JP7221199B2 - マルチプレックスｐｃｒの実施方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のための方法、特にマルチプレックスPCRの実施方法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、生物製剤研究、病気の監視および診断のユビキタス手段になっている。PCRによる核酸配列の増幅は、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,965,188号に記載されている。PCRは従来より周知であり、科学文献中に頻繁に記載されている。PCR Applications ((1999) Innis他編、Academic Press, San Diego)、PCR Strategies ((1995) Innis他編、Academic Press, San Diego); PCR Protocols ((1990) Innis他編、Academic Press, San Diego);およびPCR Technology ((1989) Erlich編、Stockton Press, New York)を参照のこと。
「リアルタイム」PCRアッセイは、標的配列の開始量を同時に増幅し、検出し、定量することができる。典型的なリアルタイムPCRプロトコルは、各々の標的配列に特異的な標識プローブの使用を必要とする。該プローブは好ましくは、特定の波長で光を吸収し放出する１以上の蛍光成分により標識される。標的配列またはそれのアンプリコンにハイブリダイズすると、プローブは、プローブハイブリダイゼーションまたは加水分解の結果として、蛍光発光に検出可能な変化を示す。
しかしながら、PCRアッセイの主な課題は、多数の標的を単一チューブの中で分析する能力に依然として残存している。事実上全ての医薬や診断の分野において、着目の遺伝子座の数が急速に増加している。例えば、２～３例を挙げると、法医学DNAプロファイリング、病原性微生物検出、多座位遺伝病スクリーニング、多重遺伝子発現研究では、多数の遺伝子座を解析しなければならない。
大多数の従来法では、アッセイをマルチプレックス化（多重化）する能力は検出装置により制約される。具体的には、同一反応において多数のプローブを使用することは、異なる蛍光標識の使用を必要とする。同時に多数のプローブを検出するためには、１つの装置が各々のプローブにより発せられる光シグナルを識別できなければならない。商業化されている大部分の従来技術では、同一反応容器中で４～７種以上の異なる波長の検出は可能でない。従って、標的当たり１つの特異的に標識されたプローブを使って、同一容器において検出することができるのは、最大で４～７種の標的である。実際上、少なくとも１つの標的が一般にコントロール核酸（対照核酸）である。従って、実際には、多くても３～６個の実験用標的が同一チューブ中で検出できる。わずか約６～７種の色素だけが、有意な重複する干渉を伴わずに可視スペクトル内に収まるスペクトル幅を有するので、蛍光色素の使用も制限される。よって、アッセイをマルチプレックス化する能力は、増幅と検出計画に極端な変更を行わない限り、臨床的ニーズに遅れずに対応していけないだろう。
増幅反応をマルチプレックス化する追加の能力は、ポストPCR融解アッセイにより提供される。2006年６月23日出願の米国特許出願第11/474,071号明細書を参照のこと。融解アッセイでは、増幅された核酸がその特有の融解プロファイルにより同定される。融解アッセイは二本鎖標的の、すなわち標識プローブと標的とで形成された二本鎖の融解温度（融点）を測定することを含む。米国特許第5,871,908号明細書に記載の通り、蛍光標識プローブを使って融解温度を決定するためには、標的核酸とプローブとの二本鎖が制御された温度プログラムのもと徐々に加熱（または冷却）される。二本鎖の解離は、相互作用性フルオロフォア間のまたはフルオロフォアとクエンチャーの間の距離を変化させる。相互作用性フルオロフォアは、米国特許第6,174,670号明細書に記載のように別々のプローブ分子に結合させることができる。あるいは、米国特許第5,871,980号明細書に記載のように、一方のフルオロフォアをプローブに結合し、もう一方のフルオロフォアを核酸二本鎖中にインターカレート（挿入）することができる。別の代替法として、フルオロフォアを単一のプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。二本鎖が融解すると、フルオロフォアが一本鎖になったプローブ中でクエンチャーと一緒になるので蛍光が消光される。
核酸二本鎖の融解は、関連する蛍光変化量を測定することによりモニタリングされる。蛍光の変化量は「融解プロファイル」と呼ばれるグラフ上に表示される。異なるプローブ－標的二本鎖が異なる温度で融解する（または再アニールする）ように設計されるので、各プローブは独特の融解プロファイルを呈するだろう。適切に設計されたプローブは、同じアッセイで別のプローブのものから明確に識別できる融解温度を有するはずである。多数の現存するソフトウェアにより、それらの目標を念頭に置いて同一チューブ型マルチプレックスアッセイ用にプローブを設計することができる。例えば、Visual OMP（商標）ソフトウェア（DNA Software Inc., Ann Arbor, Mich.）が、様々な反応条件下で核酸二本鎖の融解温度を測定可能にする。
色検出を用いたマルチプレックスPCR法とその後の増幅後融解アッセイは、米国特許第6,472,156号明細書に記載されている。そのような方法で検出できる標的の数は、検出可能な波長の数と識別可能な融解プロファイルの数との積である。従って、融解アッセイを色検出に加えることが、多数の標的を検出できる可能性の一歩前進であった。
増幅後融解アッセイは、定量目的、すなわち標的核酸を同定する目的に最も一般的に用いられる。米国特許第6,174,670号、同第6,427,156号および同第5,871,908号明細書を参照のこと。融解曲線関数を微分することにより融解ピークを得る方法が知られている。Ririe他（”Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction,”(1997) Anal. Biochem. 245:154-160）は、微分法が生成物の混合物により作成された融解曲線を分けるのに役立つことに気づいた。微分後、混合物の各成分により作成された融解ピークが容易に識別可能になる。増幅後の融解シグナル、すなわち融解ピークは、サンプル中の核酸の量に比例して高くなることも従来より知られている。例えば、米国特許第6,245,514号明細書は、二本鎖インターカレート（挿入）色素を用いた増幅後融解アッセイが、導関数融解ピークを作成すること、および次いで専用ソフトを使って該ピークを積分することを教示している。積分は、増幅効率および増幅された核酸の相対量についての情報を提供する。
実際、定量的アッセイを乗り越えて、同一試料中の複数標的を定量できることが望ましいだろう。例えばSparano他、“Development of the 21-gene assay and its application in clinical practice and clinical trials,” J. Clin. Oncol. (2008) 26(5):721-728参照。標的の量を定量できることは、臨床用途において、例えば患者の血清中のウイルス負荷量の測定、薬物療法に応答した遺伝子の発現レベルの測定、または療法への応答を推測するための腫瘍の分子シグネチャーの決定において有用である。
多数の標的核酸検出方法が知られている。現在利用可能な核酸検出のための均一系アッセイとしては、TaqMan（登録商標）、Ampliflour（登録商標）、色素結合、対立遺伝子選択的カイネティックPCR、およびScorpion（登録商標）プライマーアッセイが挙げられる。これらのアッセイ手法は、検出すべき各々の標的核酸について異なる色素を必要とするために、容易にマルチプレックス化（多重化）することができず、そのため改善の可能性が制約される。そのような制約を克服するために、幾つかの最近の研究は、容易に分離でき検出することができる開裂可能な「タグ（tag）」部分を含むオリゴヌクレオチドプローブの使用を開示している（例えばChenna他、米国特許出願公開第2005/0053939号；Van Den Boom, 米国特許第8,133,701号明細書を参照のこと）。より最近になって、構造に基づいたオリゴヌクレオチドプローブ開裂を用いることによる、マルチプレックス化核酸標的同定を実施するための改良方法が米国特許出願公開第2014/0272955号、同第2015/0176075号および同第2015/0376681号公報に記載されている。DNAからのまたは核酸混合物からの標的核酸を検出するための他の方法、いわゆるPTO開裂・伸長アッセイにおける「プローブ用およびタグ付用オリゴヌクレオチド」（“Proving and Tagging Oligonucleotide”;PTO）と「捕捉および鋳型用オリゴヌクレオチド」（“Capturing and Templating Oligonucleotide”; CTO）の使用による検出方法は、Chun他により米国特許第8,809,239号明細書に記載されている。しかしながら、標的核酸の高処理量マルチプレックス検出を実施するための正確な方法が依然必要とされている。特に、PCRアッセイのエンドポイント（またはエンドポイント付近）にまたはPCRアッセイの完結後に、増幅生成物の検出がわずか一度で起こる必要があるエンドポイントPCRアッセイにおいて、標的核酸の高処理量マルチプレックス検出を実施することが有利であろう。
本発明は、核酸配列検出のための新規方法であって、特に多重標的核酸が増幅の対数期を超えてエンドポイントに達するまで（すなわちプラトー期（安定期）になるまで）PCR反応が行われる、多重標的核酸の検出のための新規方法を提供する。該方法は、２つの固有の特徴、すなわち非相補的タグ部分とクエンチング分子、を有する新規オリゴヌクレオチドプローブの使用により実施される。
従って、一観点では、本発明は試料中の標的核酸の増幅および検出方法であって、次の工程：(a) 単一反応容器中に標的核酸を含む試料を(i) 各々のオリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸の部分配列の反対の鎖にハイブリダイズすることができる一対のオリゴヌクレオチドプライマー；(ii) アニーリング部分とタグ部分を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、ここでタグ部分が標的核酸配列に相補的でないヌクレオチド配列または非ヌクレオチド分子を含み、アニーリング部分が標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的であり、かつオリゴヌクレオチドプライマーのペアによって結合される標的核酸の部分配列の領域にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、ここで該プローブが前記タグ部分上またはアニーリング部分上に置かれたレポーター成分と、前記アニーリング部位上に置かれた第一のクエンチャーとを含んで成る相互作用性二重標識を更に含み、そして前記レポーター成分がヌクレアーゼ感受性開裂部位により第一のクエンチャー成分から隔てられ；ここで前記タグ部分が温度依存性形式でクエンチング分子に可逆的に結合され、該クエンチング分子は、該クエンチング分子が前記タグ部分に結合するとレポーター成分をクエンチングすることができる１以上のクエンチャー成分を含むかまたはそれと連携され；
(b) 5´－3´ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使ったPCRにより、各PCRサイクルの伸長段階の間にポリメラーゼのヌクレアーゼ活性が前記プローブのアニーリング部分上にある第一のクエンチング成分からレポーター成分を開裂・分離させるようにしてPCRにより標的核酸を増幅させ；
(c) 前記レポーター成分からの１以上のシグナルを、前記クエンチング分子がタグ部分に結合する第一の温度で測定し；
(d) 前記レポーター成分からの１以上のシグナルを、第一の温度よりも高温であり前記クエンチング分子がタグ部分に結合しない第二の温度で測定し；
(e) 前記第一の温度で検出された１以上のシグナルの中央値または平均値を、前記第二の温度で検出された１以上のシグナルの中央値または平均値から減算することにより計算シグナル値を得；それにより閾値シグナル値より高い計算シグナル値が標的核酸の存在を決定する、
ことを含む方法を提供する。
一実施態様では、前記タグ部分は、それが核酸ポリメラーゼにより伸長することができないような修飾を含む。一態様では、レポーター成分はオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分上に存在する。別の態様では、レポーター成分はオリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分上に置かれ、そして第二のクエンチャー成分を含むクエンチング分子に温度依存性形式で相互作用することができる。一態様では、タグ部分が標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、クエンチング分子が、オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分に少なくとも部分的に相補的でありハイブリダイゼーションによりタグ部分に結合するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。別の態様では、前記オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分もしくはクエンチング分子または該タグ部分と該クエンチング分子の双方が、１以上のヌクレオチド修飾を含む。更に別の態様では、１以上のヌクレオチド修飾がロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、架橋核酸（BNA）、2’-O-アルキル置換、L-鏡像異性ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから成る群より選択される。一態様では、レポーター成分が蛍光色素であり、そしてクエンチャー成分が該蛍光色素からの検出可能シグナルをクエンチング（消光）する。
別の観点では、本発明は、試料中の２以上の標的核酸配列を検出する方法であって、
(a) 単一反応容器中の２以上の標的核酸配列を含むと思われる試料を、(i) 第一の標的核酸配列の各鎖に相補的であるヌクレオチド配列を有する第一対のオリゴヌクレオチドプライマー、および第二の標的核酸配列の各鎖に相補的であるヌクレオチド配列を有する第二対のオリゴヌクレオチドプライマー；(ii) 第一のオリゴヌクレオチドプローブであって、第一の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記第一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された第一の標的核酸配列とアニールするヌクレオチド配列を含み、ここで、前記第一のオリゴヌクレオチドプローブは、検出可能なシグナルを生成することができる蛍光成分と、前記蛍光成分により生成した検出可能シグナルをクエンチングすることができる第一のクエンチャー成分とを含み、ここで前記蛍光成分はヌクレアーゼ感受性開裂部位により第一のクエンチャー成分から隔てられている、前記第一のオリゴヌクレオチドプローブ；(iii) 第二のオリゴヌクレオチドプローブであって、２つの異なる部分、すなわち第二の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的であり前記第二対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合される第二の標的核酸配列とアニールするヌクレオチド配列を含むアニーリング部分で、第二のクエンチャー成分を含むアニーリング部分と；前記アニーリング部分の5´末端もしくは3´末端に取り付けられるかまたはアニーリング部分の一領域にリンカーを介して取り付けられ、そして前記２以上の標的核酸配列に非相補的である（相補的でない）ヌクレオチド配列を含むタグ部分であって、前記第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の蛍光成分と同一である蛍光成分を含み、その検出可能シグナルが前記アニーリング部分上の第二のクエンチャー成分によりクエンチングされることができ、ここで前記蛍光成分がヌクレオチド感受性開裂部位により第二のクエンチング成分から隔てられている前記タグ部分；との２つの異なる部分を含む前記第二のオリゴヌクレオチドプローブ；(iv) 前記第二のオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記タグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成するヌクレオチド配列を含むクエンチングオリゴヌクレオチドであって、該クエンチングオリゴヌクレオチドがタグ部分にハイブリダイズすると前記タグ部分上の蛍光成分により生成される検出可能シグナルをクエンチングする第三のクエンチャー成分を含む、前記クエンチングオリゴヌクレオチド
と接触させ；
(b) 5´－3´ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使ったポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、各PCRサイクルの伸長段階の間に核酸ポリメラーゼの5´－3´ヌクレアーゼ活性が前記第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の第一のクエンチング成分から蛍光成分を開裂・分離させ、そして第二のオリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分上の第二のクエンチング成分からタグ部分上の蛍光成分を開裂・分離させるような方法でPCRにより第一および第二の標的核酸配列を増幅させ；
(c) 前記クエンチングオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドプローブからのタグ部分にハイブリダイズする第一の温度で、１以上の蛍光シグナルを測定し；
(d) 前記第一の温度よりも高温であり前記クエンチングオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドプローブからのタグ部分にハイブリダイズする第二の温度で、１以上の蛍光シグナルを測定し；
(e) 前記第一の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値を、前記第二の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値から減算することにより計算シグナル値を得、ここで
閾値より高い第一の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値が前記第一の標的核酸配列の存在を決定し、そして閾値シグナル値より高い計算シグナル値が第二の標的核酸の存在を決定する
を含む方法を提供する。一態様では、PCR増幅が増幅の対数期の後（例えば安定期）でエンドポイントに到達するのを可能にする。
一実施形態では、タグ部分が核酸ポリメラーゼにより伸長させることができないような修飾を含む。別の実施形態では、タグ部分がアニーリング部分の5´末端に取り付けられる。更に別の実施形態では、タグ部分がアニーリング部分の３´末端に取り付けられる。更に別に実施形態では、タグ部分がアニーリング部分の一領域にリンカーを介して結合される。別の実施形態では、第二のオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分もしくはクエンチングオリゴヌクレオチド、またはタグ部分とクエンチングオリゴヌクレオチドの両方が１以上のヌクレオチド修飾を含む。更に別の実施形態では、１以上のヌクレオチド修飾がロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、架橋核酸（BNA）、2’-O-アルキル置換、L-鏡像異性ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから成る群より選択される。
さらに別の態様では、本発明は、試料中の２以上の標的核酸配列を検出する方法であって、次の工程：
(a) 単一反応容器中の２以上の標的核酸配列を含むと思われる試料を、(i) 第一の標的核酸配列の各鎖に相補的であるヌクレオチド配列を有する第一対のオリゴヌクレオチドプライマー、および第二の標的核酸配列の各鎖に相補的であるヌクレオチド配列を有する第二対のオリゴヌクレオチドプライマー；(ii) 第一のオリゴヌクレオチドプローブであって、第一の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記第一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された第一の標的核酸配列とアニールするヌクレオチド配列を含み、ここで、前記第一のオリゴヌクレオチドプローブは、検出可能なシグナルを生成することができる蛍光成分と、前記蛍光成分により生成した検出可能シグナルをクエンチングすることができる第一のクエンチャー成分とを含み、ここで前記蛍光成分はヌクレアーゼ感受性開裂部位により第一のクエンチャー成分から隔てられている、前記第一のオリゴヌクレオチドプローブ；（iii）前記第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分に少なくとも部分的に相補的でありかつ第一のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成するヌクレオチド配列を含む第一のクエンチングオリゴヌクレオチドであって、前記第一のクエンチングオリゴヌクレオチドは、該第一のクエンチングオリゴヌクレオチドが第一のタグ部分にハイブリダイズすると第一のタグ部分上の蛍光成分により生成された検出可能シグナルをクエンチングする第二のクエンチング成分を含む、第一のクエンチングオリゴヌクレオチド；(iv) 第二のオリゴヌクレオチドプローブであって、第二の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記第二対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された第二の標的核酸配列とアニールするヌクレオチド配列を含むアニーリング部分と；前記第二のアニーリング部分の5´末端もしくは3´末端に取り付けられるかまたは第二のアニーリング部分の一領域にリンカーを介して取り付けられ、そして前記２以上の標的核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第二のタグ部分であって、第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分のヌクレオチド配列に比較して異なる核酸配列または異なるヌクレオチド修飾を有し、ここで第二のタグ部分は、第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の蛍光成分と同一でありかつその検出可能シグナルが第二のアニーリング部分上の第三のクエンチャー成分によりクエンチングすることができる蛍光成分を含み、前記蛍光成分がヌクレオチド感受性開裂部位により第二のクエンチング成分から隔てられている前記第二のタグ部分；との２つの異なる部分を含む、前記第二のオリゴヌクレオチドプローブ；(v) 前記第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のタグ部分に少なくとも部分的に相補的な配列を含みかつ前記第二のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成する第二のクエンチングオリゴヌクレオチドであって、該第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが第二のタグ部分にハイブリダイズすると、前記第二のタグ部分上の蛍光成分により生成される検出可能シグナルをクエンチングする第四のクエンチャー成分を含む、前記第二のクエンチングオリゴヌクレオチド
と接触させ；ここで前記第二のクエンチングオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のタグ部分との間で形成された二本鎖は、前記第一のクエンチングオリゴヌクレオチドと第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分との間で形成された二本鎖よりも高い融解温度（Ｔm）を有し；
(b) 5´－3´ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使ったポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、各PCRサイクルの伸長段階の間に、核酸ポリメラーゼの5´－3´ヌクレアーゼ活性が(i) 前記第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分上にある第一のクエンチング成分から第一のタグ部分上の蛍光成分を開裂・分離させ、ここで伸長段階では第一のクエンチングオリゴヌクレオチドが第一のタグ部分にハイブリダイズしたままであり；そして(ii) 前記第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分上の第三のクエンチング成分から第二のタグ部分上の蛍光成分を開裂・分離させ、ここで伸長段階では第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが第二のタグ部分にハイブリダイズしたままであり；
(c) 第一のクエンチングオリゴヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドプローブからの第一のタグ部分にハイブリダイズせずかつ第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドプローブからの第二のタグ部分にハイブリダイズしたままである第一の温度で、１以上の蛍光シグナルを測定し；
(d) 第一の温度より高く、第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドプローブからの第二のタグ部分にハイブリダイズしない第二の温度で、１以上の蛍光シグナルを測定し；
(e) 第一の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値を第二の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値から減算することにより計算シグナル値を得；それにより閾値よりも高い前記第一の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値が、第一の標的核酸配列の存在を決定し、そして閾値シグナル値より高い計算シグナル値が第二の標的核酸の存在を決定する
を含んでなる方法を提供する。一態様では、PCR増幅が増幅の対数期を超えて（例えば安定期で）エンドポイントに到達するのを許容する。
一実施形態では、第一のタグ部分と第二のタグ部分の双方とも、両タグ部分が核酸ポリメラーゼにより伸長することができないような修飾を含む。
一実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の3´末端に取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の3´末端に取り付けられる。別の実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の3´末端に取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の5´末端に取り付けられる。別の実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の3´末端に取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の一領域にリンカーを介して取り付けられる。
一実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の5´末端に取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の5´末端に取り付けられる。別の実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の5´末端に取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の3´末端に取り付けられる。別の実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の5´末端に取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の一領域にリンカーを介して取り付けられる。
一実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の一領域にリンカーを介して取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の5´末端に取り付けられる。別の実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の一領域にリンカーを介して取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の3´末端に取り付けられる。別の実施形態では、第一のタグ部分が第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分の一領域にリンカーを介して取り付けられ、そして第二のタグ部分が第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分の一領域にリンカーを介して取り付けられる。
一実施形態では、第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分もしくは第一のクエンチングオリゴヌクレオチドまたは第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のタグ部分もしくは第二のクエンチングオリゴヌクレオチドのいずれか１つまたはそれらの任意組み合わせが、１以上のヌクレオチド修飾を含有する。一実施形態では、１以上のヌクレオチド修飾がロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、架橋核酸（BNA）、２´－Ｏ－アルキル置換、Ｌ－鏡像変異ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなる群より選ばれる。
図１は、本発明の方法を実施するのに用いられるオリゴヌクレオチドプローブの図解である。 図２は、タグ部分の分離およびその後のクエンチングオリゴヌクレオチドの解離を示す、本発明の方法の図式的描写である。 図３は、本発明の方法の一態様を示す図である。 図４は、本発明の方法の別の態様を使ったシグナル検出温度を示す。 図５は、本発明の方法を実施するのに用いられるオリゴヌクレオチドプローブの種々の態様を示す。 図６は、実施例１に記載のような、クエンチングオリゴヌクレオチドと蛍光標識された相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションと２種の温度での解離の結果を示す。 図７は、実施例２に記載のようなHIV1-M標的の増加するバックグラウンドの中のIC標的の検出を示す。 図８は、実施例２に記載のような増加するIC標的バックグラウンドの中のHIV1-M標的の検出を示す。 図９は、実施例２に記載のような増加するIC標的バックグラウンドの中のHIV1-M ltr標的の検出を示す。 図10は、実施例３に記載のような実験でのICサンプルの検出結果を示す。サーマルチャネル１（58℃、図10Ａ）対サーマルチャネル２（83℃、図10Ｂ）におけるICのみの検出。ベースライン減算を用い、ここでICシグナル温度補正と減算をサーマルチャネル２に適用した。サーマルチャネル１：閾値＝0.75、84コピーのIC検出、ｐ＝0.58、λ＝0.88。サーマルチャネル２：閾値＝1.00、０コピーのIC検出、ｐ＝0、λ＝0。 図11は、実施例３に記載のような実験におけるHIV1-M ltrサンプルの検出結果を示す。サーマルチャネル１（58℃、図11Ａ）対サーマルチャネル２（83℃、図11Ｂ）におけるHIV-1のみの検出。ベースライン減算を用い、ここでICシグナル温度補正と減算をサーマルチャネル２に適用した。サーマルチャネル１：閾値＝0.75、０コピーのHIV1-M ltr検出、ｐ＝0、λ＝0。サーマルチャネル２：閾値＝1.00、48コピーのHIV-1 ltr検出、ｐ＝0.39、λ＝0.50。 図12は、実施例３に記載のような実験におけるICおよびHIV1-M ltrサンプルの二重標的検出結果を示す。ICとHIV1-Mの両方をサーマルチャネル１（58℃、図12Ａ）対サーマルチャネル２（83℃、図12Ｂ）において検出した。ベースライン減算、ICシグナル温度補正と減算をサーマルチャネル２に適用した。サーマルチャネル１：閾値＝0.75、82コピーのIC検出、ｐ＝0.57、λ＝0.85。サーマルチャネル２：閾値＝1.00、47コピーのHIV-1 ltr検出、ｐ＝0.39、λ＝0.49。
定義
本明細書中で用いる場合の用語「試料（またはサンプル）」は、核酸を含む検体または培養物（例えば微生物学的培養物）を包含する。用語「試料」は、生物学的試料と環境試料の両方を含む意味もある。試料は合成起源の検体を含む場合がある。生物学的試料としては、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜繊毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例えば気管支肺胞上皮、胃、腹腔、乳管、耳、関節鏡視下）、生検試料、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、乳、乳汁、胚細胞、および胎児細胞が挙げられる。好ましい態様では、生物学的試料は血液、より好ましくは血漿である。本明細書中で用いる場合、用語「血液」は、全血または血液の任意画分、例えば従来定義のような血清または血漿を包含する。血漿とは、抗凝固剤で処理した血液の遠心分離から得られる全血の画分を言う。血清は、血液試料を凝固させた後に残った液体の水性部分を指す。環境試料としては、表面物質、土壌、水および工業試料といった環境材料、並びに食品や日用品加工器具、機器、装置、用具、使い捨ておよび非使い捨て製品から得られた試料が挙げられる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものとして解釈してはならない。
本明細書中で用いられる用語「標的」または「標的核酸」は、その存在を検出または測定することになっているか、あるいはその機能、相互作用または特性を研究することになっている任意の分子を意味するものである。従って、標的は、本質的に検出可能なプローブ（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）もしくはアッセイが実在するかまたは当業者により製造することができる本質的に任意の分子を包含する。例えば、標的は、検出可能なプローブ（例えば抗体）と結合することができるまたは他の形で接触状態にすることができる生体分子、例えば核酸分子、ポリペプチド、脂質または炭水化物であることができ、ここで検出可能プローブは本発明の方法により検出することができる核酸を含む。本明細書中で用いる場合、「検出可能プローブ」は、着目の標的生体分子にハイブリダイズまたはアニーリングすることができる任意の分子または剤を指す。本発明の一観点では、標的が核酸であり、そして検出可能プローブがオリゴヌクレオチドである。用語「核酸」および「核酸分子」は、本開示全体を通して相互に交換可能に用いることができる。該用語はオリゴヌクレオチド、オリゴ、ポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（DNA）、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA（mtDNA）、相補的DNA(cDNA)、細菌DNA、ウイルスDNA、ウイルスRNA、RNA、伝令RNA（mRNA）、転移RNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、siRNA、触媒性RNA、クローン、プラスミド、M13、P1、コスミド、細菌性人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、増幅核酸、アンプリコン、PCR生産物、および他の型の増幅核酸、RNA／DNAハイブリッド、並びにポリアミド核酸（PNA）を指し、その全てが一本鎖と二本鎖形態のいずれであることもでき、そして異なって限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドやその組み合わせおよび／または混合物と同様な形で機能する天然のヌクレオチドの既知類似体を包含するだろう。よって、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド三リン酸、二リン酸および一リン酸、並びにポリ核酸やオリゴヌクレオチド中に存在する一リン酸モノマーをはじめとする、天然型と修飾／非天然型ヌクレオチドの双方を指す。ヌクレオチドは、リボ；2´－デオキシ；2´,3´－デオキシ、並びに当業界で周知である他のヌクレオチド模倣体の無数の配列であることもできる。模倣体（ミミック）としては、連鎖停止ヌクレオチド、例えば3´－O－メチル、ハロゲン化塩基または糖置換体；非糖類のアルキル環構造を含む代替糖構造；イノシンをはじめとする代替塩基；デアザ修飾；カイ（chi；Ｋ）およびプサイ（psi；Ψ）リンカー修飾；標識修飾；ホスホジエステル修飾または置換、例えばホスホロトリエート、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、アミド、エステル、エーテル；並びに塩基性または完全ヌクレオチド間置換、例えば光開裂可能なニトロフェニル成分のような開裂結合が挙げられる。
標的の存在または不在は、定量的にまたは定性的に測定することができる。標的は多種多様な形態、例えば単純なもしくは複雑な混合物、または実質的に純粋な形態で存在することができる。例えば、標的は、別の成分を含む試料中の一部分であることができ、あるいは試料の単独成分または主成分であることができる。例えば、標的は、完全細胞もしくは組織の一成分、細胞もしくは組織抽出物、それの分画した溶解物、または実質的に純粋な分子であることができる。また、標的は既知のまたは未知の配列や構造を有することができる。
用語「増幅反応」は、核酸の標的配列のコピー数を増やすための任意の生体外（in vitro）手段を指す。増幅反応の成分としては、限定されないが、例えばプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、dNTPs等が挙げられる。用語「増幅する」は、典型的には、標的核酸の「指数的」増加を指す。しかしながら、本明細書中で用いる場合の「増幅する」は、核酸の特定の標的配列の数の直線的増加を指すが、以前の単一プライマー伸長段階とは異なる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、標的二本鎖DNAの特定セグメントまたは部分配列が、等比数列で増幅される方法を指す。PCRは当業者に周知である；例えば米国特許第4,683,195号と同第4,683,202号明細書、およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis他編、1990を参照のこと。
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により連結された天然型もしくは改変型のヌクレオシドモノマーの直鎖状オリゴマーまたはそれの類似体を指す。オリゴヌクレオチドとしては、標的核酸に特異的に結合することができるデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それのアノマー形、ペプチド核酸（PNA）等が挙げられる。一般に、モノマーはホスホジエステル結合またはそれの類似体によって連結され、数モノマー単位、例えば３～４単位から、数十モノマー単位、例えば40～60単位までのサイズに及ぶオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドは、異なって記載されない限り、「ATGCCTG」のような文字の配列によって表される時は常に、該ヌクレオチドが左から右に5´－3´の順序であること、そして「A」がデオキシアデノシンを表し、「C」がデオキシシチジンを表し、「G」がデオキシグアノシンを表し、「T」がデオキシチミジンを表し、そして「U」がリボヌクレオシドのウリジンを表すことが理解されるだろう。一般にオリゴヌクレオチドは４つの天然デオキシヌクレオチドを含むが、しかし、それらはリボヌクレオシドまたは非天然のヌクレオチド類似体を含んでもよい。酵素がその活性に特別なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件、例えば一本鎖DNA、RNA／DNA二本鎖であること等の要件を有する場合、そのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に適当な組成物を選ぶことは当業者の知識の十分範囲内である。
本明細書中で用いる時「オリゴヌクレオチドプライマー」または単純に「プライマー」とは、標的核酸鋳型上の１つの配列にハイブリダイズしかつオリゴヌクレオチドプローブの検出を促進するポリヌクレオチド配列を指す。本発明の増幅態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは核酸合成の開始点として働く。非増幅態様では、オリゴヌクレオチドプライマーを、開裂剤により開裂させることができる構造を構築するために用いることができる。プライマーはしばしば長さ50ヌクレオチド未満であり、例えば長さ12～25ヌクレオチドである。PCRに用いられるプライマーの長さと配列は、当業者に既知の理論に基づいて設計することができる。
本明細書中で用いられる用語「オリゴヌクレオチドプローブ」は、着目の標的核酸にハイブリダイズまたはアニーリングすることができ、かつ標的核酸の特異的検出を可能にするポリヌクレオチド配列を指す。
「レポーター成分」または「レポーター分子」は、検出可能シグナルを付与する分子である。検出可能な表現型は例えば、発色、蛍光または発光であることができる。「クエンチャー成分」または「クエンチャー分子」は、レポーター成分から検出可能シグナルをクエンチング（消光）することができる分子である。
「ミスマッチ（不適正）ヌクレオチド」または「ミスマッチ」とは、その位置（１または複数）で標的配列に相補的でないヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つのミスマッチを有してもよいが、2, 3, 4, 5, 6もしくは7またはそれ以上のミスマッチヌクレオチドを有すること可能である。
本明細書中で用いる場合の用語「多型」は、対立遺伝子変異体を指す。多型は、単一ヌクレオチド多型（SNP）並びに単純な配列長の多型を含み得る。多型は、別の対立遺伝子に比較した１つの対立遺伝子の所の１以上のヌクレオチド置換のため、または挿入、欠失、重複、逆位、もしくは当業界で既知の別の変異のためであることができる。
本明細書中で用いる場合の用語「修飾」は、分子レベル（例えば塩基成分、糖成分またはリン酸エステル骨格）でのオリゴヌクレオチドプローブの改変を指す。ヌクレオシド修飾としては、限定されないが、開裂遮断物質（ブロッカー）または開裂誘導物質（インデューサー）の導入、副溝結合剤の導入、同位体濃縮、同位体枯渇、重水素の導入およびハロゲン修飾が挙げられる。ヌクレオシド修飾はまた、ハイブリダイゼーションの緊縮性を増加させるかまたはオリゴヌクレオチドプローブの融解温度を増加させる成分を含むことができる。例えば、ヌクレオチド分子が2´炭素と4´炭素を連結する追加の橋架けにより修飾され、ヌクレアーゼによる開裂に抵抗性であるロックド核酸（LNA）ヌクレオチドを生成することができる（Imanishi他、米国特許第6,268,490号およびWengel他、米国特許第6,794,499号明細書中に記載の通り）。オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分およびクエンチングオリゴヌクレオチド分子の組成は、安定な二本鎖を形成するそれらの能力によってのみ制限される。従って、それらのオリゴヌクレオチドはDNA、L-DNA、RNA、L-RNA、LNA、L-LNA、PNA（ペプチド核酸、例えばNielsen他、米国特許第5,539,082号明細書に記載のもの）、BNA（架橋核酸、例えばRahman他、J. Am. Chem. Soc. 2008; 130 (14): 4886-96に記載のような2´,4´-BNA(NC) [2´-O,4´-C-アミノメチレン架橋核酸]、L-BNA等（ここで、「L-XXX」は核酸の糖単位のL-鏡像異性体を指す）またはヌクレオチド塩基、糖もしくはホスホジエステル骨格上への他の任意の既知の変更と修飾を含むことができる。
ヌクレオシド修飾の他の例としては、種々の2´置換、例えばオリゴヌクレオチドの糖成分に導入されるハロ、アルコキシおよびアリルオキシ基が挙げられる。2´-置換-2´-デオキシアデノシンポリヌクレオチドはDNAよりむしろ二本鎖RNAに似ているという証拠が与えられている。Ikehara他（Nucleic Acids Res., 1978, 5, 3315）は、ポリＡ、ポリＩ、ポリＣとその相補体との二本鎖中での2´-フルオロ置換が、標準融解アッセイにより測定した時にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドポリ二本鎖よりも有意に安定であることを示した。Inoue他（Nucleic Acids Res., 1987, 15, 6131）は、全ての核酸ヌクレオチド上に2´-OMe（O-メチル）置換基を含む混合オリゴヌクレオチド配列の合成を記載している。混合2´-OMe置換オリゴヌクレオチドは、同じ配列のRNA-DNAヘテロ二本鎖よりも有意に強いRNA-RNA二本鎖と同じ程度に強くそのRNA相補体にハイブリダイズした。従って、糖の2´位での置換基の例としては、F, CN, CF3, OCF3, OMe, OCN, O-アルキル, S-アルキル, SMe, SO2Me, ONO2, NO2, NH3, NH2, NH-アルキル, OCH3=CH2 および OCCHが挙げられる。
ある分子の別の分子への結合、例えば標的ポリヌクレオチドのためのプローブに関する用語「特異的」または「特異性」は、２つの分子間の安定な複合体の認識、接触および形成を指すが、その分子の別の分子への実質的に少ない認識、接触または複合体形成も一緒に指す。本明細書中で用いる場合、用語「アニールする」は、２つの分子間の安定な複合体の形成を指す。
プローブは、該プローブの少なくとも１つの領域が核酸配列の相補体の少なくとも１つの領域と実質的配列同一性を共有するならば、その核酸配列に「アニールすることができる」。「実質的配列同一性」は、少なくとも80％、好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％、95％または99％、最も好ましくは100％の配列同一性である。DNA配列やRNA配列の配列同一性を決定する目的では、ＵとＴがしばしば同一ヌクレオチドと見なされる。例えば、配列ATCAGCを含むプローブは、配列GCUGAUを含む標的RNA配列にハイブリダイズすることができる。
本明細書中で用いる場合の用語「開裂剤」は、オリゴヌクレオチドプローブを開裂させて断片を生成することができる任意の手段、例えば非限定的に酵素を指す。増幅が起こらない方法の場合には、開裂剤はもっぱらオリゴヌクレオチドプローブの第二の部分またはその断片を開裂、分解または他の方法で分離する働きをすることができる。開裂剤は酵素であってもよい。開裂剤は天然、合成、未修飾または修飾型であることができる。
増幅が起こる方法では、開裂剤は好ましくは、合成活性（または重合活性）とヌクレアーゼ活性を有する酵素である。そのような酵素はしばしば核酸増幅酵素である。核酸増幅酵素の例は、核酸ポリメラーゼ酵素、例えばサーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼ（TaqMan；登録商標）またはE.コリ（E. coli）DNAポリメラーゼＩである。該酵素は天然型、未修飾または修飾型であることができる。
「核酸ポリメラーゼ」は、核酸へのヌクレオチドの組み込みを触媒する酵素を言う。典型的な核酸ポリメラーゼとしては、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、末端転移酵素、逆転写酵素、テロメラーゼ等が挙げられる。
「耐熱性DNAポリメラーゼ」は、特定の時間の間高温にかけたときに安定であり（すなわち破壊や変性に耐える）かつ十分な触媒活性を保持するDNAポリメラーゼを言う。例えば、耐熱性DNAポリメラーゼは、二本鎖核酸を変性させるのに必要な時間の間高温に付した時、その後のプライマー伸長反応を実行するのに十分な活性を保持する。核酸変性に必要な加熱条件は当業界で周知であり、米国特許第4,683,202号および同第4,683,195号明細書に例示されている。本明細書中で用いる場合、耐熱性DNAポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）のような温度循環反応における使用に適当である。耐熱性核酸ポリメラーゼの例としては、高度好熱菌サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）Taq DNAポリメラーゼ、サーマス種Z05ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus）ポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ポリメラーゼ、例えばTMA-25およびTMA-30ポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
「修飾」ポリメラーゼは、少なくとも１つのモノマーが、参照配列、例えば生来型もしくは野生型ポリメラーゼとは異なっているまたは別の修飾型ポリメラーゼとは異なっているポリメラーゼを指す。典型的な修飾としては、モノマー挿入、欠失および置換が挙げられる。修飾ポリメラーゼは、２以上の親に由来する、同定可能な成分配列（例えば構造もしくは機能ドメイン等）を有するキメラポリメラーゼも包含する。同じく修飾ポリメラーゼの定義内に含まれるのは、参照配列の化学的修飾を含むものである。修飾ポリメラーゼの例としては、G46E E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNAポリメラーゼ、Z05 DNAポリメラーゼ、Δ（デルタ）Z05ポリメラーゼ、Δ（デルタ）Z05-Goldポリメラーゼ、Δ（デルタ）Z05Rポリメラーゼ、E615G Taq DNAポリメラーゼ、E678G TMA-25ポリメラーゼ、E678G TMA-30ポリメラーゼ等が挙げられる。
「5´→3´ヌクレアーゼ活性」または「5´－3´ヌクレアーゼ活性」という用語は、ヌクレオチドが核酸鎖の5´端から除去される核酸鎖合成と連関した核酸ポリメラーゼの活性を指し、例えばE.コリ DNAポリメラーゼＩはこの活性を有し、他方でクレノウ断片はこの活性を持たない。5´→3´ヌクレアーゼ活性を有する酵素の中には5´→3´エキソヌクレアーゼ活性を有するものもある。そのような5´→3´エキソヌクレアーゼの例としては次のものが挙げられる：B.サチリス（B. subtilis）由来のエキソヌクレアーゼ、脾臓由来のホスホジエステラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、酵母由来エキソヌクレアーゼII、酵母由来エキソヌクレアーゼＶ、およびニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）由来エキソヌクレアーゼ。
用語「プロパンジオール」または「プロパンジオールスペーサー」は、1,3－プロパンジオールを指し、これはプロパン－1,3－ジオール、1,3－ジヒドロキシプロパンおよびトリメチレングリコールと同義語である。用語「HEG」または「HEGスペーサー」はヘキサエチレングリコールを指し、これは3,6,9,12,15－ペンタオキサヘプタデカン－1,17－ジオールと同義語である。
本発明の様々な観点は核酸ポリメラーゼの特別な性質に基づいている。核酸ポリメラーゼは、幾つかの活性、中でも5´－3´ヌクレアーゼ活性を有することができる。その活性により、核酸ポリメラーゼは、より大きな相補的ポリヌクレオチドにアニールしたオリゴヌクレオチドから、モノヌクレオチドまたは小さなオリゴヌクレオチドを開裂させることができる。 開裂が効率的に起こるためには、上流のオリゴヌクレオチドも、より大きな同じポリヌクレオチドにアニールしなければならない。
5´－3´ヌクレアーゼ活性を利用する標的核酸の検出は、米国特許第5,210,015号；同第5,487,972号および同第5,804,375号明細書；並びにHolland他、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280中に記載のような「TaqMan（登録商標）」または「5´-ヌクレアーゼアッセイ」により実施することができる。TaqManアッセイでは、増幅反応の間、増幅領域とハイブリダイズする標識された検出プローブが存在する。プローブは、該プローブがDNA合成のためのプライマーとして作用するのを防ぐように修飾される。増幅は5´－3´エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを使って実施される。増幅の各合成工程の間、伸長させるべきプライマーの下流の標的核酸にハイブリダイズするどんなプローブも、DNAポリメラーゼの5´→3´エキソヌクレアーゼ活性により分解される。よって、新規標的鎖の合成がプローブの分解をもたらし、分解産物の蓄積が標的配列の合成の尺度を提供する。
分解生成物の検出に適当な任意の方法を5´ヌクレアーゼアッセイにおいて使用することができる。しばしば、検出プローブが２つの蛍光色素で標識され、その１つがもう１つの色素の蛍光をクエンチング（消光）することができる。それらの色素は、プローブがハイブリダイズしない状態であるときにクエンチングが起こり、そして該DNAポリメラーゼの5´→3´エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの開裂が２つの色素の間で起こるようにプローブに取り付けられ、ここでレポーターまたはデテクター色素が5´末端に取り付けられそしてクエンチング色素が内部部位に取り付けられる。増幅反応はそれらの色素の間でプローブを開裂させ、クエンチングの同時消去および初めにクエンチングされた色素から観察される蛍光の増加をもたらす。反応中の蛍光の増加を測定することにより、分解生成物の蓄積がモニタリングされる。米国特許第5,491,063号と同第5,571,673号明細書は、増幅と同時に起こるプローブの分解を検出する代替法を記載している。
標的核酸の検出のための5´ヌクレアーゼアッセイは、5´－3´エキソヌクレアーゼ活性を有する任意のポリメラーゼを使用することができる。よって、ある態様では、5´－ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが耐熱性でかつ熱活性核酸ポリメラーゼである。そのような耐熱性ポリメラーゼとしては、限定されないが、多様な種の真正細菌のThermus属、Thermatoga属およびThermosipho属の種からのポリメラーゼの生来型および組換え型、並びにそれのキメラ形が挙げられる。例えば、本発明の方法において用いることができるThermus種ポリメラーゼとしては、Thermus aquaticus (Taq) DNAポリメラーゼ、Thermus thermophilus (Tth) DNAポリメラーゼ、Thermus 種Z05が挙げられる（例えば米国特許第5,405,774号；同第5,352,600号；同第5,079,352号；同第4,889,818号；同第5,466,591号；同第5,618,711号；同第5,795,762号明細書に記載）。本発明の方法において使用することができるThermatogaポリメラーゼとしては、例えば、Thermatoga maritima DNAポリメラーゼおよびThermatoga neapolitana DNAポリメラーゼが挙げられ、一方使用することができるThermosiphoポリメラーゼの例は、Thermosipho africanus DNAポリメラーゼである。Thermatoga maritimaおよびThermosipho africanus DNAポリメラーゼの配列は、公開番号WO 92/06200を有する国際特許出願第PCT/US91/07035中に記載されている。
5´ヌクレアーゼアッセイでは、増幅検出は典型的には増幅と同時である（すなわち「リアルタイム」）。ある実施形態では、増幅検出は定量的であり、増幅検出がリアルタイムである。ある実施形態では、増幅検出が定性的である（例えば標的核酸の存否のエンドポイント検出）。ある実施形態では、増幅検出が増幅の後に行われる。ある実施形態では、増幅検出が定性的であり、増幅検出が増幅の後に、すなわち増幅が増幅対数期を超えてエンドポイントに達した時である。
本発明では、単一反応容器（例えばチューブ、ウェル）中での２以上の標的核酸のPCR増幅とエンドポイント検出は、第一の標的の存在を検出するための標準のTaqMan（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブ、および第二、第三またはそれ以上の標的の存在を検出するための１以上の新規TaqMan（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを使って、実施することができ、ここで前記プローブは全て同一の蛍光標識を含む。あるいは、全ての標的核酸の存在を検出するための新規TaqManオリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。この新規プローブは２つの際立った特徴を有する。
新規プローブの第一の特徴は、それが２つの異なる部分を含むことである。第一部分はアニーリング部分と呼ばれ、それが標的配列とハイブリダイズすることができるように標的核酸配列に対し少なくとも部分的に相補的である配列を含む。アニーリング部分はクエンチャー成分も含む。一態様では、アニーリング部分が、クエンチャー成分をクエンチングすることができかつヌクレアーゼ感受性開裂部位により該クエンチャー成分から隔てられる蛍光色素のようなレポーター成分（例えば蛍光色素）を含有する。該オリゴヌクレオチドプローブの第二部分は、タグ部分と呼ばれる。一態様では、タグ部分はアニーリング部分の5´末端に取り付けられる。別の態様では、タグ部分がアニーリング部分の3´末端に取り付けられる。別の態様では、タグ部分がリンカーを介してアニーリング部分の5´末端と3´末端の間の任意の部位に取り付けられる。タグ部分は標的核酸配列に相補的でないヌクレオチド配列であって標的核酸に結合することができない「フラップ（flap）」領域を形成するヌクレオチド配列を含むことができる（5´フラッププローブの図形描写については図１を参照のこと）。タグ部分は、それがアニーリング部位に結合させることができ、かつクエンチング分子（下記の項に記載する）と相互作用できる限り、任意の有機成分、または反復単位（例えば(CH2-CH2-O)n等）のような非ヌクレオチドから成ることもできる。一実施形態では、タグ部分は、アニーリング部位上のクエンチャー成分によりクエンチングすることができる蛍光色素などのレポーター成分を含有する。オリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分とタグ部分は、随意に非ヌクレオチドリンカーにより互いに離れていてもよい。このリンカーは、炭素、炭素と酸素、炭素と窒素、またはそれらの任意組み合わせから成ることができ、任意の長さのものであることができる。更に、該リンカーは直鎖状成分または環状成分を含むことができる。該リンカーは、単一の単位から誘導されてもよく、リン酸エステル結合によって分離された複数の同一もしくは異なる単位から誘導してもよい。該リンカーの目的は、オリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分とタグ部分の接点のところに一領域を構築するためである。タグ部分がアニーリング部分から分離されると、リンカーも核酸ポリメラーゼにより伸長されるのを防ぐ。あるいは、分離されたタグ部分上への別の修飾が、核酸ポリメラーゼによる伸長ができないようにする。
新規プローブの第二の特徴は、タグ部分がクエンチング分子に結合することである。タグ部分がヌクレオチド配列である場合、クエンチング分子はタグ部分のヌクレオチド配列に完全にまたは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドであることができる。クエンチング分子は、タグ部分上のレポーター成分（例えば蛍光色素）からのシグナルをクエンチングすることもできるクエンチャー成分、すなわち第二のクエンチャー成分も含有するかまたはそれと連携される。クエンチング分子上にあるまたはそれと連携されたクエンチャー成分（第二のクエンチャー成分）は、アニーリング部分上のクエンチャー成分（第二のクエンチャー成分）と同一であるかまたは異なることができる。従って、PCR増幅を実行する前に、タグ部分上のレポーター成分が、プローブのアニーリング部分上のクエンチャー成分と、クエンチング分子上にあるまたはそれと連合されたクエンチャー成分（例えば図１に示されるようなクエンチングオリゴヌクレオチド）の両方によりクエンチングされる。
PCR増幅を実施するためおよび5´ヌクレアーゼアッセイにおいて標的核酸のエンドポイント検出を実施するために当該新規プローブを使用する一般原理を下記に記載する。まず、標的核酸を含むと思われる試料を用意する。次いでその試料を単一の反応容器（単一の試験管またはマルチウェルマイクロプレートの単一ウェル）の内側で、標的核酸のアンプリコンを生成することができるオリゴヌクレオチドプライマー対と新規オリゴヌクレオチドプローブの両方を含有するPCR試薬と接触させる。PCR増幅は、各PCRサイクルの伸長段階の間、該ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性が、該プローブのアニーリング部分上のクエンチング成分からタグ部分を開裂・分離させるような、5´→3´ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使うことにより開始する。分離されたタグ部分は、場合によりそれが核酸ポリメラーゼにより伸長できないような修飾（例えば非ヌクレオチドリンカー）を含んでもよい。
十分なアンプリコンが生産されているレベルにPCRアッセイが達した時（増幅対数期の後または安定期）またはPCRアッセイが完了した後、分離されたタグ部分上のレポーター成分からのシグナルを第一の温度で、通常、クエンチング分子がまだタグ部分に結合しているアニーリングおよび／または伸長温度で、測定する。クエンチング分子上のまたはそれと連合したクエンチャー成分の存在のため、タグ部分上のレポーター成分（例えば蛍光色素）からのシグナルがまだクエンチングされる。ある場合には、第一の温度で１回以上、レポーター成分からのシグナルを測定し、そして第一の温度での平均または中央シグナル値を得ることが有利である。次いで、クエンチング分子がもはやタグ部分に結合しない温度の所で２回目のシグナルの読取りを実行する。クエンチング分子がタグ部分のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであるならば、この解離はクエンチングオリゴヌクレオチド分子とタグ部分との間の二本鎖形成の融解温度（Ｔm）で起こる。次いで、クエンチングオリゴヌクレオチド上のまたはそれと連合したクエンチャー成分によりもはやクエンチングされないレポーター成分からのシグナルを、二本鎖のＴm温度でまたはそれより高い第二の温度で測定する。実際、第二の温度は、タグ部分の100％近くが一本鎖形であるのを保証するＴｍ温度より上であるのが好ましいかもしれない。しかしながら、Ｔm温度より低い温度でシグナルを測定することも可能である。ある場合には、レポーター成分からのシグナルを第二の温度で複数回測定し、そして第二の温度での平均または中央シグナル値を得ることが有利かもしれない。次いで、クエンチング分子がまだタグ部分に結合している第一の温度で検出されたシグナル（または平均もしくは中央シグナル値）を、クエンチング分子がタグ部分に結合しない第二の温度で検出されたシグナルから差し引くことにより、計算シグナル値を決定する（図２と図３参照）。計算シグナル値は、所望により、温度により影響を受ける場合があるシグナルの補正のため正規化することができる。例えば、蛍光シグナルは高温で減少することが知られており、従って異なる温度で得られたシグナル値を正規化するために標準を使用することができる。
それらのシグナル測定と計算は、一般にPCRアッセイの最後（または最後の近く）にまたはPCRアッセイの完結後に実施され、そして決定されたシグナル値を使って、標的核酸の存否を決定することができる。
エンドポイントPCRアッセイの一例は、デジタルPCR（dPCR）である。dPCRでは、サンプル中の個々の核酸分子が多数の別々の領域内に局在化され濃縮されるようにサンプルが区分化（partition）される。個々の核酸分子のクエンチングまたは単離は、マイクロウェルプレート、キャピラリー、エマルションの分散相、ミニチュアチャンバーのアレイ、並びに核酸結合性表面上で実施されている。サンプルの区分化は、分子集団がポアソン分布に従うと仮定することにより、様々な分子の数を推測できるようにする。結果として、各部分が「０」または「１」分子を含むであろうし、すなわちそれぞれ陰性もしくは陽性反応であろう。PCR増幅後、PCR最終産物陽性反応を含む各領域をカウントすることにより、核酸を定量することができる。従来のPCRでは、PCR増幅サイクルの数が出発のコピー数に比例する。しかしながら、dPCRは、最初のサンプル量を決定するのに増幅サイクルの数に依存せず、不確かな指数関数的データへの依存を排除するので、従って絶対的定量を提供する。現在のデジタルPCRアプローチは、反応液をナノウェル中に配列して（アレイ）区分するマイクロ流体ベースのアプローチにより、または反応液を微液滴に分割する液滴ベースのアプローチにより実行される。
マイクロ流体アプローチを用いる市販のシステムとしては、Fluidigm Corporation (South San Francisco, CA)からのBiomark HDシステム、およびThermo Fisher Scientific (Waltham, MA)からのQuantStudio 3D dPCRシステムが挙げられる。商業的デジタルPCRランドスケープにおける別の競合相手としては、Raindropシステムを所有するRainDance Technologies社 (Billerica, MA)、およびQX200液滴ベースシステムを所有するBio-Rad社 (Hercules, CA)がある。
唯一のレポーター成分（例えば１つの蛍光色素）を使ったマルチプレックスPCRアッセイは、様々なＴm温度で各々のクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズするタグ部分を有するオリゴヌクレオチドプローブを設計することにより可能である。例えば、全て同じフルオロフォア（発蛍光団）で標識された３つのオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、１反応において３種の標的核酸の増幅と検出を達成することができる。標準のTaqMan（登録商標）オリゴヌクレオチドプローブを使って、第一の温度（普通PCRサイクルのアニーリング温度）で蛍光シグナルを測定することにより、第一の標的を検出することができる。低Ｔmタグ－クエンチングオリゴヌクレオチド二本鎖を有する第一の「タグ付」プローブを使って、Ｔm温度の所またはそれより上でありかつ第一の温度よりも高い第二の温度で、計算蛍光値を測定することにより、第二の標的を検出することができる。次いで、高Ｔmタグ－クエンチングオリゴヌクレオチド二本鎖を有する第二の「タグ付」プローブを使って、それのＴm温度の所またはそれより上でありかつ第二の温度より高い第三の温度で、計算蛍光値を測定することにより、第三の標的を検出することができる（図４参照）。理論上、４～７種の異なるレポーター成分（例えば蛍光色素）と共に１つのTaqManプローブと２つの異なるタグ付きプローブを用いて、１反応において12～21種の異なる標的核酸を検出することができ、または１つのTaqManプローブと３つの異なるタグ付プローブを用いて、１反応において16～28種の異なる標的核酸を検出することができる。
その上、本発明の新規プローブは、タグ部分がヌクレオチド配列でありそしてクエンチングオリゴヌクレオチドに連結され、ヘアピン（すなわちステム－ループ構造）を形成するように設計することができる。この構造では、「ステム」部分がタグ部分とクエンチングオリゴヌクレオチド間の相補的領域から成り、一方で「ループ」部分が非相補的ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド、例えば前に記載したリンカーを含んで成ることができる。
本発明の新規プローブが該プローブのタグ部分上に置かれたレポーター成分を有すると記載されているけれども、レポーター成分がクエンチングオリゴヌクレオチド上の第二のクエンチャー成分と可逆的に相互作用できる限り、レポーター成分をアニーリング部分上に配置することも可能であり、かつ第一のクエンチャー成分をタグ部分上に配置することも可能である。一般的意味において、レポーター成分は、それが5´ヌクレアーゼ（TaqMan；登録商標）アッセイ中にアニーリング部分上の第一のクエンチング成分から解離されるような形でプローブオリゴヌクレオチド中に設計し配置させることができ、さらにクエンチング分子上の第二のクエンチング成分と可逆的に相互作用するように設計することができる。そのような様々な他に取り得る態様の幾つかは図５に見ることができる。
本発明の方法を実施するために、プローブオリゴヌクレオチドのタグ部分のおよびクエンチング分子の設計において幾つかの特徴が必要である。一態様では、タグ部分とクエンチング分子の両方がヌクレオチド配列から構成される。この状況下では、タグ部分とクエンチングオリゴヌクレオチドは両方とも標的核酸配列には特異的にハイブリダイズしないが、所望の温度でのハイブリダイゼーションを許容するように互いに対し完全にまたは部分的に相補的であるべきである。双方とも、PCR増幅中に核酸ポリメラーゼによって伸長されないようにするためにそれらの3´末端に修飾を含むことができる。タグ部分上のレポーター成分（例えば蛍光色素）とクエンチングオリゴヌクレオチド上のクエンチャー成分は双方とも5´末端、3´末端、または5´と3´末端の間の任意の位置に置くことができるが、ただしそれらは、タグ部分がクエンチングオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたとき、レポーター成分からの検出可能シグナルをクエンチングできるように互いと近接して置かれなければならない。
種々のＴm温度で各々のクエンチングオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズさせる予定の種々のタグ部分に関して、タグ部分上に、クエンチングオリゴヌクレオチド上に、またはオリゴヌクレオチド長さを短縮できるようにタグ部分とクエンチングオリゴヌクレオチドの両方の上に、修飾ヌクレオチドを導入することができる。融解温度を増加させる働きをするヌクレオチド修飾の例は、LNA、PNA、G-clamp（9´-(アミノエトキシ)フェノキサジン-2´-デオキシシチジン）、プロピニルデオキシウリジン（pdU）、プロピニルデオキシシチジン（pdC）、および糖基の様々な2´修飾、例えば2´-O-メチル修飾が挙げられる。タグ部分へのまたはクエンチングオリゴヌクレオチドへの不必要な結合を防止するために働くことができる別のタイプの修飾は、ヌクレオチドの鏡像異性Ｌ形の使用、例えばL-DNA、L-RNAまたはL-LNAを含むだろう。
別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分とクエンチング分子は、温度依存性形式で互いと可逆的に相互作用する非ヌクレオチド分子を含んで成る。そのような非ヌクレオチド相互作用の例としては、非限定的に、タンパク質－タンパク質相互作用、タンパク質－ペプチド相互作用（例えばペプチドアプタマー）、タンパク質－小分子相互作用、ペプチド－小分子相互作用、小分子－小分子相互作用、ペプチド－小分子相互作用、小分子－小分子相互作用が挙げられる。一例として、ビオチンとアビジン（またはストレプトアビジン）との間の周知の相互作用は、相互作用を可逆的にしかつ温度依存性にするために、ビオチン成分を修飾（例えばデスチオビオチン）またはアビジン成分を修飾（Nordlund他、J. Biol. Chem. 2003, 278(4) 2479-2483）あるいは両方を修飾することにより、利用することができる。
更に別の態様では、タグ部分とクエンチング分子との相互作用は、配列特異的形式でのヌクレオチド配列（１または複数）と非ヌクレオチド分子との間の相互作用を伴うだろう。それらのタイプの相互作用の例としては、非限定的に、核酸アプタマー、DNA結合性タンパク質もしくはペプチド、並びにDNA副溝結合剤が挙げられる。配列特異的DNA結合分子の設計と合成は、幾つかの学術論文（例えばDervan, Science, 1986, 232, 464-471; White他、Nature, 1998, 391, 468-471参照）に記載されており、それらの方法を利用して温度依存性であるタグ部分とクエンチング分子との間に相互作用を構築することができる。同様に、二本鎖ヌクレオチドと可溶性クエンチャー間の相互作用は、クエンチング成分がそれ自体クエンチング分子内に含まれる必要が無いように検討することもできる。しかし、クエンチング成分は、タグ部分がクエンチング分子に結合された時のみレポーター成分と相互作用しそれをクエンチングするという可溶性形態であってもよい。
本発明の実施形態は下記の実施例において更に記載されるが、それは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：クエンチングオリゴヌクレオチドによるクエンチングの検証
クエンチャー成分を含むクエンチングオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプローブの解離された蛍光標識タグ部分とハイブリダイズすることができ、かつ二本鎖の融解温度より低い温度であるが二本鎖が解離された状態になる融解温度より高い温度で蛍光シグナルをクエンチング（消光）することを確認するために実験を行った。表１は、タグ部分のヌクレオチド配列とクエンチングオリゴヌクレオチドを含む。クエンチングオリゴヌクレオチドQ0はクエンチャーを含まず、一方クエンチングオリゴヌクレオチドQ1はその5´末端にBHQ-2クエンチャーを含有する。
Figure 0007221199000001
9FAM9 TAGオリゴヌクレオチドを、クエンチングオリゴヌクレオチド無し(QX)でまたは1：5のモル比でQ0もしくはQ1クエンチングオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。次いで混合物を、60 mM Tricine、120 mM酢酸カリウム、5.4％DMSO、0.027％アジ化ナトリウム、3％グリセロール、0.02％Tween 20、43.9μM EDTA、0.2U/μL UNG、0.1μM 19TAGC9FAMC9、0.5μM Q0またはQ1、400μM dATP、400μM 4CTP、400μM dGTP、800μM dUTPおよび3.3 mM酸化マンガンから成る50μL反応液中で循環させた。典型的なPCR増幅反応に類似しているサイクル条件を表２に示す。
Figure 0007221199000002
実験結果を図６に示す。FAM色素からのシグナルを58℃で測定した時、クエンチングオリゴヌクレオチド無し（QX）でまたはクエンチング成分を持たないクエンチングオリゴヌクレオチドを用いた場合（Q0）に蛍光が検出されたが、Q1クエンチングオリゴヌクレオチドの存在下ではいずれのサイクルでも全くシグナルが検出されなかった。対照的に、蛍光を80℃で測定した時、Q1クエンチングオリゴヌクレオチドの存在下であっても全てのサイクルでシグナルを検出することができた。この結果は、より高温では、Q1クエンチングオリゴヌクレオチドはもはやTAGとハイブリダイズせず、クエンチングが全く観察されないことを示す。
実施例２：エンドポイント検出によるタグ付プローブとクエンチングオリゴヌクレオチドを用いたPCR
０、100または1,000コピー数の内部コントロール（IC）鋳型を０、10または100コピーのHIV1-M鋳型の存在下で50サイクルのPCRに渡り増幅させるというマトリックス実験を実施した。TaqMan化学とTAGS（Thermal assisted generation of signals；熱アシスト式シグナル発生）の併用を通して、タグ付プローブとそれらの各々のクエンチングオリゴヌクレオチドを使って、単一蛍光チャネルにおいて３種の固有の標的の検出が達成された。エンドポイント蛍光シグナル（最後の４回のサイクルの平均蛍光シグナル）を、TaqMan（登録商標）PCR後３つの標的全てについてFAM蛍光チャネルにて測定した。
表３は、本実験に使用したプローブとクエンチングオリゴヌクレオチドの配列を示す。
Figure 0007221199000003
各50μL反応液は、３％グリセロール、60 mM Tricine、120 mM酢酸カリウム、400μM各dATP、dCTPおよびdGTP、800μM dUTP、0.3μMの各正（forward）プライマー、0.3μMの各逆（reverse）プライマー、0.3μMの検出プローブ（配列１～３）、0.6μMの各Q-タグ（配列４～５）、5.4％DMSO、0.02％Tween 20、43.9μM EDTA、0.03％アジ化ナトリウム、0.2U/μLのウラシル－N-グリコシラーゼ（UNG）、0.67μM NTQ21-46Aアプタマー、0.9U/μLのZ05Dポリメラーゼ、および3.3 mM酢酸マンガン（pH 6.3）を含んだ。増幅はRoche LightCycler（登録商標）480装置上で行い、反応液を55サイクルの代わりに50サイクルを実施しそしてデータ取得を最後の４サイクルの間だけ実行すること以外は表２に示される通りの温度プロファイルに供した（下記参照）。
実験の結果は図７～９に示され、ここでＸ軸上の種々のサンプルについてＹ軸にエンドポイント絶対蛍光がプロットされる。58℃では、IC標的の存在下で蛍光が観察された（図７、サーマルチャネル１）。これは増幅の反復サイクルの間の従来のTaqManプローブ（IC,配列番号４）の開裂のためである。加えて、80℃では、HIV1-M gag標的が存在する時に蛍光が観察され（図８、サーマルチャネル２）、これはタグ付プローブ（HIV1-M gag、配列番号５）が相補的クエンチングオリゴヌクレオチド（Q-Tag gag、配列番号７）からプローブ開裂断片を開裂させそして該断片の融解からの蛍光を増加させるためである。更に、95℃では、HIV1-M ltr標的が存在するときに蛍光が観察され（図９、サーマルチャネル３）、これは第二のタグ付プローブ（HIV1-M ltr、配列番号６）が開裂し、そして第二の相補的クエンチングオリゴヌクレオチド（Q-Tag ltr、配列番号８）からのプローブ開裂断片の融解から蛍光を増加させるためである。サーマルチャネルごとの限定された蛍光閾値（破線）の下の蛍光シグナルを有するどのサンプルも、陰性（ネガティブ）と見なされた。
温度補正サーマルチャネル１（58℃）の蛍光をサーマルチャネル２（80℃）の蛍光から減算し、HIV1-tagの特定シグナルを得た。同様に、温度補正サーマルチャネル２蛍光をサーマルチャネル３（95℃）蛍光から減算し、HIV1-M ltrの特定シグナルを得た。従って、IC標的の増幅は58℃（サーマルチャネル１）で特異的に検出され、HIV1-M gag標的の増幅は80℃（サーマルチャネル２）で特異的に検出され、そしてHIV1-M ltr標的の増幅は95℃（サーマルチャネル３）で特異的に検出されることが観察された。
実姉例３：エンドポント検出によるタグ付プローブとクエンチングオリゴヌクレオチドを用いたデジタルPCR
約47コピー数のHIV1-M RNAまたは83コピー数の内部コントロールRNAを、個別にまたは一緒に、384ウェルプレート上の96ウェルに交差して増幅させるという実験を実施した。２種のフルオレセイン標識TaqMan（登録商標）プローブが各反応に存在した。第一のプローブ（表４、配列番号９）は内部コントロール標的に特異的に結合し58℃でまたはそれ以下で増幅を検出する（サーマルチャネル１）。5´非標的結合タグ配列を有する第二のプローブ（表４、配列番号10）は、HIV1-M ltr標的に特異的に結合し、83℃に限定された第二のサーマルチャネルでの増幅を検出する。
Figure 0007221199000004
各16μL反応液は、３％グリセロール、60 mM Tricine、120 mM酢酸カリウム、400μM各dATP、dCTPおよびdGTP、800μM dUTP、0.3μMの各正（forward）プライマー、0.3μMの各逆（reverse）プライマー、0.3μMの検出プローブ（配列番号９と10）、0.6μMのQ-タグ（配列番号11）、5.4％DMSO、0.02％Tween 20、43.9μM EDTA、0.03％アジ化ナトリウム、0.2U/μLのウラシル－N-グリコシラーゼ（UNG）、0.67μM NTQ21-46Aアプタマー、0.9 U/μLのZ05Dポリメラーゼ、および3.3 mM酢酸マンガン（pH 6.3）を含んだ。
PCR増幅はRoche LightCycler（登録商標）480装置上で行った。反応液を実姉例１の表２に記載したような温度プロファイルにかけた。PCR循環前に（ベースライン蛍光を定義するため）およびPCR後に各サーマルチャネルにて蛍光を捕集した。ベースライン減算蛍光データをプロットし、各サーマルチャネルで陰性（標的の存在なし）対陽性（１以上の標的が存在）ウェルを判定するために閾値を定義した。ICが存在するとき、従来のICプローブの開裂と、増幅の反復サイクルの間のクエンチャーからのレポーター色素の分離のために、サーマルチャネル１において蛍光シグナルが観察された（図10Ａ）。HIV1-M ltrが存在するとき、タグ付HIV1-M ltrプローブ開裂と、相補的Q-tagからのレポーター色素標識プローブ開裂断片の融解のため、サーマルチャネル２において蛍光シグナルが観察された（図11Ｂ）。両方の標識が存在するとき、両サーマルチャネルにおいてシグナルが観察された（図12Ａと12Ｂ）。従って、IC交差シグナルを温度補正と蛍光減算によってサーマルチャネル２から除去し、サーマルチャネル２におけるHIV1-Mのみの検出を可能にした（図12Ｂ）。
96ウェルの各セットについての陰性反応の比率をポアソン演算し、それらのウェルに渡り各標的の全コピー数を決定した。ポアソン方程式はλ＝－ln（１－ｐ）に基づき、ここでλはウェル当たりの算定コピー数であり、ｐは全ウェルの陽性率である。96ウェルに渡る全コピー数は、λに96を乗じることにより計算される。結果を表５に示し、それは単一蛍光チャネルと２つのサーマルチャネルにおける、エンドポイント検出でのHIV1-M ltr鋳型に対するIC鋳型の特異的検出を証明する。
Figure 0007221199000005
配列表情報
配列番号１：9FAM9TAG オリゴヌクレオチド配列
CGTCGCCAGTCAGCTCCGGT
配列番号２：Q0 クエンチングオリゴヌクレオチド配列（クエンチャーなし）
CCGGAGCTGACTGGCGACG
配列番号３：Q1 クエンチングオリゴヌクレオチド配列（5´末端上にBHQ-1クエンチャー有）
CCGGAGCTGACTGGCGACG
配列番号４：IC TaqManプローブオリゴヌクレオチド配列（FAM/BHQ/ホスフェート）
TGCGCGTCCCGTTTTGATACTTCGTAACGGTGC
配列番号５：HIV1-M gagタグ付プローブオリゴヌクレオチド配列（BHQ/FAM/ホスフェート)
TCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTATCTTTTAACCACACATTGGCACCGCCGTCT
配列番号６：HIV1-M ltr タグ付プローブオリゴヌクレオチド配列 (BHQ/FAM/ホスフェート)
TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCACGTCTCGGTGGTGGCGTTT
配列番号７：HIV1-M gag クエンチングオリゴヌクレオチド配列 (3´末端上にBHQ-1クエンチャー有)
AGACGGCGGTGCCAATGTGTG
配列番号８：HIV1-M ltrクエンチングオリゴヌクレオチド配列 (3´末端上にBHQ-1クエンチャー有)
AAACGCCACCACCGAGACGTG
配列番号９：ICプローブオリゴヌクレオチド配列(実施例３より)
TGCGCGTCCCGTTTTGATACTTCGTAACGGTGC
配列番号10：HIV1-M ltrプローブオリゴヌクレオチド配列（実施例３より）
TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCACACATTGGCACCGCCGTCT
配列番号11：Q-Tagオリゴヌクレオチド配列 (実施例３より)
AGACGGCGGTGCCAATGTGTG

Claims (15)

  1. 試料中の標的核酸の増幅および検出方法であって、次の工程：
    (a) 単一反応容器中に前記標的核酸を含む前記試料を
    (i) 各々のオリゴヌクレオチドプライマーが前記標的核酸の部分配列の反対の鎖にハイブリダイズすることができる、１対のオリゴヌクレオチドプライマー；
    (ii) アニーリング部分とタグ部分を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、前記タグ部分が標的核酸配列に相補的でないヌクレオチド配列または非ヌクレオチド分子を含み、前記アニーリング部分が標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記オリゴヌクレオチドプライマー対によって結合される、前記標的核酸の前記部分配列の領域にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、ここで前記オリゴヌクレオチドプローブが前記タグ部分上または前記アニーリング部分上に置かれたレポーター成分と、前記アニーリング部分上に置かれた第一のクエンチャー成分とを含んで成る相互作用性二重標識を更に含み、そして前記レポーター成分がヌクレアーゼ感受性開裂部位により前記第一のクエンチャー成分から隔てられ；ここで前記タグ部分が温度依存性形式でクエンチング分子に可逆的に結合され、前記クエンチング分子は、該クエンチング分子が前記タグ部分に結合すると前記レポーター成分をクエンチングすることができる１以上のクエンチャー成分を含むかまたはそれと連携される、前記オリゴヌクレオチドプローブ
    と接触させ；
    (b) 5´－3´ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使ったポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、各PCRサイクルの伸長段階の間にポリメラーゼの前記5´－3´ヌクレアーゼ活性が前記オリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分上にある第一のクエンチャー成分から前記タグ成分を開裂・分離させるようにしてPCRにより前記標的核酸を増幅させ；
    (c) 前記レポーター成分からの１以上のシグナルを、前記クエンチング分子が前記タグ部分に結合する第一の温度で測定し；
    (d) 前記レポーター成分からの１以上のシグナルを、前記第一の温度より高温でありかつ前記クエンチング分子がタグ部分に結合しない第二の温度で測定し；
    (e) 前記第一の温度で検出された１以上のシグナルの中央値または平均値を、前記第二の温度で検出された１以上のシグナルの中央値または平均値から減算することにより、計算シグナル値を得；それにより閾値シグナル値より高い計算シグナル値が前記標的核酸の存在を決定できるようになる
    を含み、ここで工程（ｂ）のＰＣＲ増幅が、増幅の対数期の後のエンドポイントに到達するまで行われ、そして工程（ｃ）及び（ｄ）が、工程（ｂ）のＰＣＲ増幅のプラトー期の間又は工程（ｂ）のＰＣＲ増幅の終わりのＰＣＲサイクル中に行われる、方法。
  2. 前記レポーター成分が前記オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分上に存在する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記タグ部分が、標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、そして前記クエンチング分子が、オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分に少なくとも部分的に相補的でありハイブリダイゼーションによりタグ部分に結合するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記タグ部分が、核酸ポリメラーゼにより伸長させることができないような修飾を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記オリゴヌクレオチドプローブのタグ部分もしくはクエンチング分子、または該タグ部分とクエンチング分子の双方が、１以上のヌクレオチド修飾を含み、そして前記１以上のヌクレオチド修飾がロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、架橋核酸（BNA）、2’-O-アルキル置換、L-鏡像異性ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 試料中の２以上の標的核酸配列を検出する方法であって、次の工程：
    (a) 単一反応容器中の前記２以上の標的核酸配列を含むと思われる前記試料を、
    (i)第一の標的核酸配列の各鎖に相補的であるヌクレオチド配列を有する第一対のオリゴヌクレチドプライマー、および第二の標的核酸配列の各鎖に相補的であるヌクレオチド配列を有する第二対のオリゴヌクレオチドプライマー；
    (ii)第一の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記第一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された第一の標的核酸配列の領域内でアニーリングするヌクレオチド配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記第一のオリゴヌクレオチドプローブは、検出可能なシグナルを生成することができる蛍光成分と、前記蛍光成分により生成した検出可能シグナルをクエンチングすることができる第一のクエンチャー成分とを含み、ここで前記蛍光成分はヌクレアーゼ感受性開裂部位により第一のクエンチャー成分から隔てられている、前記第一のオリゴヌクレオチドプローブ；
    (iii)２つの異なる部分を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブであって、
    －前記第二の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記第二対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された第二の標的核酸配列の領域内でアニーリングするヌクレオチド配列を含み、第二のクエンチャー成分を含むアニーリング部分と；
    －前記アニーリング部分の5´末端もしくは3´末端に取り付けられるかまたは前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して取り付けられ、前記２以上の標的核酸配列に非相補的であるヌクレオチド配列を含むタグ部分であって、前記第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の蛍光成分と同一である蛍光成分を含み、その検出シグナルがアニーリング部分上の第二のクエンチャー成分によってクエンチングされることができ、ここで前記蛍光成分がヌクレオチド感受性開裂部位により第二のクエンチャー成分から隔てられる前記タグ部分との、２つの異なる部分を含む前記第二のオリゴヌクレオチドプローブ；
    (iv)前記第二のオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記タグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成するヌクレオチド配列を含むクエンチングオリゴヌクレオチドであって、該クエンチングオリゴヌクレオチドがタグ部分にハイブリダイズすると、タグ部分上の蛍光成分により発せられる検出可能シグナルをクエンチングする第三のクエンチャー成分を含む、クエンチングオリゴヌクレオチド
    と接触させ；
    (b) 5´－3´ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使ったポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、各PCRサイクルの伸長段階の間に核酸ポリメラーゼの5´－3´ヌクレアーゼ活性が
    （i)前記第一のオリゴヌクレオチドプローブ上の第一のクエンチャー成分から蛍光成分を開裂・分離させ、そして
    (ii)第二のオリゴヌクレオチドプローブのアニーリング部分上の第二のクエンチャー成分からタグ部分上の蛍光成分を開裂・分離させるような方法でPCRにより前記第一および第二の標的核酸配列を増幅させ、ここで伸長段階の時には前記クエンチングオリゴヌクレオチドがタグ部分にハイブリダイズしたままであり；
    (c) 前記クエンチングオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドプローブからのタグ部分にハイブリダイズする第一の温度で、１以上の蛍光シグナルを測定し；
    (d) 前記第一の温度より高温であり前記クエンチングオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドプローブからのタグ部分にハイブリダイズしない第二の温度で、１以上の蛍光シグナルを測定し；
    (e) 前記第一の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値を、前記第二の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値から減算することにより計算シグナル値を得、それにより閾値よりも高い第一の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値が前記第一の標的核酸配列の存在を決定でき、そして閾値シグナル値よりも高い計算シグナル値が第二の標的核酸の存在を決定できる
    を含み、ここで工程（ｂ）のＰＣＲ増幅が、増幅の対数期の後のエンドポイントに到達するまで行われ、そして工程（ｃ）及び（ｄ）が、工程（ｂ）のＰＣＲ増幅のプラトー期の間又は工程（ｂ）のＰＣＲ増幅の終わりのＰＣＲサイクル中に行われる、前記方法。
  7. 前記タグ部分が前記アニーリング部分の5´末端に取り付けられる、請求項６に記載の方法。
  8. 前記タグ部分が、核酸ポリメラーゼにより伸長させることができないような修飾を含む、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 前記クエンチングオリゴヌクレオチドがステム－ループ構造を介して前記第二のオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分に連結される、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第二のオリゴヌクレオチドプローブのタグ部分もしくはクエンチングオリゴヌクレオチド、または該タグ部分と該クエンチングオリゴヌクレオチドの双方が１以上のヌクレオチド修飾を含み、そして前記１以上のヌクレオチド修飾が、ロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、架橋核酸（BNA）、２´－Ｏ－アルキル置換、Ｌ－鏡像変異ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 試料中の２以上の標的核酸配列を検出する方法であって、次の工程：
    (a) 単一反応容器中の２以上の標的核酸配列を含むと思われる前記試料を、
    (i)第一の標的核酸配列の各鎖に相補的であるヌクレオチド配列を有する第一対のオリゴヌクレオチドプライマー、および第二の標的核酸配列の各鎖に相補的であるヌクレオチド配列を有する第二対のオリゴヌクレオチドプライマー；
    (ii)２つの異なる部分を含む第一のオリゴヌクレオチドプローブであって、
    －第一の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記第一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された第一の標的核酸配列の領域内でアニーリングするヌクレオチド配列を含む第一のアニーリング部分であって、第一のクエンチャー成分を含む前記第一のアニーリング部分と；
    －前記第一のアニーリング部分の5´末端もしくは3´末端に取り付けられまたは前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して取り付けられた第一のタグ部分であって、前記タグ部分は第一のアニーリング部分上の第一のクエンチャー成分によりクエンチングすることができる蛍光成分を含み、ここで前記蛍光成分はヌクレアーゼ感受性開裂部位により第一のクエンチャー成分から隔てられる、前記第一のタグ部分；との、２つの異なる部分を含む前記第一のオリゴヌクレオチドプローブ；
    (iii)前記第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分に少なくとも部分的に相補的でありかつ第一のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成するヌクレオチド配列を含む第一のクエンチングオリゴヌクレオチドであって、前記第一のクエンチングオリゴヌクレオチドは、該第一のクエンチングオリゴヌクレオチドが第一のタグ部分にハイブリダイズすると、第一のタグ部分上の蛍光成分により生成された検出可能シグナルをクエンチングする第二のクエンチャー成分を含む、第一のクエンチングオリゴヌクレオチド；
    (iv)２つの異なる部分を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブであって、
    －第二の標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的でありかつ前記第二対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された第二の標的核酸配列の領域内でアニーリングするヌクレオチド配列を含む第二のアニーリング部分であって第三のクエンチャー成分を含みかつ核酸ポリメラーゼによる伸長を阻止するために3´末端がブロックされている第二のアニーリング部分と；
    ―前記第二のアニーリング部分の5´末端もしくは3´末端に取り付けられるか、又は前記アニーリング部分の領域にリンカーを介して取り付けられ、そして２以上の標的核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分のヌクレオチド配列に比較して異なる核酸配列または異なるヌクレオチド修飾を有する第二のタグ部分であって、第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一タグ部分上の蛍光成分と同一でありかつその検出可能シグナルが第二のアニーリング部分上の第三のクエンチャー成分によりクエンチングすることができる蛍光成分を含み、前記蛍光成分がヌクレオチド感受性開裂部位により第三のクエンチャー成分から隔てられる、前記第二のタグ部分；との、２つの異なる部分を含む第二のオリゴヌクレオチドプローブ；
    (v)前記第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のタグ部分に少なくとも部分的に相補的でありかつ第二のタグ部分にハイブリダイズして二本鎖を形成するヌクレオチド配列を含む第二のクエンチングオリゴヌクレオチドであって、前記第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが第二のタグ部分にハイブリダイズすると第二のタグ部分上の蛍光成分により生成された検出可能シグナルをクエンチングする第四のクエンチャー成分を含む、前記第二のクエンチングオリゴヌクレオチド；
    と接触させ、ここで前記第二のクエンチングオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のタグ部分との間で形成された二本鎖は、前記第一のクエンチングオリゴヌクレオチドと第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分との間で形成された二本鎖よりも高い融解温度（Ｔm）を有し；
    (b) 5´－3´ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使ったポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、各PCRサイクルの伸長段階の間に、前記核酸ポリメラーゼの5´－3´ヌクレアーゼ活性が
    (i)前記第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のアニーリング部分上にある第一のクエンチャー成分から第一のタグ部分上の蛍光成分を開裂・分離させ、ここで伸長段階では第一のクエンチングオリゴヌクレオチドが第一のタグ部分にハイブリダイズしたままであること；および
    (ii)前記第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のアニーリング部分上の第三のクエンチャー成分から第二のタグ部分上にある蛍光成分を開裂・分離させ、ここで伸長段階では第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが第二のタグ部分にハイブリダイズしたままであること
    を可能にし；
    (c) 前記第一のクエンチングオリゴヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドプローブからの第一のタグ部分にハイブリダイズせずかつ第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドプローブからの第二のタグ部分にハイブリダイズしたままである第一の温度で、１以上の蛍光シグナルを測定し；
    (d) 前記第一の温度より高く、第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが第二のオリゴヌクレオチドプローブからの第二のタグ部分にハイブリダイズしない第二の温度で、１以上の蛍光シグナルを測定し；
    (e) 第一の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値を第二の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値から減算することにより計算シグナル値を得；
    ここで閾値より高い前記第一の温度で検出された１以上の蛍光シグナルの中央値または平均値が、前記第一の標的核酸配列の存在を決定し、そして閾値シグナル値より高い計算シグナル値が前記第二の標的核酸の存在を決定する
    を含み、ここで工程（ｂ）のＰＣＲ増幅が、増幅の対数期の後のエンドポイントに到達するまで行われ、そして工程（ｃ）及び（ｄ）が、工程（ｂ）のＰＣＲ増幅のプラトー期の間又は工程（ｂ）のＰＣＲ増幅の終わりのＰＣＲサイクル中に行われる、前記方法。
  12. 前記第一のクエンチングオリゴヌクレオチドが、ステム－ループ構造を介して前記第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分に連結され、及び／又は前記第二のクエンチングオリゴヌクレオチドが、ステム－ループ構造を介して前記第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のタグ部分に連結される、請求項１１に記載の方法。
  13. 遊離された第一のタグ部分と遊離された第二のタグ部分の両方とも、該遊離された両タグ部分が核酸ポリメラーゼによって伸長できないような修飾を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 前記２以上の標的核酸配列の検出がデジタルPCRにより実行される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のタグ部分もしくは前記第一のクエンチングオリゴヌクレオチドまたは前記第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のタグ部分もしくは前記第二のクエンチングオリゴヌクレオチドのいずれか１つまたはそれらの任意組み合わせが、１つ以上のヌクレオチド修飾を含み、そして
    前記１以上のヌクレオチド修飾がロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、架橋核酸（BNA）、２´－Ｏ－アルキル置換、Ｌ－鏡像変異ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
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