JP7249418B2 - 固相モログラフィーによる標的核酸の検出 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年12月20日に出願された米国仮出願第62/782867号(その全内容が本明細書に参照により援用される)の利益を主張する。
本出願は、2019年11月17日に作成された、46kbのサイズを有し、「P34923-WO PCT fling sequence listing」と名付けられた電子テキストファイルとして提出された配列表を含む。
を含む方法であって、全ての工程が標識がない状態で実施される、方法に関する。ある特定の実施態様において、モリゴテンプレートの長さは、少なくとも10ヌクレオチド分だけ、タグ付きプローブの長さよりも長い。他の実施態様において、モリゴの長さは、少なくとも、20ヌクレオチドまたは30ヌクレオチドまたは40ヌクレオチドまたは50ヌクレオチド分だけ、タグ付きプローブの長さよりも長い。ある実施態様において、モリゴテンプレートの長さは、少なくとも10ヌクレオチド分だけ、タグ付きプローブのタグ部分の長さよりも長い。他の実施態様において、モリゴの長さは、少なくとも、20ヌクレオチドまたは30ヌクレオチドまたは40ヌクレオチドまたは50ヌクレオチド分だけ、タグ付きプローブのタグ部分の長さよりも長い。
本明細書で使用される用語「試料」は、核酸を含む標本または培養物(例えば微生物培養物)を含む。「試料」という用語はまた、生物学的試料および環境試料の両方を含むことを意味する。試料は、合成起源の標本を含み得る。生物学的試料には、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液(例えば、気管支肺胞上皮、胃、腹膜、管、耳、関節鏡視下の)、生検試料、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、母体液(breast fluid)、胚細胞、および胎児細胞が含まれる。好ましい実施態様では、生物学的試料は血液であり、より好ましくは血漿である。本明細書で使用される用語「血液」は、一般的な定義のとおり、全血または血液の任意の画分(血清および血漿など)を包含する。血漿とは、抗凝固剤で処理した血液の遠心分離から生じる全血の画分をいう。血清とは、血液試料が凝固した後に残った体液の水様性部分をいう。環境試料には、表面物質、土壌、水および工業試料などの環境物質、ならびに食品および乳製品の加工機器、装置、器具、設備、用具、使い捨ておよび非使い捨てアイテムから得られた試料が含まれる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を制限するものとして解釈されてはならない。
リアルタイムPCR実験を実施して、HIV-1 LTR遺伝子のセクションにハイブリダイズすることができるアニーリング部分を含むタグ化プローブおよびユニークタグ部分が、標的HIV-1 LTR遺伝子の存在下で切断されるであろうこと、および放出されたタグ部分が、タグ部分に相補的な配列を含む「モリゴ」テンプレートにアニーリングして、そこから伸長することができるであろうことを検証した。タグ付きプローブとモリゴのヌクレオチド配列を表1に示す。
モログラフィーによる核酸ハイブリダイゼーションおよび伸長の検出のための実現可能性研究を、全体が参照により本明細書に援用されるPawlak M.ら、Proteomics 2002;2(4):383-93に記載のZeptochipマイクロアレイチップ(スイス、ヴィッタースヴィルのZeptosens社製)で実施した。20mM Tris、5mM MgCl2、50mM KClからなるランニングDNAバッファー(pH8.0)を、15μL/分の一定流量でチップのフロースラーシステム内のフローチャンバーに適用した。最初に、焦点モログラフィーの正規化シグナルとしてストレプトアビジン(SAv)を注入し、520pg/mm2の表面質量密度変調を行った。親和性タグのないcDNAと固定化SAvとの間の陰性対照は、望ましくない相互作用が行われていないことを表すモログラムシグナル(図3(i)参照)の変化を生じなかった。次に、ビオチンタグ付き100bp HIV-LTRモリゴオリゴヌクレオチド(配列番号4)の固定化は、100nM SAvとビオチン化HIV-LTRモリゴ-100の1:1の比率でプレ複合体として実現した。このプレ複合体の形成は、図3(i)と図3(ii)左側との比較で示されるようにモログラムシグナルの増加をもたらした。その後、固定化されたHIV-LTRモリゴ-100と、モリゴ-100テンプレートのアニーリング部分に結合できる22bpプライマーであるAT-MOLO-3(配列番号3)(図3(iii))またはモリゴ-100テンプレートに完全に相補的な100bpの配列(図3(ii)左側)のいずれかとの間でハイブリダイゼーションを比較した。22bpプライマーと100bp相補配列とのハイブリダイゼーション間のモログラムシグナルの増加は、図4にグラフで表されている。このことから、モログラフィーは切断されたタグが伸長しているものと伸長していないものとを区別できることがわかる。
配列番号1:HIV-1 LTRタグ3プローブ配列
CACACATTGGCACCGCCGTCTTCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGAC
配列番号2:モリゴタグ3オリゴヌクレオチド配列
TTTTTTTTTTTTAGAGAAGACGGCGGTGCCAATGTGTG
配列番号3:AT-MOLO-3オリゴヌクレオチド配列
CACACATTGGCACCGCCGTCTT
配列番号4:HIV-LTR-モリゴ-100オリゴヌクレオチド配列
TTGCATGAGAATAGTAACGTATTGTGTAAAGCAGGATATAGAGTAATTGCCCAGTTGTTCCAAATCGATATTGCAGAGAAGACGGCGGTGCCAATGTGTG
Claims (10)
- 試料中の標的核酸の増幅および検出のための方法において、
(a)単一の反応器中で、前記標的核酸を含む前記試料を
(i)一対のオリゴヌクレオチドプライマーの各オリゴヌクレオチドプライマーが前記標的核酸の反対の鎖にハイブリダイズすることができ、そしてそれにより前記標的核酸のアンプリコンを生成することができる、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー
(ii)アニーリング部分とタグ部分とを含むオリゴヌクレオチド配列を含むタグ付きプローブであって、タグ部分が標的核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含み、アニーリング部分が標的核酸配列に少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドプライマーの前記対によって結合されている前記標的核酸の領域にハイブリダイズし、そしてここで前記タグ部分が前記アニーリング部分の5’末端又は3’末端に結合されているか、又は前記タグ部分がリンカーを介して前記アニーリング部分の5’末端と3’末端の間の任意の箇所に結合されている、前記タグ付きプローブ
と接触させる工程;
(b)各PCRサイクルの伸長工程中にポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によってタグ付きプローブのアニーリング部分からタグ部分の切断および分離が可能となるように、5`から3`ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いるPCRによって前記標的核酸を増幅する工程;
(c)タグ付きプローブから切断されたタグ部分を、アニーリング部分と伸長部分とを含むオリゴヌクレオチド配列であって、前記アニーリング部分がタグ付きプローブのタグ部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記伸長部分が標的核酸配列またはタグ付きプローブのタグ部分に非相補的な核酸配列を含む、前記オリゴヌクレオチド配列を含むモリゴテンプレートとハイブリダイズさせ、その結果、前記切断されたタグ部分が前記モリゴテンプレートのアニーリング部分にハイブリダイズして部分二本鎖分子を形成する工程であって、前記モリゴテンプレートの長さが、前記タグ付きプローブのタグ部分の長さよりも、少なくとも20ヌクレオチド分長く、前記モリゴテンプレートが固相チップに付着している、ハイブリダイズさせる工程;
(d)部分二本鎖分子を核酸ポリメラーゼと反応させて、切断されたタグ部分をモリゴテンプレートの伸長部分に伸長させる工程;
(e)工程(c)と工程(d)との間のモログラムシグナルの増加が標的核酸の存在の検出を表すモログラフィーによって、工程(d)での伸長を測定する工程
を含む方法であって、
(a)~(e)の全工程が標識がない状態で実施される、方法。 - モリゴテンプレートの長さが、少なくとも20ヌクレオチド分だけ、前記タグ付きプローブのタグ部分の長さよりも長い、請求項1に記載の方法。
- モリゴテンプレートの長さが、少なくとも30ヌクレオチド分だけ、前記タグ付きプローブのタグ部分の長さよりも長い、請求項1に記載の方法。
- モリゴテンプレートの長さが、少なくとも40ヌクレオチド分だけ、前記タグ付きプローブのタグ部分の長さよりも長い、請求項1に記載の方法。
- モリゴテンプレートの長さが、少なくとも50ヌクレオチド分だけ、タグ付きプローブの長さよりも長い、請求項1に記載の方法。
- タグ付きプローブが配列番号1を含み、モリゴテンプレートが請求番号4を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- アニーリング部分とタグ付きプローブのタグ部分が、非ヌクレオチドリンカーによって分離されている、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- リンカーが線状部分または環状部分である、請求項7に記載の方法。
- リンカーが、単一のユニットに由来するか、またはリン酸結合によって分離されている複数の同一のもしくは異なるユニットに由来する、請求項7または8のいずれか一項に記載の方法。
- 焦点モログラフィーを用いて伸長が検出される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
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