분자는 제3 바이오센서 쌍이고, 제3 바이오센서 쌍은 제1 바이오센서 쌍 및 제2 바이오센서 쌍과 상이함; 및
제3 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제2 프라이머 서열
일부 실시형태에서, 제3 루프형 프라이머는 다음을 포함하는 BM-루프형 프라이머이다:
제5 센서 분자;
제5 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제5 이격 올리고뉴클레오티드;
제6 센서 분자,
여기서, 제5 센서 분자 및 제6 센서 분자는 제3 바이오센서 쌍이고, 제3 바이오센서 쌍은 제1 바이오센서 쌍 또는 제2 바이오센서 쌍과 상이함;
선택적인 제6 이격 올리고뉴클레오티드;
제6 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서, 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제5 이격 올리고뉴클레오티드, 제6 센서 분자, 선택적인 제6 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제5 및 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
제3 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제3 프라이머 서열.
일부 실시형태에서, 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드에 결합하지만, 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적이지는 않다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 제3 전방 내부 프라이머(TFIP), (ii) 제3 후방 내부 프라이머(TBIP), (iii) 제3 전방 프라이머(TF3), 및 제3 후방 프라이머(TB3)를 추가로 포함하며, 여기서 TFIP, TBIP, TF3 및 TB3는 제3 표적 서열 상의 6개 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 (i) 제3 루프 전방 프라이머(TLF) 및 (ii) 제3 루프 후방 프라이머(TLB)를 포함하며, 여기서 TLF와 TLB는 제3 표적 서열 상의 2개 서로 다른 결합 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 루프형 프라이머를 포함한다. 프라이머 혼합물이 2개 이상의 루프형 프라이머를 포함하는 경우, 각 루프형 프라이머는 각각 검출을 위한 고유한 신호를 제공하는 고유한 바이오센서 쌍을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각 바이오센서 쌍은 검출을 위한 고유한 시각적 신호(예를 들어, 고유한 색상)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 각각의 바이오센서 쌍은 독특한 염료 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물에서 2개 이상의 루프형 프라이머는 동일한 바이오센서 쌍을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물에서 2개 이상의 루프형 프라이머는 FAM으로 표지된다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물에서 2개의 서로 다른 루프형 프라이머는 FAM으로 표지된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 프라이머 혼합물은 동결건조된다. 건조된 프라이머 혼합물은 본 명세서에 기술된 임의의 루퍼 프라이머 또는 프라이머 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 루프형 프라이머를 포함하는 프라이머 혼합물은 동결건조된다. 일부 실시형태에서, 프라이머 혼합물은 동결건조된 비드의 형태로 된다.
6.5. 루프-디-루프 증폭용 키트
또 다른 양태에서, 루프-디-루프 증폭용 키트가 제공된다. 키트는 본 명세서에 제공된 임의의 루프형 프라이머 또는 프라이머 혼합물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 하나의 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 본 명세서에 제공된 루프-디-루프 증폭을 위한 루프형 프라이머, (i) 전방 내부 프라이머(FIP), (ii) 후방 내부 프라이머(BIP), (iii) 전방 프라이머(F3) 및 후방 프라이머(B3)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 세트는 (i) 루프 전방 프라이머(LF) 및 (ii) 루프 후방 프라이머(LB)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 2개의 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서 키트는 3개의 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 4개 또는 5개의 프라이머 세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 단일 용기에 함유된 복수의 프라이머 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 복수의 프라이머 세트를 포함하며, 여기서 각 프라이머 세트는 개별적으로 별도의 용기에 함유되어 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 폴리머라제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머라제는 가닥-치환 DNA 폴리머라제이다. 일부 실시형태에서, 폴리머라제는 바실러스 스테아로테르모필루스 폴리머라제이다. 일부 실시형태에서, 폴리머라제는 Bst 2.0 WarnStart® DNA 폴리머라제(NEB로부터 이용가능)이다. 일부 실시형태에서, 키트는 2개 이상의 폴리머라제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 다른 반응 효소, 예를 들어 역전사효소를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 WarmStart® RTx 역전사효소(NEB로부터 이용가능)이다. 일부 실시형태에서, 키트는 RNase 억제제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, RNase 억제제는 돼지(porcine) 또는 쥐(murine) RNase 억제제이다.
일부 실시형태에서, 키트는 증폭 반응을 위한 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서 시약은 dNTP, MgSO4 및 완충액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 완충액은 계면활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 완충액은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%의 Tween-20을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 트레할로스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 수크로스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시약은 안정화를 위한 중합체를 포함한다. 증폭 시약은 폴리머라제에 의존하여 선택 및 최적화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 dNTP, MgSO4, 완충액, 루프-디-루프 증폭을 위한 하나 이상의 프라이머 세트 및 폴리머라제를 포함하는 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 dNTP, 루프-디-루프 증폭을 위한 하나 이상의 프라이머 세트, 폴리머라제, 역전사효소 및 RNase 억제제를 포함하는 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 혼합물은 액체 형태로 된다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 건조된 형태로 된다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 동결건조된 분말, 비드 또는 펠릿으로 제형화된다.
일부 실시형태에서, 키트는 증폭 반응을 위한 디바이스를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 루프형 프라이머-매개된 등온 증폭을 위한 디바이스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 증폭 반응을 실행하기 위한 반응 튜브를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 증폭 반응 전 샘플의 여과 또는 정제를 위한 성분을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 감염 질환의 진단을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 클라미디아 트라코마티스 및 나이세리아 고노레아와 같은 병원성 감염의 진단을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 및 점 돌연변이의 결정을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 키트는 돌연변이체 유전자형의 결정을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 키트는 약물-내성 표현형과 연관된 돌연변이체 유전자형을 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 약물 내성 마커, 예를 들어, 세프트리악손/세픽심 내성 마커, 퀴놀론(시프로플록사신) 내성 마커, 마크로라이드 내성 마커(아지스로마이신)가 검출될 수 있다.
6.6. 루프-디-루프 증폭 방법
다른 양태에서, 루프-디-루프 증폭 방법이 제공된다. 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
샘플을 제공하는 단계;
(i) 본 명세서에 제공된 프라이머, 프라이머 혼합물, 또는 건조된 프라이머 혼합물을 재수화하여 얻은 재구성된 프라이머 혼합물 및 (ii) 폴리머라제를 샘플에 추가하고, 이에 의해 반응 혼합물을 생성하는 단계; 및
반응 혼합물을 50-85℃에서 인큐베이션하는 단계.
반응 온도는 폴리머라제 및 표적 서열에 의존하여 조정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 50-70℃에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 55-70℃에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 60-65℃에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 62-65℃에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 60, 61, 62, 63, 64 또는 65℃에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 방법은 반응 혼합물로부터 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 형광 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 색상 또는 탁도의 변화를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 비-시각적 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출하는 단계는 인큐베이션의 단계 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 검출하는 단계는 인큐베이션의 단계가 완료된 후에 수행된다. 일부 실시형태에서, 신호는 실시간으로 검출된다. 일부 실시형태에서, 신호는 실시간으로 기록되고 인큐베이션의 단계의 완료 후 분석된다.
일부 실시형태에서, 방법은 루프-디-루프 증폭을 위한 샘플을 준비하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플을 준비하는 단계는 RNA 분자를 역전사효소와 상호작용시켜 DNA 분자를 포함하는 샘플을 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플을 준비하는 단계는 역전사효소와 상호작용시키기 전에 RNA 분자를 함유하는 샘플 또는 반응 혼합물을 예열하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서 루프-디-루프 증폭을 위한 샘플은 정제된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 정제된 RNA, 정제된 DNA, 전체 SARS-CoV-2 바이러스, 전체 인간 세포, 타액 또는 비강 면봉, 또는 비강 또는 비인두 면봉을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 질 면봉으로부터의 게놈 DNA, 합성 DNA, 전체 박테리아 또는 전체 인간 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 증폭을 위한 샘플은 조 샘플이다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 증폭을 위한 샘플은 정제된 샘플이다.
일부 실시형태에서, 하나 초과의 유형의 신호가 검출된다. 일부 실시형태에서, 다중 형광 또는 기타 시각적 신호가 검출된다. 일부 실시형태에서, 다중 표적 서열의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 다중 신호가 검출된다. 일부 실시형태에서, 단일 표적 서열의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 다중 신호가 검출된다. 일부 실시형태에서, 방법에 추가적인 민감도 및 특이성을 제공하기 위해 다중 신호가 검출된다.
표적 서열의 증폭을 위해, 당업계에 공지된 다양한 증폭 방법이 사용될 수 있다.
전형적인 실시형태에서, 루프 매개된 등온 증폭("LAMP")은 표적 핵산의 루프-디-루프 증폭에 사용된다. LAMP는 폴리머라제로 알려진 효소의 가닥 대체 활성에 의존하는 등온 DNA 증폭 방법이며, 이는 연장된 DNA 또는 RNA 가닥에 염기-특이적인 방식으로 뉴클레오티드 염기를 추가하여 상보적인 서열을 갖는 이중 가닥 핵산을 형성한다. 등온 증폭 방법에서, 지오바실러스 스테아로테르모필루스 박테리아(Bst 폴리머라제 및 그 변이체)로부터의 것과 같은 가닥 대체 폴리머라제는 상보적 가닥을 중합할 때 이중 가닥 DNA의 한 가닥을 대체하고, 따라서 열 순환이 필요하지 않다.
LAMP 방법은 표적 DNA 서열의 6개 별개의 영역을 인식하도록 특별히 설계된 4개의 서로 다른 프라이머(F3, B3, 내부 전방 프라이머 또는 FIP, 내부 후방 프라이머 또는 BIP)를 사용할 수 있다. 반응의 속도를 향상시키기 위해 2개의 추가 "루프" 프라이머를 추가할 수 있다. 반응 혼합물에서 프라이머의 농도는 다양할 수 있지만 전형적으로 FIP 및 BIP 프라이머의 경우 1.6μM, 전방 및 후방 루프 프라이머(LF, LB)의 경우 0.8μM, F3 및 B3 프라이머의 경우 0.2μM로 설정된다. LAMP 방법의 일부 실시형태에서, 5개의 프라이머가 활용될 수 있다(2개의 가능한 LAMP 프라이머 중 1개만 사용). LAMP 반응은 가닥 치환 반응을 사용하여 일정한 온도(대략 65℃)에서 진행된다. 샘플, 프라이머, 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 완충액 및 기질을 일정한 온도에서 인큐베이션함에 의해 표적의 증폭 및 검출이 한 단계로 완료될 수 있다. LAMP에 대한 전형적인 혼합물 구성은 다음 시약을 함유한다: 20mM Tris-HCL, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 8mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, 1.4mM dNTP, 0.32U/μL Bst 폴리머라제, 앞서 언급된 농도에서 프라이머, 및 20℃에서 pH가 8.8로 조정된 물. 반응 부피는 전형적으로 5μL 내지 50μL 사이이다. 반응의 온도는 사용되는 특정 효소와 프라이머에 최적화되어 있고, 반응은 5 내지 60분 동안 진행된다. LAMP는 매우 민감하고 특이적이고 효율적이다.
LAMP는 특정 DNA 또는 RNA 표적(RNA 표적은 먼저 DNA로의 역전사가 필요함)을 증폭시키기 위해 6개의 표적 부위(예를 들어, F3, B3, FIP 및 BIP)를 인식하는 적어도 4개의 프라이머에 의존한다. 루프 프라이머(예를 들어, LF, LB)가 포함되면, 표적 핵산에서의 고유한 부위 총 8개가 6개의 프라이머에 의해 인식된다. 본 명세서에 제공된 다양한 실시형태에서, 총 8개의 고유한 부위 중 하나가 본 명세서에 기술된 루프형 프라이머에 의해 인식될 수 있다. 샘플에 표적이 존재하는 경우, 증폭 반응이 일어나 대량의 DNA를 제공할 수 있다.
본 명세서에 기술된 신규한 루프-디-루프 방법은 LAMP 이외의 다른 등온 증폭 방법에 적용될 수 있다. 폴리머라제 연쇄반응(PCR)의 온도 순환 의존성을 해결하기 위해 다수의 등온 증폭 방법이 창출되었다. 이들 방법은 상당하게 다양할 수 있지만, 그 모두는 몇 가지 공통된 특성을 공유한다. 예를 들어, DNA 가닥은 열로 변성되지 않기 때문에 모든 등온 방법은 프라이머 결합 및 증폭 반응의 개시를 가능하게 하는 대안적인 접근법에 의존한다. 일단 반응이 개시되면 폴리머라제는 관심있는 서열에 아직 어닐링되어 있는 가닥을 대체해야 한다. 등온 방법은 전형적으로 이중 DNA를 분리하기 위해 DNA 폴리머라제의 가닥-대체 활성을 이용한다. 이 능력을 가진 폴리머라제에는 중간 온도 반응(25-40℃)을 위한 Klenow Fragment(3'-5' exo-), Bsu 대형 단편, 및 phi29, 및 더 높은 온도(50-65℃) 반응을 위한 Bst DNA 폴리머라제의 대형 단편이 포함된다. RNA 종을 검출하기 위해 반응의 온도와 호환되는 역전사효소를 첨가하여 증폭의 등온 특성을 유지한다. dsDNA를 분리하기 위한 가닥 대체 메커니즘 외에도 등온 방법은 개시를 위한 초기 변성 요구사항을 피하기 위해 효소 또는 프라이머 설계를 요할 수 있다.
상기에 논의된 바와 같이, 루프-매개된 등온 증폭(LAMP)은 표적 DNA의 6-8개의 별개 영역을 인식하는 4-6개의 프라이머를 사용한다. 가닥-대체 DNA 폴리머라제가 합성을 개시하고 프라이머 중 2개가 루프 구조를 형성하여 후속 증폭 라운드를 촉진한다. LAMP는 빠르고 민감하고, 증폭은 매우 광범위하여 LAMP는 현장 진단에 매우 적합하다. 루프-디-루프 프라이머는 단일 또는 임의의 조합이나 내부 및 또는 루프 프라이머에 사용될 수 있다.
가닥 대체 증폭(SDA)은 프라이머에 함유된 부위에서 가닥-제한된 제한 엔도뉴클레아제 또는 닉킹 효소에 의해 창출된 틈에서 개시하기 위해, 가닥-대체 DNA 폴리머라제, 전형적으로 Bst DNA 폴리머라제, 대형 단편 또는 Klenow 단편(3'-5' 엑소-)에 의존한다. SDA에는 전방 프라이머 1개와 후방 프라이머 1개뿐만 아니라, 범핑 전방 프라이머 1개와 범핑 역방향 프라이머 1개가 필요하다. 닉킹 부위는 각 폴리머라제 대체 단계로 재생성되어, 기하급수적인 증폭을 초래한다. SDA는 전형적으로 임상 진단에 사용된다. SDA에 대한 기존의 형광 모니터링 기술이 존재하지만(Nadeau et al., Real-Time, Sequence-specific detection of nucleic acids during strand displacement amplification, 276m 2 177-187 (1999)), 형광을 발생시키기 위해서는 제한 엔도뉴클레아제 효소의 작용에 의존한다. 전방 또는 역방향 SDA 프라이머 어느 하나는 루프-디-루프 방법과 함께 사용하도록 조정될 수 있으며, 이는 형광단과 소광제 쌍 사이에 절단 부위의 위치가 필요하지 않다. 절단 부위는 루프-디-루프 프라이머의 클램핑 서열 옆에, 프라이머의 3' 말단 방향으로 존재하여, 제한 엔도뉴클레아제에 의한 프라이머 절단 이전에, 상보성 가닥 상의 폴리머라제에 의해 프라이머의 5' 말단의 완전한 연장 시 형광이 생성된다.
헬리카제-의존적 증폭(HDA)은 헬리카제의 이중-가닥 DNA 풀림 활성을 이용하여 가닥을 분리하여, 가닥-대체 DNA 폴리머라제에 의한 프라이머 어닐링 및 연장을 가능하게 한다. PCR과 마찬가지로, 이 시스템에는 2개의 프라이머인, 1개의 전방 프라이머와 1개의 역방향 프라이머만 필요하다. HDA는 여러 진단 디바이스 및 FDA-승인된 테스트에 이용되었다. HDA에서의 프라이머 중 어느 하나가 실시간으로 반응의 실시간 폐쇄형 튜브 모니터링을 생성하도록 루프-디-루프 방법과 함께 사용하기 위해 조정될 수 있다. HDA에서 헬리카제 효소는 루프-디-루프 프라이머의 루프 구조를 열 수 있으며, 이는 단일 가닥 결합 단백질에 의해 안정화될 수 있고, 그런 다음 DNA 폴리머라제에 의해 이중-가닥의 형광 앰플리콘으로 전환된다.
닉킹 효소 증폭 반응(NEAR)은 닉킹 효소에 의해 창출된 닉에서 개시되는 가닥-대체 DNA 폴리머라제를 이용하여, 표적 서열로부터 많은 짧은 핵산을 신속하게 생성한다. 이 과정은 극히 빠르고 민감하여 수 분 안에 작은 표적 양을 검출할 수 있다. NEAR은 임상 및 생물안전 적용에서 병원체 검출에 일반적으로 사용된다. NEAR에 대한 전방 또는 역방향 프라이머 중 어느 하나는 루프-디-루프 방법을 사용하여 가닥 대체 DNA 폴리머라제에 의한 루프의 연장을 통해 실시간 형광을 생성할 수 있다.
6.7. 사용 방법
본 명세서에 제공된 루프-디-루프 증폭 방법을 사용하여 다양한 공급원으로부터 표적 서열을 검출할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 게놈, 박테리아 게놈, 고세균 게놈, 식물 게놈, 동물 게놈, 원생생물 게놈, 원핵생물 게놈 또는 진핵생물 게놈에 특이적인 표적 서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 RNA(예를 들어, 양성 센스 RNA, 음성 센스 RNA) 또는 DNA를 검출하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 방법은 합성적으로 생성된 표적 서열을 검출하는데 사용된다.
일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 병원체에 특이적인 DNA를 검출하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 또는 벌레이다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 STD와 연관된 병원체를 검출하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 병원체는 클라미디아 트라코마티스이다. 일부 실시형태에서, 병원체는 나이세리아 고노레아이다. 일부 실시형태에서, 병원체는 SARS-CoV-2이다.
일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 감염의 진단을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 돌연변이체 유전자형을 결정하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 약물-내성 표현형과 연관된 돌연변이체 유전자형을 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 약물 내성 마커, 예를 들어, 세프트리악손/세픽심 내성 마커, 퀴놀론(시프로플록사신) 내성 마커, 마크로라이드 내성 마커(아지스로마이신)가 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 결정을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 돌연변이의 결정을 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 단일 표적의 검출을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 하나 초과의 표적의 검출을 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 2, 3, 4, 또는 5개 표적의 검출을 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 샘플의 분석 또는 특성화를 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 루프-디-루프 방법은 샘플의 공급원을 식별하기 위해 사용된다. 예를 들어, 루프-디-루프 방법은 인간 샘플을 식별하기 위해 사용된다.
본 명세서에 기술된 루프-디-루프 방법은 다양한 샘플의 분석에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액, 소변, 정액, 조직 또는 타액 샘플이 분석된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 동물 또는 인간 환자로부터 수집된다. 일부 실시형태에서, 정제된 샘플이 분석된다. 일부 실시형태에서, 조 샘플이 분석된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 정제된 RNA, 정제된 DNA, 전체 SARS-CoV-2 바이러스, 전체 인간 세포, 타액 또는 비강 면봉, 또는 중비갑개 또는 비인두 면봉을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 질 면봉으로부터의 게놈 DNA, 합성 DNA, 전체 박테리아 또는 전체 인간 세포를 포함한다.
6.8. 실시예
다음 실시예는 제한이 아닌 예시의 방식로서 제공된다.
6.8.1. 실시예 1: 인터칼레이팅 염료(SYTO)를 사용한
클라미디아 트라코마티스
및
나이세리아 고노레아
에 대한 LAMP 검정
LAMP 반응 혼합물을 준비하여 클라미디아 트라코마티스 게놈 DNA 및 니세리아 고노레아 게놈 DNA를 별도로 검출했다. 반응물을 10μL 부피로 준비하였고 다음 시약을 함유하였다: 20mM Tris-HCL, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 8mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, 1.4mM dNTP, 0.32U/μL Bst 2.0 WarmStart® 폴리머라제, 1.6μM에서 FIP 및 BIP, 0.8μM에서 LF 및 LB, 0.2μM에서 F3 및 B3를 갖는 프라이머(서열번호: 1-4, 6, 8-14), 2.5μM SYTO 85 인터칼레이팅 염료, 및 20℃에서 pH를 8.8로 조정한 물. 표적 게놈 DNA는 ATCC에서 구입한 스톡 용액으로부터 pH 8.0 Tris-HCL 완충액에 10-배수 희석했다. 무 주형 대조군의 경우, 표적 DNA 또는 DNA-없는 완충액을 각 PCR 튜브 내 9μL의 용액 혼합물에 1μL로 추가했다. 반응의 온도는 65℃였으며, 반응은 SYTO 85 형광을 통해 모니터링되었다. 실시간 PCR 기계를 사용하여 반응을 가열하고 실시간으로 형광을 측정했다. 반응은 60분 동안 실행되었다. 도 2a에 도시된 데이터는 각각 3가지 수준의 게놈 DNA 표적―높음(스톡 농도), 낮음(Ct의 경우 스톡 DNA의 10-5 희석, Ng의 경우 스톡 DNA의 10-6 희석) 및 무 주형 대조군(무 DNA(NTC))에 대해, 인터칼레이팅 염료에 의해 모니터링한 클라미디아 트라코마티스(녹색) 및 나이세리아 고노레아(청색)에 대한 LAMP 반응으로부터 수직 축 상에 실시간 형광(임의 단위) 대 수평 축 상의 시간의 대표적인 곡선을 묘사한다.
6.8.2. 실시예 2: 루프-디-루프 증폭에 의한
클라미디아 트라코마티스
의 검출
루프-디-루프 LAMP 반응 혼합물을 제조하여 클라미디아 트라코마티스 게놈 DNA를 검출했다. 반응물을 10μL 부피로 준비하였고 다음 시약을 함유하였다: 20mM Tris-HCL, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 8mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, 1.4mM dNTP, 0.32U/μL Bst 2.0 WarmStart® 폴리머라제, 1.6μM에서 FIP 및 BIP, 0.4μM에서 LF 및 LF-LdL, 0.8μM에서 LB, 0.2μM에서 F3 및 B3를 갖는 프라이머(서열번호: 9-15) 및 20℃에서 pH가 8.8로 조정된 물. 정량된 표적 게놈 DNA를 ATCC에서 구입한 스톡 용액으로부터 pH 8.0 Tris-HCL 완충액에 10-배수 또는 2-배수(더 미세한 분해능을 위함) 희석했다. 무 주형 대조군의 경우, 표적 DNA 희석 또는 DNA-없는 완충액을 각 PCR 튜브 내 9μL의 용액 혼합물에 1μL로 추가하고, 농도당 최대 20개의 복제물을 여러-로그 농도 범위에 걸쳐 사용하여 검정 민감도를 살펴보았다. 반응의 온도는 65℃였고, 루프-디-루프 프라이머에 의해 발산되는 FAM 형광을 통해 반응을 모니터링했다. 실시간 PCR 기계를 사용하여 반응을 가열하고 실시간으로 형광을 측정했다. 반응은 60분 동안 실행되었다. 도 3에 도시된 데이터는 게놈 DNA 표적의 10-배수 희석에 대한 클라미디아 트라코마티스에 대한 루프-디-루프 LAMP 반응으로부터 수직 축 상의 실시간 형광(임의 단위) 대 수평 축 상의 시간(각 '주기'는 30초를 나타냄)의 대표적인 곡선을 묘사한다. 그런 다음 검정의 평가변수 결정을 기반으로 PROBIT 분석에 의해 검정 민감도(검출 한계, 50% 및 95% 확률)를 추정했다.
6.8.3. 실시예 3: 루프-디-루프 증폭에 의한
나이세리아 고노레아
의 검출
루프-디-루프 LAMP 반응 혼합물을 제조하여 나이세리아 고노레아 게놈 DNA를 검출했다. 반응물을 10μL 부피로 준비하였고 다음 시약을 함유하였다: 20mM Tris-HCL, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 8mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, 1.4mM dNTP, 0.32U/μL Bst 2.0 WarmStart® 폴리머라제, 1.6μM에서 FIP 및 BIP, 0.4μM에서 LF 및 LF-LdL, 0.8μM에서 LB, 0.2μM에서 F3 및 B3를 갖는 프라이머(서열번호: 1-4, 6-8) 및 20℃에서 pH가 8.8로 조정된 물. 정량된 표적 게놈 DNA를 ATCC에서 구입한 스톡 용액으로부터 pH 8.0 Tris-HCL 완충액에 10-배수 또는 2-배수(더 미세한 분해능을 위함) 희석했다. 무 주형 대조군의 경우, 표적 DNA 희석 또는 DNA-없는 완충액을 각 PCR 튜브 내 9μL의 용액 혼합물에 1μL로 추가하고, 농도당 최대 20개의 복제물을 여러-로그 농도 범위에 걸쳐 사용하여 검정 민감도를 살펴보았다. 반응 온도는 65℃였고, 루프-디-루프 프라이머에 의해 발산되는 FAM 형광을 통해 반응을 모니터링했다. 실시간 PCR 기계를 사용하여 반응을 가열하고 실시간으로 형광을 측정했다. 반응은 60분 동안 실행되었다. 도 2b-2c에 도시된 데이터는 게놈 DNA 표적의 10-배수 희석에 대한 나이세리아 고노레아에 대한 루프-디-루프 LAMP 반응으로부터 수직 축 상의 실시간 형광(임의 단위) 대 수평 축 상의 시간의 대표적인 곡선을 묘사한다. 도 2b는 도 2a에 도시된 바와 같이, 루프-디-루프 검정으로부터의 신호를 루프-디-루프 프라이머 없이 SYTO 85 염료로 수행된 LAMP 검정의 신호를 비교한다. 루프-디-루프 검정은 양성 증폭의 경우 훨씬 더 큰 신호를 제공한다. 도 2c에서는, 루프-디-루프 검정의 재현성뿐만 아니라, 무 주형 대조군에서 무시할 수 있는 배경 형광과 감소된 늦은 허위 증폭 산물이 입증되었다. 도 4에 도시된 데이터는 게놈 DNA 표적의 10-배수 희석에 대한 나이세리아 고노레아에 대한 루프-디-루프 LAMP 반응으로부터 수직 축 상의 실시간 형광(임의 단위) 대 수평 축 상의 시간(각 '주기'는 30초를 나타냄)의 대표적인 곡선을 묘사한다. 그런 다음 검정의 평가변수 결정을 기반으로 PROBIT 분석에 의한 일련의 희석 시험 결과로부터 검정 민감도(검출 한계, 50% 및 95% 확률)를 추정했다.
6.8.4. 실시예 4: 루프-디-루프 증폭에 의한
호모 사피엔스
의 검출
루프-디-루프 LAMP 반응 혼합물을 제조하여 호모 사피엔스 게놈 DNA를 검출했다. 반응물을 10μL 부피로 준비하였고 다음 시약을 함유하였다: 20mM Tris-HCL, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 8mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, 1.4mM dNTP, 0.32U/μL Bst 2.0 WarmStart® 폴리머라제, 1.6μM에서 FIP 및 BIP, 0.4μM에서 LF 및 LF-LdL, 0.8μM에서 LB, 0.2μM에서 F3 및 B3를 갖는 프라이머(서열번호: 16-22) 및 20℃에서 pH가 8.8로 조정된 물. 정량된 표적 게놈 DNA를 ATCC에서 구입한 스톡 용액으로부터 pH 8.0 Tris-HCL 완충액에 10-배수 또는 2-배수(더 미세한 분해능을 위함) 희석했다. 무 주형 대조군의 경우, 표적 DNA 희석 또는 DNA-없는 완충액을 각 PCR 튜브 내 9μL의 용액 혼합물에 1μL로 추가하고, 농도당 최대 20개의 복제물을 여러-로그 농도 범위에 걸쳐 사용하여 검정 민감도를 살펴보았다. 반응의 온도는 65℃였고, 루프-디-루프 프라이머에 의해 발산되는 FAM 형광을 통해 반응을 모니터링했다. 실시간 PCR 기계를 사용하여 반응을 가열하고 실시간으로 형광을 측정했다. 반응은 60분 동안 실행되었다. 도 3에 도시된 데이터는 게놈 DNA 표적의 10-배수 희석에 대한 호모 사피엔스에 대한 루프-디-루프 LAMP 반응으로부터 수직 축 상의 실시간 형광(임의 단위) 대 수평 축 상의 시간(각 '주기'는 30초를 나타냄)의 대표적인 곡선을 묘사한다. 그런 다음 검정의 평가변수 결정을 기반으로 PROBIT 분석에 의해 검정 민감도(검출 한계, 50% 및 95% 확률)를 추정했다.
6.8.5. 실시예 5: 루프-디-루프 증폭을 위한 건조된 프라이머 혼합물
동결 건조된 시약으로의 제형화는 5-단계 동결 건조 프로토콜을 사용한 내부 동결건조 시험으로 수행되었다. 나이세리아 고노레아를 검출하도록 설계된 루프-디-루프 LAMP 반응 혼합물은 튜브당 25μL 부피로 준비되었고 각 튜브에 분주되었다. 동결건조된 혼합물에는 다음 시약이 함유되어 있다: 1.4mM dNTP, 글리세롤-없는 제형으로 0.32U/μL Bst 2.0 WarmStart® 폴리머라제, 1.6μM에서 FIP 및 BIP, 0.4μM에서 LF 및 LF-LdL, 0.8μM에서 LB, 0.2μM에서 F3 및 B3를 갖는 프라이머(서열번호: 1-4, 6-8), 5% 트레할로스 및 물(반응당 최대 25μL). 동결건조를 위해 튜브 뚜껑을 제거했다. 제약 및 생명공학 산업에서 표준 장비 조각인, 가열된 선반 동결건조기 장치에서의 금속 선반 위에 튜브 스트립을 배치했다. 동결건조기는 5단계로 실행되도록 프로그래밍되었다. 1단계: 콘덴서 켜기, 진공 끄기, 선반 및 시약을 41℉로 30분 냉각. 콘덴서 켜기, 진공 끄기, 선반 및 시약을 23F로 30분 냉각. 3단계: 콘덴서 켜기, 진공 끄기, 선반 및 시약을 -23F로 2시간 냉각. 4단계: 콘덴서 켜기, 진공 켜기, 선반과 시약을 -23F에서 10시간 유지. 5단계: 콘덴서 켜기, 진공 켜기, 선반 및 시약을 77F로 5시간 가열. 이 과정이 완료되면 튜브를 제거하고 뚜껑을 닫아 도 7에 도시된 생성물을 얻었다. 동결-건조된 검정의 활성은 일정 기간에 걸쳐 다양한 환경 조건에서의 인큐베이션에 이어서 테스트되었다. 도 8은 재수화된 반응의 대표적인 실시간 루프-디-루프 LAMP 검정 활성을 보여준다. 재수화 프로토콜은 건조된 시약에 24μL의 재수화 완충액을 1μL의 나이세리아 고노레아 표적 게놈 DNA와 함께 추가하는 것으로 구성되었다. 재수화 완충액은 20mM Tris-HCL, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 8mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, 및 20℃에서 pH가 8.8로 조정된 물로 구성되었다. 완충액을 튜브에 첨가하고, 이를 그 다음 재-밀봉하고 볼텍싱이나 혼합 없이 실시간 qPCR 기계 안에 직접적으로 넣었다. 반응의 온도는 65℃였고, 루프-디-루프 프라이머에 의해 발산되는 FAM 형광을 통해 반응을 모니터링했다. 실시간 PCR 기계를 사용하여 반응을 가열하고 실시간으로 형광을 측정했다. 반응은 60분 동안 실행되었다. 도 8에 도시된 데이터는 게놈 DNA 표적의 10-배수 희석에 대한 나이세리아 고노레아에 대한 루프-디-루프 LAMP 반응으로부터 수직 축 상의 실시간 형광(임의 단위) 대 수평 축 상의 시간(각 '주기'는 30초를 나타냄)의 대표적인 곡선을 묘사한다. 동결건조된 루프-디-루프 검정 속도, 민감도 및 특이성은 새롭게 제형화된 검정 속도, 민감도 및 특이성과 다르지 않은 것으로 나타났다. 더욱이, 형광의 크기는 건조 및 재수화에 의해 영향을 받지 않았으며, 이는 루프-디-루프 방법이 병원체 검출을 위한 저장 안정성 시험관내 진단 키트를 제공할 수 있음을 보여준다.
6.8.6. 실시예 6: 루프-디-루프 증폭을 위한 온도
루프-디-루프 LAMP 반응 혼합물은 상기 논의된 바와 같이 제조되었으며, 하나는 ORF1ab 프라이머 세트를 포함하고 다른 하나는 POP7b 프라이머 세트를 포함한다. ORF1ab 프라이머 세트는 단일 가닥 양성 센스 RNA 게놈을 가진 SARS-CoV-2 바이러스에 특이적이다. POP7b 프라이머 세트는 자연적으로 DNA 주형으로 발생하지 않는 인간 RNA 표적에 특이적이다; 따라서 이 프라이머 세트는 샘플에서의 인간 RNA의 특정 지표로 유용하다. 두 경우 모두에서, 루프-디-루프를 사용하여 LAMP에 사용되는 6개의 구성 프라이머 중 하나를 변형하여 제7 루프형 프라이머를 창출했다. 루프형 프라이머는 형광단과 소광제 쌍을 활용하여 관찰가능한 신호를 생성했다. 이 실험에서는 각 프라이머 세트에 대한 RNA 표적의 것에 상응하는 그 양성 센스 가닥 상의 서열을 함유하는 적당히 높은 농도의 합성 이중 가닥 DNA 주형을 LAMP 반응 온도 최적화에 대한 표적으로 활용하여 희석물 표적으로 일어나는 역전사 단계 또는 확률적 노이즈에 기인한 변동성을 최소화했다. 384-웰 플레이트 내의 혼합물에 표적 DNA 희석액을 첨가했다. 이를 55 내지 70℃의 범위인 다양한 온도에서 인큐베이션하고 루프-디-루프 프라이머에 의해 발산되는 FAM 형광을 통해 반응을 모니터링했다. 실시간 PCR 기계를 사용하여 반응을 가열하고 실시간으로 형광을 측정했다. 반응은 60분 동안 실행되었다. 실험은 중첩하는 온도 범위에 대해 2회(제1 테스트와 제2 테스트) 수행되었고 데이터는 도 9a 및 9b에 도시되어 있다. 도면은 검출을 위한 충분한 신호를 얻는데 필요한 시간을 묘사한다. 결과는 프라이머 세트가 광범위한 온도에 걸쳐서 활성화된다는 것을 보여준다. 예를 들어, 약 57-70℃는 POP7b 및 ORF1ab 프라이머 세트 둘 모두에 대해 허용가능한 범위였다. 최적의 수행성은 60℃ 내지 68℃ 사이에서 달성되었다.
6.8.7. 실시예 7: 정제된 표적과 조 시료에서의 표적 둘 모두를 검출하기 위한 다중화된 루프-디-루프 반응
도 14a, 14b 및 14c는 각각 ORF1ab 및 POP7b LdL 프라이머 세트를 사용한 SARS-CoV-2 및 인간 표적 서열의 루프-디-루프 증폭으로부터의 2개의 형광 신호를 보여준다. SARS-CoV-2 ORF1ab(FAM) 및 POP7b 인간 내부 대조군(Cy5)으로부터의 신호가 도시되어 있다. 3가지 유형의 샘플이 사용되었다 ― 임의의 표적 서열이 없는 대조군 샘플(무 주형 대조군)(도 14a), 인간 비강 면봉(도 14b) 및 열-불활성화된 바이러스의 형태에서 SARS-CoV-2 표적 서열과 조합된 인간 비강 면봉(도 14c). 인간의 비강 면봉은 지원자로부터 자가-수집되었으며 샘플 처리나 핵산 추출 없이 직접적으로 반응에 추가되었다. 몇 초 동안 비틀어서 면봉을 반응 혼합물 안으로 용리시켰다. SARS-CoV-2 표적 서열은 SARS-CoV-2-양성 반응 안으로 스파이크된 온전한 열-불활성화된 바이러스(ATCC VR-1986HK)로 반응 안으로 도입되었다. ORF1ab LdL-FAM 및 POP7b LdL-Cy5 프라이머 세트는 반복 반응 부피에서 1:1 비율에서 이중화되었다. 두 프라이머 세트 모두 표지되지 않은 프라이머 유사체(25% 강도)에 대해 1:3 비율에서 LdL 프라이머를 활용했다. 반응에는 역전사효소, 가닥 대체 폴리머라제 및 RNase 억제제가 함유되어 있다. 실시간 PCR 기계(Bio-Rad CFX-384®)를 사용하여 반응을 섭씨 55.6도에서 2.5분 동안 인큐베이션한 다음 반응을 섭씨 63.5도에서 60분 동안 인큐베이션하면서 FAM 및 Cy5에 대한 형광 측정을 기록했다. 예상한 대로 무 주형 대조군 복제는 60분에 걸쳐서 루프-디-루프 형광 신호를 나타내지 않았다. COVID-19-음성 비강 면봉 샘플을 함유하는 반응은 Cy5 형광에서의 증가로 입증되는 바와 같이 POP7b 신호의 증폭을 나타낸 반면 ORF1ab 신호는 플랫으로 유지되었다(음성). 열-불활성화된 바이러스로 스파이킹된 샘플은 단일 반응 용기에서 두 RNA 표적 모두의 스펙트럼으로 이중화된 검출을 보여주었다. 결과는 루프-디-루프 RT-LAMP가 SARS-CoV-2와 인간 표적의 단일-튜브 스펙트럼 다중화를 허용한다는 것을 보여준다.
ORF1ab LdL 프라이머 세트로 SARS-CoV-2에 대한 다중화된 루프-디-루프 시험은 PCR 시험만큼 민감하고 추출이 필요하지 않았는데, 이는 조 샘플로의 반응이 아래 표에 제공된 바와 같이 양호한 결과를 제공했기 때문이다. POP7b LdL 프라이머 세트를 내부 대조군으로 사용했다. 온전한 열-불활성화된 SARS-CoV-2 바이러스(ATCC VR-1986HK)의 일련의 희석액을 이중화된 루프-디-루프 반응에 추가하고 실시간 신호 발생에 대해 모니터링했다. 검정의 검출 한계는 테스트 키트의 특정 형식에 대해 LoD95 = 400cp/면봉 = 2.7x103 cp/mL로 추정되었다.
삼중화된 루프-디-루프 반응도 단일 튜브에서 테스트되었다. 이는 결과까지 빠른 시간을 유지하는, 3가지 표적의 특정 증폭을 보여 주었다. SARS-CoV-2 바이러스 RNA에 대한 2개의 개별 표적은 FAM 형광단으로 표지된 2개의 루프-디-루프 프라이머 세트를 사용하여 검출되었다. Cy5로 표지된 인간 내부 대조군 루프-디-루프 프라이머 세트는 제3 RNA 표적을 검출했다. 내부 Cy5 형광단은 5' Iowa Black® RQ 소광제와 쌍을 이루었다. 반응에는 조 비강 면봉 용리액이 함유되어 있고 열-불활성화된 SARS-CoV-2로 스파이킹되었다.
POP7b 인간 내부 대조군을 위한 루프-디-루프 프라이머 세트에 사용하기 위해 추가적인 루프형 프라이머도 테스트되었다. 일 경우에서, 제2 센서 분자인 내부 TAMRA 형광단이 제1 센서 분자인 5' Iowa Black® FQ 소광제와 쌍을 이루었다. 또 다른 경우에서, 제1 센서 분자인 5' Yakima Yellow®(Epoch Biosciences)가 제2 센서 분자인 내부 Zen™(Integrated DNA Technologies) 소광제와 쌍을 이루었다. Yakima Yellow 및 Zen 구성을 위해, 루프형 프라이머의 3가지 변형을 생산하고 테스트했다. 제1 변형에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 완벽하게 상보적이었고 각각 6개 염기 길이였다. 이격 올리고뉴클레오티드는 13개 염기 길이였다. 제2 변형에서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드는 그 5' 말단에 추가 염기가 있어서 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드는 7개 염기 길이이고 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 6개 염기 길이였다. 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드 사이에는 6개의 상보적인 염기가 있었다. 이격 올리고뉴클레오티드는 13개 염기 길이였다. 제3 변형에서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 둘 모두 7개 염기 길이였고 서열은 완벽하게 상보적이었다. 이격 올리고뉴클레오티드는 10개 염기 길이였다.
이들 추가적인 루프형 프라이머는 LAMP 반응에 사용된다. 반응은 표적 서열의 특정 증폭 신호를 제공한다.
6.8.8. 실시예 8: 루프-디-루프 증폭에 의한 인간 샘플에서 SARS-CoV-2의 검출
루프-디-루프 LAMP 반응 혼합물을 제조하여 처리되지 않은 인간 타액에서 SARS-CoV-2를 검출하였다. 동결건조된 효소, dNTP 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 혼합물을 pH 완충 염 용액에서 인간 타액의 10%vol/vol 혼합물로 재수화함에 의해 PCR 튜브에 반응을 준비했다. 동결건조된 프라이머 혼합물에는 SARS-CoV-2용 프라이머 세트와 인간 내부 대조군 RNA 서열이 포함되었다. 타액 샘플로 재수화되면, 바이러스 용리, RNase 억제 및 역전사를 조장하기 위해 예열 온도에서 정의된 기간 동안 반응을 인큐베이션한 다음 LAMP DNA 증폭을 위해 더 높은 반응 온도에서 인큐베이션했다. 온도 제어 및 실시간 형광 데이터는 맞춤형 장비를 사용하여 수집되었다.
열-불활성화된 SARS-CoV-2를 익명의 공여자로부터 수집한 신선한 타액의 풀에 추가했다. 타액에서의 3-배수 일련의 희석액을 제조했다. 루프-디-루프 증폭 방법을 사용하여 20개의 샘플을 테스트했다. 모바일 앱, 육안 또는 실시간 곡선 검사에 의한 판독값은 아래에 요약되어 있다. 결과는 LoD가 약 2,500cp/mL임을 보여준다.
자가-수집된 비강 면봉을 지원자 대상체로부터 얻었고 10회 비틀어서 반응 혼합물에 직접적으로 첨가했다. 도 16은 이후 PCR 테스트에 의해 COVID에 대해 양성으로 확인된 유증상 지원자로부터 얻은 비강 면봉으로부터의 증폭 결과를 보여준다. 양성/음성 대조군 샘플로부터 결과도 제공된다. 결과는 샘플(1x 면봉)이 루프-디-루프 검정으로 양성 샘플을 검출하는데 필요한 것보다 365배 더 농축되었음을 보여준다. LoD는 약 2,500cp/mL로 추정되므로 특정 샘플에는 약 9.1x105cp/mL의 SARS-CoV-2 바이러스 RNA가 함유된 것으로 추정되었다.
도 17은 음성 지원자로부터 얻은 비강 면봉으로부터 증폭 결과를 보여준다. 환자는 루프-디-루프 반응과 PCR 테스트 둘 모두 음성으로 검출됐다.
SARS-CoV-2를 검출하기 위한 반응 혼합물은 인간 게놈 서열을 검출하기 위한 프라이머와 1:1 비율로 다중화되었다. 다중화된 증폭 결과는 도 18에 제공된다. 결과는 교차 반응성 없이 2개의 표적 서열의 특이적이고 민감한 검출을 보여준다.
6.8.9. 실시예 9: 루프-디-루프 증폭에 의한 인간 샘플에서
클라미디아 트라코마티스
및
나이세리아 고노레아
의 검출
3개의 질 면봉(BD BBL 배양 면봉, 고유한 개별 공여자로부터 공급된, 미주리주 소재의 Lee Biosolutions에서 구입한 폴리우레탄 폼 선단의 면봉)을 30초, 1Hz 돌리기 방법(Panpradist et al., 2016)을 사용하여 1,294μL의 재수화 완충액(면봉당 431μL) 안으로 용리하였다. 면봉에 일부 유체의 손실 후, 1095μL의 풀링된 질 면봉 용리액을 얻었다. 유체 회수율은 85%였다. 이 면봉 용리액을 루프-디-루프 LAMP를 위해 동결건조된 반응 혼합물을 함유하는 사출 성형 프로토타입 일회용품 안으로 피펫으로 넣었다(Ct용 하나, Ng용 하나, 및 인간 진행 대조군용 하나).
각 반응은 다음을 사용하여 재수화되었다:
ㆍ 면봉 용리액 18μL(면봉을 재수화 완충액에 돌려서 넣음);
ㆍ 재수화 완충액에 현탁된 전체 Ct 병원체 1μL
ㆍ 재수화 완충액에 현탁된 전체 Ng 병원체 1μL
Ct 및 Ng 병원체 샘플은 일회용품의 각 반응 챔버에 있었다. 그래서, 예를 들어, Ct 검정은 Ng와 인간 표적의 동시적인 존재에서 뿐만 아니라 면봉 샘플에 존재하는 어떠한 박테리아 환경에서도 Ct를 검출하는 임무가 있었다.
증폭 결과는 도 19-22에 제공된다. 도 19는 높은 Ct(반응당 10,000 카피 당량) 및 높은 Ng(반응당 10,000 카피 당량)를 함유하는 샘플로부터의 형광 신호를 보여준다. 도 22는 음성 대조군 ― 면봉 단독 대조군(왼쪽 2개의 패널) 또는 완충액 단독 대조군(오른쪽 2개의 패널)으로부터의 신호를 보여준다. 면봉 단독 대조군에서는 Ct 또는 Ng 증폭이 없었지만, 인간 게놈 서열은 예상대로 증폭되었다. 완충액 단독 대조군에서는 Ct 또는 Ng 증폭이 없었다. H. 사피엔스 증폭은 하나의 완충액 단독 반응(테스트 20)에서 늦게 검출되었는데, 이는 지연된 신호를 감안하여 허위 증폭으로 인한 것일 가능성이 높다.
이들 결과는 검정이 반응당 약 100 카피에서 Ct와 반응당 약 >1,000 카피에서 Ng를 검출하는데 민감하다는 것을 보여준다.
6.8.10. 실시예 10: NBM-루프형 프라이머에서 내부 센서의 차단 효과
다양한 내부 센서 분자를 포함하는 NBM-루프형 프라이머를 가닥 대체 폴리머라제에 의한 증폭에 대한 그 차단 효과에 대해 테스트했다.
센서 분자(플루오르 또는 소광제)의 화학적 부착을 위한 백본으로서 뉴클레오티드 염기(예를 들어, dT)를 활용하는 내부 변형을 함유하는 NBM-루프형 프라이머는 폴리머라제를 차단하지 않았다. 도 24는 플루오레세인(FAM)으로 표지된 내부 dT를 포함하는 NBM-루프형 프라이머를 사용한 증폭으로부터의 용융 곡선을 보여준다. 예상한 대로, 용융 곡선은 비-증폭된 반응에 대해 양의 기울기(-d(RFU)/dT<0)를 나타내고, 양성 앰플리콘에 대해 음의 기울기를 나타냈다.
반면에, 화학적 부착을 위한 백본으로서 뉴클레오티드 염기(예를 들어, dT)를 활용하지 않는 내부 변형을 함유하는 NMB-루프형 프라이머는 폴리머라제를 차단했다. 폴리머라제 자체가 함께 이동하려면 DNA 염기의 인산염 백본이 필요할 수도 있다. 예를 들어, 내부 Cy5 구조는 도 25에 제공된 바와 같이 이를 중단시킨다. 도 25는 인간 POP7b-LB-Cy5의 용융 곡선을 제공한다. 이 프로브에 대한 Tm은 처음부터 매우 높았으며 증폭이 발생했을 때 Tm에는 큰 전이가 없었다. 따라서 65℃에서는 신호가 거의 발생하지 않았다. 용융 곡선은 양성 유도체만 나타내어 Cy5가 연장을 차단함을 시사한다.
유사하게, 내부 Zen 소광제(IDT)를 갖는 루프형 프라이머(예를 들어, POP7b LB-LdL-YY-1 및 2)도 도 26에 제공된 바와 같이 효소 진행을 차단했다.
헤어핀의 Tm이 70℃에서 63℃로 전이하여 일부 실시간 형광 이득이 있었다. 그러나, 반응 온도에서 헤어핀의 100%가 개방 구성이 아니었기 때문에 형광은 FAM(약 25%)보다 희미했다. 용융 곡선은 내부 Zen 소광제가 Bst 폴리머라제에 의한 상보성 가닥의 연장을 차단하고 있음을 보여준다.
이들 결과는 많은 내부 센서 분자가 연장을 차단할 수 있기 때문에 NBM-루프형 프라이머의 사용이 제한된다는 것을 시사한다. FAM이나 TAMRA(IDT) 외에 dT 변형으로 제공되는 내부 변형은 많지 않다.
클릭 화학을 사용하여 Cy3, Cy5 및 기타 형광단을 내부 변형 안으로 취하여 이를 뉴클레오티드 염기(dT)와 연결하는 방식이 있다. 클릭 화학은 효율적이지만, 올리고뉴클레오티드 제조업체를 위한 합성-후 변형과 비-표준 시약이 여전히 필요하다.
루프형 프라이머의 역상보체의 합성이 제2 클램핑 서열의 3' 말단에서의 내부 센서의 부위에서 중단되면, LAMP 및 RT-LAMP 반응에서 실시간 증폭 신호가 없거나 상대적으로 약할 수 있고 루프형 프라이머의 헤어핀 구조의 용융 온도가 더 낮을 수 있다. 이들 연장-차단 루프형 프라이머는 1) 이들이 약한 형광 신호를 생성하고, 2) 형광이 강력하게 온도 의존성이고, 3) 형광의 평가변수 측정이 양성 결과와 음성 결과 간을 구별할 수 없기 때문에 문제가 될 수 있다.
6.8.11. 실시예 11: BM 및 NBM-루프형 프라이머를 사용한 루프-디-루프 증폭
POP7b 또는 CoV-11을 표적화하고 다양한 내부 변형을 포함하는 BM 및 NBM-루프형 프라이머를 테스트했다. 표적 뉴클레오티드의 존재(+) 또는 부재(-)에서의 LAMP 반응에서 그 실시간 증폭 신호는 도 28a, 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a 및 38a에 제공되어 있고 다양한 온도에서 용융 곡선은 도 28b, 29b, 30b, 31b, 32b, 33b, 34b, 35b, 36b, 37b 및 38b에 제공되어 있다. POP-7b 또는 CoV-11을 표적화하는 테스트된 루프형 프라이머는 아래 표에 요약되어 있다.
도 28a-38b는 다양한 내부 소광제(예를 들어, Onyx(Millipore Sigma), dT-TAMRA 형광단, QSY7 소광제(Thermo Fisher Scientific))가 루프-디-루프 증폭을 위한 NBM 프라이머에 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 구체적으로, Onyx 소광제의 NBM 호환성은 5'HEX 및 폴리-AT 스페이서 둘 모두, 내부 OQA 소광제를 갖는, POP7b LB 또는 CoV-11 LB로 입증되었고; dT-TAMRA 형광단의 NBM 호환성은 5'QSY7 소광제, 폴리-AT 스페이서 및 내부 dT-TAMRA를 갖는 POP7b LB로 입증되었고; QSY7 소광제의 NBM 호환성은 5' FAM, VIC, ABY 및 JUN을 사용하여 POP7b LB 또는 CoV-11 LB로 입증되었다.
도 28a-38b는 BM-루프형 프라이머가 실제로 중합화를 차단하지 않는 다양한 내부 소광제와 상용성이 있음을 추가로 보여준다. 예를 들어, 5' FAM, 5'VIC, 5'ABY 또는 5'JUN과 조합하여 내부 QSY7을 갖는 POP7b LB의 실시간 증폭 곡선은 바이오센서 쌍이 BM-루프형 프라이머에서 그리고 또한 NBM-루프형 프라이머에서 원하는 증폭 반응을 제공했다는 것을 보여준다. (도 28a, 30a, 31a, 33a). 따라서, BM-루프형 프라이머는 이미 중합화를 차단하는 내부 바이오센서와 함께 작동하는 것으로 나타났기 때문에, BM-루프형 프라이머는 중합화를 차단하거나 허용하는 내부 바이오센서와 호환가능하다.
BM-루프형 프라이머는 그 차단 효과에 관계없이 내부 바이오센서와 호환가능하다. 차단 변형이 있는 BM-루프형 프라이머와 비-차단 변형이 있는 BM-루프형 프라이머 둘 모두가 표적 서열의 증폭에 사용될 수 있다.
반면에, 특정 NBM-루프형 프라이머는 차단 효과 없이 내부 바이오센서의 사용을 요하는 차단 변형(예를 들어, 차단 효과가 높은 바이오센서)과 호환가능하지 않았다. 예를 들어, NBM-루프형 프라이머 서열번호: 23 또는 서열번호: 24 중 어느 하나를 루프형 프라이머로 사용한 POP7b 프라이머 세트로 POP7을 표적화하는 증폭반응은 내부 Zen 소광제로부터 차단 효과를 나타내어, 5'-Yakima Yellow로부터 약한 형광 신호 생성 및 양성 샘플의 실온에서 평가변수 형광의 소멸을 초래했다. 이에 반해, BM-루프형 프라이머인 서열번호: 25 또는 서열번호: 26 중 어느 하나를 루프형 프라이머로 사용한 POP7b 프라이머 세트로 POP7을 표적화하는 증폭 반응은 내부 Zen 소광제로부터의 차단 효과에도 불구하고 5'-Yakima Yellow로부터 강한 형광 신호 생성을 나타내었다. 더욱이, 양성 샘플에서 실온에서 평가변수 형광은 차단 내부 변형(Zen 소광제)이 있는 BM-루프형 프라이머를 사용하여 보존되었다. 부가하여, 제1 감지 분자로 5'-Yakima Yellow 대신 사용된 5'-HEX는 BM-루프형 프라이머 서열 서열번호:27 및 서열번호:28과 비교할만한 결과를 제공했으며, 여기서 제2 감지 분자도 차단 내부 Zen 소광제였다.
클램핑 서열의 Tm 미만의 음성 반응의 용융 곡선은 NBM-루프형 프라이머의 배경/기준선 형광이 일반적으로 BM-루프형 프라이머의 형광보다 낮다는 것을 보여준다. 이는 NBM-루프형 프라이머에서의 접촉 소광이 BM-루프형 프라이머에서의 FRET 소광보다 더 효과적이기 때문일 수 있다. 더욱이, 양성 반응의 실시간 증폭 곡선은 NBM-루프형 프라이머의 평가변수 형광(rxn 온도에서)이 일반적으로 BM-루프형 프라이머의 형광보다 높다는 것을 시사했다. 이는 NBM-루프형 프라이머에서 플루오르/소광제 쌍 사이의 이격이 더 크기 때문일 수 있다.
특정 조건에서, BM-루프형 프라이머는 비교할만한 NBM-루프형 프라이머보다 더 나은 증폭 신호를 제공했다. 실온에서 가장 큰 차동 신호(pos 마이너스 neg)는 폴리-T 스페이서가 있는 BM-루프형 프라이머에서 발생했다.
LdL 클램핑 서열의 용융 온도(Tm)는 반응의 속도와 실시간 증폭 곡선에서의 배경/기준선 형광에 영향을 미친다. Tm은 BM-루프형 프라이머, 특히 폴리-T 스페이서가 있는 것에 대해 예측된 것보다 낮았다.
5'-VIC 및 내부 dT-QSY7을 갖는 루프형 프라이머(5'-VIC-1)는 다른 형광단 변형에 비해 Tm에서 단지 약간(1-2C) 증가했음에도 불구하고 다른 "5'-형광단 표지된 프라이머보다 유의하게 느렸다. 따라서, 5'VIC와 dT-QSY7의 조합은 다른 조합보다 덜 선호된다.
7. 서열
8. 참조에 의한 통합
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 문서는 마치 각 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문서가 개별적으로 모든 목적을 위해 참조로 포함되도록 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
9. 등가물
본 개시내용은 특히 칸나비노이드의 조성물 및 측근 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 칸나비노이드 및 측근 조성물을 투여함에 의해 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 특정 실시형태가 도시되고 기술되었지만, 상기 사양은 제한적이지 않다. 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 본 명세서를 검토하면 당업자에게 많은 변경이 명백해질 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (106)
- 5'에서 3'으로 다음을 포함하는, 표적 서열의 루프-디-루프 증폭(LdL)을 위한 루프형 프라이머:
제1 센서 분자;
제1 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제1 이격 올리고뉴클레오티드;
제2 센서 분자,
여기서, 제1 센서 분자 및 제2 센서 분자는 제1 바이오센서 쌍임;
선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드;
제2 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제1 프라이머 서열. - 제1항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적인, 루프형 프라이머.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 이격 올리고뉴클레오티드 또는 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 헤어핀 구조에서 단일 가닥인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 프라이머 서열은 중첩되는, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 프라이머 서열은 중첩되지 않는, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 이격 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 루프형 프라이머.
- 제6항에 있어서, 제1 이격 올리고뉴클레오티드와 제2 이격 올리고뉴클레오티드 둘 모두는 헤어핀 구조에서 단일 가닥인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 30개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제8항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 15개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제9항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 10개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제10항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 9개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제11항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 8개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제12항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 7개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제13항에 있어서, 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드와 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 3 내지 6개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 센서 분자와 선택적 제2 센서 분자는, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적 제2 이격 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 9 내지 100Å 떨어져 있는, 루프형 프라이머.
- 제15항에 있어서, 제1 센서 분자와 선택적 제2 센서 분자는, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 제2 센서 분자, 선택적 제2 이격 올리고뉴클레오티드 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조를 형성할 때, 10 내지 50Å 떨어져 있는, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 10개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제17항에 있어서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 18개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제18항에 있어서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 19개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제19항에 있어서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드와 제1 이격 올리고뉴클레오티드는 함께 적어도 20개 뉴클레오티드 길이인, 루프형 프라이머.
- 제1항 또는 제20항에 있어서, 제1 바이오센서 쌍은 에너지 공여체 및 수용체 쌍인, 루프형 프라이머.
- 제21항에 있어서, 제1 바이오센서 쌍은 형광 공명 에너지 전달(FRET) 또는 생물발광 공명 에너지 전달(BRET)을 위한 에너지 공여체 및 수용체 쌍인, 루프형 프라이머.
- 제21항에 있어서, 제1 센서 분자는 FRET 형광단이고, 제2 센서 분자는 FRET 소광제인, 루프형 프라이머.
- 제21항에 있어서, 제1 센서 분자는 FRET 소광제이고, 제2 센서 분자는 FRET 형광단인, 루프형 프라이머.
- 제21항에 있어서, 제1 센서 분자는 BRET 에너지 공여체이고, 제2 센서 분자는 BRET 에너지 수용체인, 루프형 프라이머.
- 제21항에 있어서, 제1 센서 분자는 BRET 에너지 수용체이고, 제2 센서 분자는 BRET 에너지 공여체인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 센서 분자와 제2 센서 분자는 검출가능한 광 신호를 생성하는 복합체를 형성할 수 있는, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 센서 분자 및 제2 센서 분자는 헤어핀 구조가 형성될 때 유의하게 감소된 광 신호를 생성하는, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 센서 분자는 티미딘(T) 또는 디옥시티미딘(dT)에 부착되는, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 60℃ 초과인, 루프형 프라이머.
- 제30항에 있어서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 65℃ 초과인, 루프형 프라이머.
- 제31항에 있어서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70℃ 초과인, 루프형 프라이머.
- 제32항에 있어서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 80℃ 초과인, 루프형 프라이머.
- 제32항에 있어서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70 내지 80℃인, 루프형 프라이머.
- 제34항에 있어서, 헤어핀 구조의 용융 온도(Tm)는 70 내지 75℃인, 루프형 프라이머.
- 제35항에 있어서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 약 72℃인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60℃ 미만인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm)는 60 내지 65℃인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제1 이격 올리고뉴클레오티드, 선택적인 제2 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제2 클램핑 올리고뉴클레오티드는 (i) 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 선택된 핵염기, (ii) 잠금 핵산, (iii) 2' O-메틸 RNA 염기, (iv) 포스포로티오화된 DNA 염기, (v) 포스포로티오화된 RNA 염기, (vi) 포스포로티오화된 2'-O-메틸 RNA 염기, 또는 (vii) 이의 조합을 포함하는, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 루프형 프라이머의 5' 말단에 제1 추가 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 센서 분자와 제1 클램핑 올리고뉴클레오티드 사이에 제2 추가 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 루프형 프라이머.
- 제40항 또는 제41항에 있어서, 제1 또는 제2 추가 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열은 병원체 게놈에 특이적인, 루프형 프라이머.
- 제43항에 있어서, 표적 서열은 클라미디아 트라코마티스에 특이적인, 루프형 프라이머.
- 제44항에 있어서, 표적 서열은 orf8 또는 cds2로부터의 것인, 루프형 프라이머.
- 제43항에 있어서, 표적 서열은 나이세리아 고노레아에 특이적인, 루프형 프라이머.
- 제43항에 있어서, 표적 서열은 porA 또는 glnA로부터의 것인, 루프형 프라이머.
- 제43항에 있어서, 표적 서열은 바이러스에 특이적인, 루프형 프라이머.
- 제48항에 있어서, 바이러스는 SARS-CoV-2인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열은 호모 사피엔스에 특이적인, 루프형 프라이머.
- 제50항에 있어서, 표적 서열은 RNA 서열인, 루프형 프라이머.
- 제50항에 있어서, 표적 서열은 POP7b를 인코딩하는 RNA 서열인, 루프형 프라이머.
- 제50항에 있어서, 표적 서열은 tbc1d3로부터의 것인, 루프형 프라이머.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 루프형 프라이머를 포함하는, 표적 서열의 루프-디-루프 증폭을 위한 프라이머 혼합물.
- 제54항에 있어서, (i) 전방 내부 프라이머(FIP), (ii) 후방 내부 프라이머(BIP), (iii) 전방 프라이머(F3) 및 후방 프라이머(B3)를 추가로 포함하며, 여기서 FIP, BIP, F3 및 B3는 표적 서열 상의 6개의 서로 다른 결합 부위에 결합하는, 프라이머 혼합물.
- 제54항에 있어서, (i) 루프 전방 프라이머(LF) 및 (ii) 루프 후방 프라이머(LB)를 추가로 포함하며, 여기서 LF와 LB는 표적 서열 상의 2개의 서로 다른 결합 부위에 결합하는, 프라이머 혼합물.
- 제55항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, FIP, BIP, F3, B3, LF 또는 LB는 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 결합하는, 프라이머 혼합물.
- 제55항에 있어서, FIP는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물에서 FIP와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1인, 프라이머 혼합물.
- 제55항에 있어서, BIP는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물에서 BIP와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1인, 프라이머 혼합물.
- 제55항에 있어서, LF는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물에서 LF와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1인, 프라이머 혼합물.
- 제55항에 있어서, LB는 제1 결합 부위에 결합하고, 프라이머 혼합물에서 LB와 루프형 프라이머의 양 사이의 비율은 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 또는 9:1인, 프라이머 혼합물.
- 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, F3는 서열번호: 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, BIP는 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LF는 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 프라이머 혼합물.
- 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, F3는 서열번호: 1의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 3의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 프라이머 혼합물.
- 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, F3는 서열번호: 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 11의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, BIP는 서열번호: 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LF는 서열번호: 13의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 14의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 프라이머 혼합물.
- 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, F3는 서열번호: 9의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 11의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 13의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 14의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 프라이머 혼합물.
- 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, F3는 서열번호: 16의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, B3는 서열번호: 17의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, FIP는 서열번호: 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, BIP는 서열번호: 19의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LF는 서열번호: 20의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, LB는 서열번호: 21의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 프라이머 혼합물.
- 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, F3는 서열번호: 16의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, B3는 서열번호: 17의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, FIP는 서열번호: 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, BIP는 서열번호: 19의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LF는 서열번호: 20의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, LB는 서열번호: 21의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 프라이머 혼합물.
- 제54항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 루프형 프라이머를 추가로 포함하며, 여기서 제2 루프형 프라이머는 5'에서 3'으로 다음을 포함하는, 프라이머 혼합물:
제3 센서 분자;
제3 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제3 이격 올리고뉴클레오티드;
제4 센서 분자,
여기서, 제3 센서 분자 및 제4 센서 분자는 제2 바이오센서 쌍이고, 제2 바이오센서 쌍은 제1 바이오센서 쌍과 상이함;
선택적인 제4 이격 올리고뉴클레오티드;
제4 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제3 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제3 이격 올리고뉴클레오티드, 제4 센서 분자, 선택적인 제4 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제3 및 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
제2 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제2 프라이머 서열. - 제68항에 있어서, 제3 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제4 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적인, 프라이머 혼합물.
- 제68항 또는 제69항에 있어서, 표적 서열과 제2 표적 서열은 동일한, 프라이머 혼합물.
- 제68항 또는 제69항에 있어서, 표적 서열과 제2 표적 서열은 상이한, 프라이머 혼합물.
- 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 제2 전방 내부 프라이머(SFIP), (ii) 제2 후방 내부 프라이머(SBIP), (iii) 제2 전방 프라이머(SF3), 및 (iv) 제2 후방 프라이머(SB3)를 추가로 포함하며, 여기서 SFIP, SBIP, SF3 및 SB3는 제2 표적 서열 상의 6개의 서로 다른 결합 부위에 결합하는, 프라이머 혼합물.
- 제68항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 제2 루프 전방 프라이머(SLF) 및 (ii) 제2 루프 후방 프라이머(SLB)를 추가로 포함하며, 여기서 SLF와 SLB는 제2 표적 서열 상의 2개의 서로 다른 결합 부위에 결합하는, 프라이머 혼합물.
- 제54항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 루프형 프라이머를 추가로 포함하며, 여기서 제3 루프형 프라이머는 5'에서 3'으로 다음을 포함하는, 프라이머 혼합물:
제5 센서 분자;
제5 클램핑 올리고뉴클레오티드;
제5 이격 올리고뉴클레오티드;
제6 센서 분자,
여기서, 제5 센서 분자 및 제6 센서 분자는 제3 바이오센서 쌍이고, 제3 바이오센서 쌍은 제1 바이오센서 쌍 및 제2 바이오센서 쌍과 상이함;
선택적인 제6 이격 올리고뉴클레오티드;
제6 클램핑 올리고뉴클레오티드,
여기서 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드, 제5 이격 올리고뉴클레오티드, 제6 센서 분자, 선택적인 제6 이격 올리고뉴클레오티드, 및 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제5 및 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드의 용융 온도(Tm) 미만의 온도에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있음; 및
제3 표적 서열 상의 제1 결합 부위에 상보적인 제3 프라이머 서열. - 제74항에 있어서, 제5 클램핑 올리고뉴클레오티드는 제6 클램핑 올리고뉴클레오티드에 상보적인, 프라이머 혼합물.
- 제74항 또는 제75항에 있어서, 표적 서열, 제2 표적 서열 및 제3 표적 서열은 동일한, 프라이머 혼합물.
- 제74항 또는 제75항에 있어서, 표적 서열, 제2 표적 서열 및 제3 표적 서열은 상이한, 프라이머 혼합물.
- 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 제3 전방 내부 프라이머(TFIP), (ii) 제3 후방 내부 프라이머(TBIP), (iii) 제3 전방 프라이머(TF3), 및 (iv) 제3 후방 프라이머(TB3)를 추가로 포함하며, 여기서 TFIP, TBIP, TF3 및 TB3는 제3 표적 서열 상의 6개의 서로 다른 결합 부위에 결합하는, 프라이머 혼합물.
- 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 제3 루프 전방 프라이머(TLF) 및 (ii) 제3 루프 후방 프라이머(TLB)를 추가로 포함하며, 여기서 TLF와 TLB는 제3 표적 서열 상의 2개의 서로 다른 결합 부위에 결합하는, 프라이머 혼합물.
- 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 루프형 프라이머를 추가로 포함하는, 프라이머 혼합물.
- 제80항에 있어서, 제5 루프형 프라이머를 추가로 포함하는, 프라이머 혼합물.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 루프형 프라이머 또는 제54항 내지 제81항 중 어느 한 항의 프라이머 혼합물을 동결건조하여 얻은 건조된 프라이머 혼합물.
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 루프형 프라이머, 제54항 내지 제81항 중 어느 한 항의 프라이머 혼합물, 또는 제80항의 건조된 프라이머 혼합물을 포함하는, 표적 서열의 루프-디-루프 증폭용 키트.
- 제83항에 있어서, 폴리머라제를 추가로 포함하며, 여기서 폴리머라제는 선택적으로 바실러스 스테아로테르모필루스 폴리머라제인, 키트.
- 제83항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, dNTP, MgSO4 및 완충액를 추가로 포함하는, 키트.
- 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 역전사효소를 추가로 포함하는, 키트.
- 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, RNase 억제제를 추가로 포함하는, 키트.
- 제87항에 있어서, RNase 억제제는 돼지(porcine) 또는 쥐(murine) RNase 억제제인, 키트.
- 다음 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 서열을 검출하는 방법:
샘플을 제공하는 단계;
(i) 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 프라이머, (ii) 제54항 내지 제81항 중 어느 한 항의 프라이머 혼합물, 또는 (iii) 제82항의 건조된 프라이머 혼합물을 재수화하여 얻은 재구성된 프라이머 혼합물과 폴리머라제를 샘플에 첨가하고, 이에 의해 반응 혼합물을 생성하는 단계; 및
반응 혼합물을 50-85℃에서 인큐베이션하는 단계. - 제89항에 있어서, 인큐베이션은 50-70℃에서 수행되는, 방법.
- 제90항에 있어서, 인큐베이션은 60-65℃에서 수행되는, 방법.
- 제91항에 있어서, 인큐베이션은 62-65℃에서 수행되는, 방법.
- 제89항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머라제는 바실러스 스테아로테르모필루스 폴리머라제인, 방법.
- 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물로부터 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제94항에 있어서, 신호는 형광 신호인, 방법.
- 제94항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 검출하는 단계는 인큐베이션의 단계 동안 수행되는, 방법.
- 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 표적 서열의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제89항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 제조하는 이전 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제98항에 있어서, 샘플을 제조하는 단계는 RNA 분자를 역전사효소와 상호작용시키고, 이에 의해 DNA 분자를 포함하는 샘플을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제99항에 있어서, 샘플을 제조하는 단계는 역전사효소와의 상호작용 전 또는 상호작용 동안 RNA 분자를 예열하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제89항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물은 RNase 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
- 제101항에 있어서, RNase 억제제는 돼지(porcine) 또는 쥐(murine) RNA 억제제인, 방법.
- 제89항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 정제된 RNA, 정제된 DNA, 전체 SARS-CoV-2 바이러스, 전체 인간 세포, 타액 또는 비강 면봉, 또는 비강 또는 비인두 면봉을 포함하는, 방법.
- 제89항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 질 면봉으로부터의 게놈 DNA, 합성 DNA, 전체 박테리아 또는 전체 인간 세포를 포함하는, 방법.
- 제89항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제105항에 있어서, 제2 표적 서열 또는 제3 표적 서열의 부재의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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