KR102016747B1 - 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 타겟 핵산 서열의 검출 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다. 상이한 검출 온도 및 기준값을 이용하는 본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지만을 사용하여 종래의 실시간 방식으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다.
타겟 핵산 서열의 검출을 위해, 실시간 검출 방법이 실시간 방식으로 타겟 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출하는데 널리 사용된다. 실시간 검출 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 표지된 프로브 또는 프라이머를 사용한다. 표지된 프로브와 타겟 핵산 서열 간의 혼성화를 사용하는 예시적인 방법은 헤어핀 구조를 갖는 이중-표지된 프로브를 사용하는 분자 비콘(Molecular beacon) 방법(Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), 하이비콘(HyBeacon) 방법(French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 공여체 및 수용체로 각각 표지된 2개의 프로브를 사용하는 혼성화 프로브 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일-표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 럭스(Lux) 방법(미국 특허 제7,537,886호)를 포함한다. 이중-표지된 프로브 및 DNA 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성에 의한 상기 프로브의 절단을 사용한 TaqMan 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)가 또한 본 기술분야에서 널리 이용되고 있다.
표지된 프라이머를 사용하는 예시된 방법은 선라이즈(Sunrise) 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), 스콜피온(Scorpion) 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145호) 및 TSG 프라이머 방법(WO 제2011/078441호)을 포함한다.
대안적인 접근법으로서, 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체를 사용하는 실시간 검출 방법이 제안되었다: 인베이더(Invader) 분석(미국 특허 제5,691,142호, 미국 특허 제6,358,691호 및 미국 특허 제6,194,149호), PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 제2012/096523호), PCE-SH(PTO Cleavage 및 Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 제2013/115442호), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(제PCT/KR2013/012312호).
상기 기술된 종래의 실시간 검출 기술은 타겟 증폭과 관련되거나 무관한 시그널 증폭 과정에서 하나의 선택된 검출 온도에서 형광 표지로부터 발생된 시그널을 검출한다. 종래의 실시간 검출 기술에 따라 단일 반응 튜브에서 단일 유형의 표지를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 경우, 타겟 핵산 서열에 대해 발생된 시그널들은 서로 구별되지 않는다. 따라서, 종래의 실시간 검출 기술은 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 일반적으로 상이한 유형의 표지를 이용한다. Tm 차이를 사용하는 멜팅 분석은 단일 유형의 표지를 사용하는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 그러나, 멜팅 분석은 실시간 기술보다 실시 시간이 더 길며 타겟 핵산 서열이 증가할수록 상이한 Tm 값을 갖는 프로브의 설계가 더 어려워진다는 심각한 단점이 있다.
따라서, 멜팅 분석에 의존하지 않고 하나의 반응 용기 및 단일 유형의 검출기에서 단일 유형의 표지를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 신규 방법 또는 접근법이 개발되는 경우, 매우 향상된 편의성, 비용-효과 및 효율로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 또한, 상기 신규의 방법을 다른 검출 방법(예컨대, 멜팅 분석)과 조합하면 매우 향상된 효율로 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있을 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허 및 특허 문헌의 개시내용은 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준을 보다 명확하게 설명하기 위하여 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
표지된 프라이머를 사용하는 예시된 방법은 선라이즈(Sunrise) 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), 스콜피온(Scorpion) 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145호) 및 TSG 프라이머 방법(WO 제2011/078441호)을 포함한다.
대안적인 접근법으로서, 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체를 사용하는 실시간 검출 방법이 제안되었다: 인베이더(Invader) 분석(미국 특허 제5,691,142호, 미국 특허 제6,358,691호 및 미국 특허 제6,194,149호), PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 제2012/096523호), PCE-SH(PTO Cleavage 및 Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 제2013/115442호), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(제PCT/KR2013/012312호).
상기 기술된 종래의 실시간 검출 기술은 타겟 증폭과 관련되거나 무관한 시그널 증폭 과정에서 하나의 선택된 검출 온도에서 형광 표지로부터 발생된 시그널을 검출한다. 종래의 실시간 검출 기술에 따라 단일 반응 튜브에서 단일 유형의 표지를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 경우, 타겟 핵산 서열에 대해 발생된 시그널들은 서로 구별되지 않는다. 따라서, 종래의 실시간 검출 기술은 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 일반적으로 상이한 유형의 표지를 이용한다. Tm 차이를 사용하는 멜팅 분석은 단일 유형의 표지를 사용하는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 그러나, 멜팅 분석은 실시간 기술보다 실시 시간이 더 길며 타겟 핵산 서열이 증가할수록 상이한 Tm 값을 갖는 프로브의 설계가 더 어려워진다는 심각한 단점이 있다.
따라서, 멜팅 분석에 의존하지 않고 하나의 반응 용기 및 단일 유형의 검출기에서 단일 유형의 표지를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 신규 방법 또는 접근법이 개발되는 경우, 매우 향상된 편의성, 비용-효과 및 효율로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 또한, 상기 신규의 방법을 다른 검출 방법(예컨대, 멜팅 분석)과 조합하면 매우 향상된 효율로 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있을 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 이러한 특허 및 특허 문헌의 개시내용은 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준을 보다 명확하게 설명하기 위하여 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
본 발명자들은 타겟 핵산 서열, 특히 복수의 타겟 핵산 서열을 보다 정확하고 간편한 방식으로 정성적 또는 정량적으로 검출하는 신규 방법을 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 조절된 검출 온도에서 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수득한 다음, 검출 결과를 기준값을 사용하여 적합하게 해석함으로써, 매우 향상된 편의성, 비용 효과 및 효율성으로 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지 및 단일 유형의 검출기를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
본 발명의 가장 큰 특징은 하나의 시그널 반응 용기에서 단일 유형의 표지 및 단일 유형의 검출기를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 것이다. 상이한 검출 온도 및 기준값을 이용하는 본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지를 이용하는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 또한, 본 발명은 각각의 타겟 핵산 서열이 상이한 검출 온도 모두에서 시그널을 발생시키는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 본 발명의 구성요소들은 본 발명의 특징에 맞추어 선택되고, 타겟 핵산 서열을 검출하는 놀라운 프로세스가 된다.
종래의 실시간 PCR 방법은 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 2가지 유형의 형광 표지 또는 멜팅 분석이 필요하다.
본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 형광 표지를 사용하여 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 실시간 PCR 프로토콜을 가능하게 한다.
본 발명은 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나에 대해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널들 사이의 차이를 반영하는 기준값이 다른 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다는 흥미로운 발견을 이용한다. 본 발명에서 사용되는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널-발생 수단으로부터 시그널을 발생시키고 검출함으로써 실험적으로 수득되는 일정한 값이다. 기준값은 타겟 핵산 서열을 검출하는데 직접 사용될 수 있다. 선택적으로, 기준값은 타겟 핵산 서열의 존재 및 부재를 입증하기 위해 시그널을 처리하는 식에 다양하게 적용될 수 있다.
특히, 본 발명은 복수의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 시그널-발생 수단이 상이한 검출 온도 모두에서 시그널을 발생시키는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
본 발명은 하기와 같이 다양한 양태로 구현될 수 있다:
(a) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 검출; 및
(b) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형 분석.
I. 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명의 일 양태에서, 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법이 제공된다:
(a) (i) 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및/또는 (ii) 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공되는 시그널의 변화의 관계를 나타내는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값을 제공하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 상기 제2 기준값과 상이하며;
(b) 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 샘플을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 상기 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며;
(c) 상기 기준값 중 적어도 하나 및 상기 단계 (b)에서 검출된 시그널에 의해 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계.
증폭 곡선을 사용하는 종래의 실시간 PCR 방법에 따르면, 구별되지 않는 동일한 시그널을 제공하는 시그널-발생 수단을 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 구별하여 검출할 수 없다는 것이 당업계의 일반적인 상식이다.
본 발명은 본 기술분야의 일반적인 상식과 관련된 한계를 극복하고, 매우 개선된 방식으로 타겟 핵산 서열을 검출하는 예기치 않은 결과를 가져온다.
본 발명은 다음과 같이 상세히 설명될 것이다:
단계 (a): 기준값 제공
제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값을 제공한다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 단일 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 미리 결정된 2개의 검출 온도에서 하나의 반응 용기에서 검출되는 경우, 특정 관계(패턴 또는 규칙)로 시그널 변화가 있음을 확인하였다. 예를 들어, 타겟 핵산 서열에 대하여 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 시그널 변화는 특정 관계(패턴 또는 규칙)를 나타낸다. 예를 들어, 상기 시그널의 강도는 서로 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있거나, 또는 상기 시그널의 강도는 2개의 검출 온도에서 특정 범위에서 서로 상이할 수 있다.
본 발명의 특징은 상기 결과를 기준값을 얻고 타겟 핵산 서열을 검출하는데 적용하는 것이다. 하나의 반응 용기에서 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 검출 온도만을 달리하여(예컨대, 타겟 함량의 변화가 없이, 또는 버퍼 조건의 변화 없이) 검출되기 때문에, 2개의 검출 온도 간의 시그널 변화에는 특정 관계(패턴 또는 규칙)가 있다. 시그널 변화에서의 특정 관계(패턴 또는 규칙)에 기초하여, 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 분석하는데 사용될 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 2개의 검출 온도 사이에서의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 변화에 특정 관계(패턴 또는 규칙)를 허용하는 조건에서 실시된다.
타겟 핵산 서열의 "기준값(reference value, RV)"은 2개의 검출 온도에서 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 시그널-발생 수단에 의해 제공된 시그널 변화의 관계를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 각 기준값은 타겟 핵산 서열에 상응하는 표준 물질 및 시그널-발생 수단을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출한 다음, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 얻음으로써 수득된다.
일 구현예에 따르면, (i) 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값은 (i-1) 제1 타겟 핵산 서열을 제1 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 제1 시그널-발생 수단과 인큐베이션하고, (i-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널을 검출하고, (i-3) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널들 간의 차이를 얻음으로써 수득되고, (ii) 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열을 제2 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 제2 시그널-발생 수단과 인큐베이션하고, (ii-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출하고, (ii-3) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널들 간의 차이를 얻음으로써 수득되며; 상기 제1 기준값은 제2 기준값과 상이하다.
각 기준값은 다양한 방식에 따라 제공될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 각 기준값은 본 발명의 방법을 실시하는 자의 실험에 의해 제공된다.
선택적으로, 각 기준값은 본 발명의 키트, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체, 장치 또는 컴퓨터 프로그램의 제작사에 의해 제공된다. 상기 키트, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체 제품, 장치 또는 컴퓨터 프로그램에 포장된 설명서에 관심 있는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값이 포함될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 수득된다.
이러한 수학적 처리는 시그널의 함수이다. 기준값을 수득하기 위해 사용되는 함수는, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널-발생 수단에 의해 제공되는 시그널 변화의 관계를 제공하는 한, 임의의 함수를 포함한다. 예를 들어, 함수는 시그널의 덧셈, 곱셈, 뺄셈 및 나눗셈과 같은 수학적 처리로서 제시될 수 있다.
상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공되는 시그널의 특징이 그 자체로 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 관계를 수득하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널은 상기 시그널의 특징을 수학적으로 처리함으로써 변형될 수 있고 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 관계를 수득하는데 사용될 수 있다.
선택적으로, 초기에 수득된 기준값은 변형될 수 있고 기준값으로 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값과 관련하여 용어 "시그널"은 검출 온도에서 수득된 시그널 자체뿐만 아니라 시그널을 수학적으로 처리함으로써 제공된 변형된 시그널을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 기준값은 다양한 방식으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 기준값은 예측된 값으로 제공될 수 있다. 타겟 서열, 시그널-발생 수단 및 검출 온도를 고려하여, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 관계를 나타내는 기준값이 예측될 수 있다.
기준값의 수득 시 용어 "제1 검출 온도 및 제2 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이"는 제1 검출 온도 및 제2 검출 온도에서의 시그널 변화의 관계의 일 구현예이다.
일 구현예에 따르면, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 수득되는 차이를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 수학적 처리가 수행되는 경우, 시그널의 특징은 수학적 처리가 쉬워야 한다. 특정 구현예에서, 수학적 처리는 시그널을 사용한 계산(예컨대, 덧셈, 곱셈, 뺄셈 및 나눗셈) 또는 시그널로부터 유래된 다른 값을 수득하는 것을 포함한다.
상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이는 다양한 양태로 표현될 수 있다. 예를 들어, 상기 차이는 수치, 시그널의 존재/부재 또는 시그널 특징을 갖는 플롯으로서 표현될 수 있다.
차이를 수득하기 위한 시그널의 수학적 처리는 다양한 계산 방법 및 이들의 변형에 의해 수행될 수 있다.
특히, 차이를 수득하기 위한 시그널의 수학적 처리는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수행될 수 있다.
예를 들어, 제2 검출 온도에서 검출된 시그널의 엔드-포인트(end-point) 강도 대 제1 검출 온도에서 검출된 시그널의 엔드-포인트 강도의 비율이 기준값으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널 간의 차이를 수득하기 위한 시그널의 수학적 처리는 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율의 계산이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널 간의 차이를 수득하기 위한 시그널의 수학적 처리는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율의 계산이다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 뺄셈을 계산함으로써 수득될 수 있다.
차이를 수득하기 위한 수학적 처리는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 수학적 처리는 기계를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 시그널은 검출기 또는 실시간 PCR 장치 내의 프로세서에 의해 수학적으로 처리될 수 있다. 선택적으로, 시그널은 특히 미리 결정된 알고리즘에 따라 수작업으로 수학적으로 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값은 제2 기준값과 상이하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값이 제2 기준값과 상이하도록 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단이 설계된다.
RV 값이 서로 상이한 경우, 차이 정도를 기술하는 정량적 표현은 RV 값을 계산하는 접근법에 따라 달라질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값을 수득하기 위한 시그널은 공통의 계산 방법에 의해 처리되어 비교를 위한 기준값을 제공할 수 있으며, 이후 상기 비교를 위한 기준값을 사용하여 2개의 기준값 간의 차이 정도를 수득할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 공통 계산 방법은 2개의 시그널의 나눗셈이다.
예를 들어, 본 방법의 방법에 따라 시그널을 분석하는데 사용되는 기준값을 수득하기 위해 2개의 시그널이 뺄셈에 의해 처리되는 경우, 상기 2개의 시그널은 비교를 위한 기준값을 수득하기 위해 나눗셈에 의해 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값은 제2 기준값보다 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.7배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배 또는 10배 더 크다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 제2 기준값은 제1 기준값보다 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.7배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배 또는 10배 더 크다.
일 구현예에 따르면, 제1 기준값이 제2 기준값과 상이한지 여부를 결정하기 위해 비교하는 경우, 상기 기준값은 시그널의 나눗셈에 의해 계산된다. 일 구현예에 따르면, 제1 기준값이 제2 기준값과 상이한지 여부를 결정하기 위해 기준값을 계산하는 방법은 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 기준값을 계산하는 방법과 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값을 위한 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 시그널-발생 수단과 동일할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값을 수득하기 위한 인큐베이션 조건은 샘플의 분석을 위한 인큐베이션 조건과 동일하다.
타겟 핵산 서열에 대하여, 기준값은 성분(예컨대 타겟 핵산 서열, 시그널-발생 수단, 효소, 또는 dNTP)의 양, 버퍼 pH 또는 반응 시간을 포함하는 다양한 반응 조건에서 수득될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 반응 완료 시에 포화 시그널을 제공하기에 충분한 반응 조건 하에서 수득될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값 계산시 수득된 시그널 간의 차이는 특정 범위를 갖고, 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값으로 선택될 수 있거나 또는 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값을 참조하여 선택될 수 있다. 특히, 기준값은 다양한 조건에서 수득된 기준값의 표준 편차, 허용 오차 범위, 특이도 또는 민감도를 고려하여 변형될 수 있다.
본 발명은 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 제공하기 위하여 시그널-발생 수단을 이용한다. 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출된다.
본원에 사용된 용어 "시그널-발생 수단"은 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 발생에 사용되는 임의의 물질을 의미하며, 이는 예를 들어 올리고뉴클레오타이드, 표지 및 효소를 포함한다. 선택적으로, 본원에 사용된 용어 "시그널-발생 수단"은 시그널 발생을 위한 물질을 사용하는 임의의 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인큐베이션은 시그널-발생 수단에 의한 시그널이 발생할 수 있는 조건 하에 실시된다. 이러한 조건은 온도, 염 농도 및 용액의 pH를 포함한다.
시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 예는 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 프로브 및 프라이머)를 포함하며; 타겟 핵산 서열에 혼성화된 프로브 또는 프라이머가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 단편에 특이적으로 혼성화되는 캡처 올리고뉴클레오타이드를 포함하고; 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 단편이 연장되어 연장 가닥을 형성하는 경우, 시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하며; 시그널-발생 수단으로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고; 및 시그널-발생 수단으로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 이의 조합을 포함한다.
시그널 발생 원리는 동일하더라도, 사용된 상이한 서열의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 시그널 발생 수단은 서로 상이한 것으로 간주될 수 있다.
표지는 올리고뉴클레오타이드에 연결되거나, 자유로운 형태일 수 있다. 표지는 연장 반응 동안 연장 산물에 삽입될 수 있다.
시그널 발생에서 올리고뉴클레오타이드의 절단이 사용되는 경우, 효소의 예는 5'-뉴클레아제 및 3'-뉴클레아제, 특히 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 3'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제를 포함한다.
본 발명에서, 시그널은 상기 기재된 다양한 물질을 사용하여 다양한 방식으로 발생될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 중 적어도 하나는 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 이합체는 이중 가닥의 타겟 핵산 서열을 포함한다.
시그널-발생 수단과 관련하여, 본원에 사용된 용어 "이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시킨다"는 것은 검출되는 시그널이 2개의 핵산 분자의 결합 또는 해리에 의존적으로 제공되는 것을 의미한다. 상기 표현은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체(예컨대, 표지를 갖는 검출 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열)에 의해 시그널이 제공되는 것을 포함한다. 또한, 상기 표현은 이합체(예컨대, 표지를 갖는 검출 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열)의 혼성화의 억제에 의해 시그널이 제공되는 것을 포함하며, 상기 억제는 다른 이합체의 형성에 의해 일어난다.
특히, 시그널은 타겟 핵산 서열 및 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의해 발생된다.
본원에 사용된 용어 "검출 올리고뉴클레오타이드"는 검출되는 시그널의 발생에 관여하는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 실제 시그널 발생에 관여하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 다른 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 타겟 핵산 서열, 또는 검출 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드)와 검출 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 또는 비-혼성화가 시그널 발생을 결정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지를 포함한다.
타겟 핵산 서열 및 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의한 시그널은 스콜피온 방법(Whitcombe et al, Nature Biotechnology 17:804-807 (1999)), 선라이즈(또는 Amplifluor) 방법(Nazarenko et al, Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521 (1997), 및 미국 특허 제6,117,635호), 럭스 방법(미국 특허 제7,537,886호), 플렉서(Plexor) 방법(Sherrill C B, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-45569 (2004)), 분자 비콘 방법(Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), 하이비콘(HyBeacon) 방법(French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 인접한 혼성화 프로브 방법(Bernard, P.S. et al., Anal. Biochem., 273:221(1999)) 및 LNA 방법(미국 특허 제6,977,295)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
특히, 시그널은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 발생된다.
본원에 사용된 용어 "매개 올리고뉴클레오타이드"는 타겟 핵산 서열을 포함하지 않는 이합체의 생산을 매개하는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단 자체는 시그널을 발생시키지 않으며, 매개 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 및 절단 후에 상기 절단에 의해 형성된 단편이 시그널 발생을 위한 연속적인 반응에 관여한다.
일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 또는 절단 자체는 시그널을 발생시키지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 절단되어 단편을 방출함으로써 이합체의 생산을 매개하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특히, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 상기 단편의 연장에 의해 이합체의 생산을 매개한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드는 (i) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단은 단편을 방출하며, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되고 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 연장된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드는 절단되어 단편을 방출하고, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되며, 상기 단편은 연장되어 연장 가닥을 형성하고, 이는 상기 연장 가닥 및 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 연장 이합체의 형성을 야기하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 연장 가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 상기 제3 올리고뉴클레오타이드 및 연장 가닥의 혼성화는 다른 유형의 이합체를 형성하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 캡처 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 제3 올리고뉴클레오타이드 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성은 상기 연장 가닥 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의해 억제되어, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단편, 연장 가닥, 캡처 올리고뉴클레오타이드, 제3 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합이 검출 올리고뉴클레오타이드로서 작용할 수 있다.
매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 2012/096523), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442) 및 PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(PCT/KR2013/012312)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
상기 문헌에 개시된 용어와 관련하여, 올리고뉴클레오타이드의 상응하는 예는 하기와 같다: 매개 올리고뉴클레오타이드는 PTO(프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드)에 상응하고, 캡처 올리고뉴클레오타이드는 CTO(캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드)에 상응하며 제3 올리고뉴클레오타이드는 SO(시그널링 올리고뉴클레오타이드) 또는 HO(혼성화 올리고뉴클레오타이드)에 상응한다. SO, HO, CTO, 연장 가닥 또는 이들의 조합은 검출 올리고뉴클레오타이드로서 역할을 할 수 있다.
매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 다른 이합체의 형성이 억제됨으로써 제공된 시그널(예컨대 PCE-NH)을 포함한다.
예를 들어, 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널이 PTOCE 방법에 의해 발생되는 경우, 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO(프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드), CTO(캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드), 적합한 표지 및 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 포함한다. PTO는 (i) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다. CTO는 3'에서 5' 방향으로 (i) PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
PTOCE 방법에 의한 시그널 발생의 특정한 예는 하기의 단계를 포함한다:
(a) 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장 가닥은 상기 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도하며, 상기 절단은 상기 PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 단편과 CTO를 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편은 연장되어 연장 이합체가 형성되며; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (iii) 상기 단편의 서열 및/또는 길이 및 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 Tm 값을 갖고; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 적어도 하나의 표지, (ii) 연장 반응 동안 연장 이합체 내로 삽입된 표지, (iii) 연장 반응 동안 연장 이합체 내로 삽입된 표지 및 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지에 의해 타겟 시그널을 제공하며; 및 (e) 상기 연장 이합체가 그의 이중 가닥 형태를 유지하는 미리 결정된 온도에서 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장 이합체를 검출하는 단계로서, 상기 연장 이합체의 존재는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다. 이러한 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가로 포함한다.
문구 "반복 사이클 사이에 변성"에서, 용어 "변성"은 이중 가닥 핵산 분자를 단일 가닥 핵산 분자로 분리하는 것을 의미한다.
PTOCE 방법의 단계 (a)에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드 대신에 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가로 포함한다.
PTOCE 방법은 CTO에 혼성화된 PTO 단편이 연장되어 연장 가닥을 형성한 후, 상기 연장이 검출되는 과정으로서 분류될 수 있다. PTOCE 방법은 연장 가닥 및 CTO 사이의 이합체를 사용하여 연장 가닥의 형성을 검출하는 것을 특징으로 한다.
연장 가닥의 형성을 검출하는 다른 접근법이 있다. 예를 들어, 연장 가닥의 형성은 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 검출될 수 있다(예컨대, PCE-SH 방법). 이 방법에서, 시그널은 (i) 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지, (ii) 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 PTO 단편에 연결된 표지, (iii) 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 연장 반응 동안 연장 가닥에 삽입된 표지, 또는 (iv) 연장가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 인터컬레이팅 염료로부터 제공될 수 있다. 선택적으로, 시그널은 (i) 연장 가닥에 연결된 표지 또는 (ii) 인터컬레이팅 염료로부터 제공될 수 있다.
선택적으로, 연장 가닥의 형성의 검출은 CTO 및 상기 CTO에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 억제를 검출하는 다른 방법(예컨대 PCE-NH 방법)에 의해 실시된다. 이러한 억제는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 것으로 여겨진다. 시그널은 (i) CTO에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지, (ii) CTO에 연결된 표지, (iii) CTO에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지로부터 제공될 수 있다.
일 구현예에 따르면, CTO에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드는 PTO 단편과 겹치는 서열을 갖는다
일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 연장 가닥에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(예컨대, PCE-SH 방법) 및 CTO에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(예컨대 PCE-NH 방법)를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 반응 동안 생성된 연장 가닥 또는 CTO를 포함한다.
PTOCE-기반 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 연장 가닥의 형성을 수반한다. 용어 "PTOCE-기반 방법"은 PTO의 절단 및 연장을 통한 연장 가닥의 형성을 포함하는, 시그널을 제공하는 다양한 방법을 포괄하기 위해 본원에서 사용된다.
PTOCE-기반 방법에 의한 시그널 발생의 예는 하기의 단계를 포함한다: (a) 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장 가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도하며, 상기 절단은 PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 단편을 CTO와 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; (d) 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편은 연장되어 연장 가닥을 형성하고; 및 (e) 연장 가닥의 존재에 의존적으로 발생되는 시그널을 검출하여 상기 연장 가닥의 형성을 검출하는 단계. 단계 (a)에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드 대신에 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 이합체의 형성에 의해 발생된 시그널은 이합체의 혼성화(예컨대, 이합체 자체의 혼성화 또는 제3 올리고뉴클레오타이드의 혼성화)에 의해 유도된 시그널 또는 이합체의 형성으로 인한 제3 올리고뉴클레오타이드의 혼성화의 억제에 의해 유도된 시그널을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 각 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 중 적어도 하나의 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 모두는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
특히, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화 이후 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다.
검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화 이후 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널은 TaqMan 프로브 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
시그널이 TaqMan 프로브 방법에 의해 발생되는 경우, 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트, 적합한 표지(예컨대, 상호작용적 이중 표지)를 갖는 TaqMan 프로브 및 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합 효소를 포함한다. 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TaqMan 프로브는 타겟 증폭 동안 절단되어 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다.
TaqMan 프로브 방법에 의해 시그널을 발생시키는 특정한 예는, (a) 프라이머 세트 및 적합한 표지(예컨대, 상호작용적 이중 표지)를 갖는 TaqMan 프로브를 타겟 핵산 서열과 혼성화시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물 및 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소를 사용하여 타겟 핵산 서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 TaqMan 프로브는 절단되어 표지를 방출하고; 및 (c) 상기 방출된 표지로부터 시그널 발생을 검출하는 단계를 포함한다.
특히, 시그널은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 단편은 검출 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되고, 상기 단편은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 단편은 연장되어 캡처 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 검출 올리고뉴클레오타이드를 절단한다.
매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식의 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널은 인베이더 분석(미국 특허 제5,691,142호), PCEC(PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage) 방법(WO 제2012/134195호) 및 미국 특허 제7,309,573호에 기재된 방법을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다. 특히, 미국 특허 제7,309,573호에 기재된 방법은 절단에 의한 시그널 발생을 사용하는 PTOCE-기반 방법 중 하나로 여겨질 수 있고, 상기 방법에서, 연장 가닥의 형성에 의해 CTO에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드의 절단을 검출함으로써 상기 연장 가닥의 형성이 검출될 수 있다. 인베이더 분석은 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 단편을 형성하고, 단편의 연장 없이 연속적인 절단 반응을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 발생되는 경우, 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단은 시그널 변화를 유도하거나 검출될 표지된 단편을 방출시킨다.
시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해서뿐만 아니라 이합체의 형성에 의해 시그널을 발생시키는 경우, 상기 시그널-발생 수단은, 절단에 의해 시그널을 발생시키는데 사용되는 한, 절단에 의해 시그널을 제공하는 시그널 발생 수단으로서 간주될 수 있다.
검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단 시에 시그널을 발생시키지만, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출되는 시그널은 서로 상이하다. 상기 검출된 시그널의 차이(예컨대 시그널 강도의 차이)는 검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화 및/또는 표지(예컨대 염료)의 시그널 발생에 대한 온도 영향에 의한 시그널 때문일 수 있다. 이러한 차이는 TaqMan 프로브 방법을 사용한 실시예에서 다뤄진다.
흥미롭게도, 본 발명은 상이한 검출 온도 및 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 사용하여(예컨대 TaqMan 프로브 방법) 2개의 타겟 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단, 및 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단의 조합이다.
일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드가 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 이는 다양한 방식으로 표지를 가질 수 있다. 예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오타이드 중 하나의 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 표지를 가질 수 있거나, 복수의 올리고뉴클레오타이드 모두가 적어도 하나의 표지를 가질 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오타이드의 하나의 부위가 적어도 하나의 표지를 가지고 다른 부위는 표지를 갖지 않을 수 있다.
2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다. 용어 "단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는 시그널"은 이들의 동일하거나 실질적으로 동일한 시그널 특성(예컨대, 광학적 특성, 방출 파장 및 전기적 시그널)으로 인해 시그널이 단일 유형의 검출기에 의해 서로 구별되지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 2개의 타겟 핵산 서열에 대해 동일한 표지(예컨대, FAM)가 사용되고 FAM으로부터의 방출 파장을 검출하기 위해 단일 유형의 검출기가 사용되는 경우, 시그널은 구별되게 검출되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "단일 유형의 시그널"은 동일하거나 실질적으로 동일한 시그널 특성(예컨대, 광학적 특성, 방출 파장 및 전기적 시그널)을 제공하는 시그널들을 의미한다. 예를 들어, FAM 및 CAL Fluor 610은 상이한 유형의 시그널을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "단일 유형의 검출기"는 단일 유형의 시그널을 위한 검출 수단을 의미한다. 몇 개의 상이한 유형의 시그널을 위한 몇 개의 채널(예컨대, 광다이오드)을 포함하는 검출기에서, 각 채널(예컨대, 광다이오드)이 "단일 유형의 검출기"에 해당한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명에서 유용한 표지는 본 기술분야에서 알려진 다양한 표지를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 표지는 단일 표지, 상호작용 이중 표지, 인터컬레이팅 염료 및 삽입(incorporating) 표지를 포함한다.
단일 표지는, 예를 들어, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학 표지 및 금속 표지를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 단일 표지는 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 시그널(예컨대, 상이한 시그널 강도)을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 단일 표지는 형광 표지이다. 본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 바람직한 유형 및 결합 사이트는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 이의 교시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다. 예를 들어, 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 단일 표지는 다양한 방법에 의해 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 표지는 탄소 원자를 함유하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 프로브에 연결된다.
대타겟인 상호작용적 표지 시스템으로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이며, 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성, 예컨대 생물발광성, 화학발광성, 전기화학발광성이며, 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템은 "접촉-매개 퀀칭(on contact-mediated quenching)"에 기반한 이중 표지를 포함한다(Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 및 Johansson et al., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 상호작용적 표지 시스템은 적어도 2개의 분자(예컨대 염료) 간의 상호작용에 의해 시그널 변화를 유도하는 임의의 표지 시스템을 포함한다.
본 발명에 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 본 기술분야에 알려진 임의의 분자를 포함할 수 있다. 이들의 예는 하기와 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1(509), YOYO™-1(509), Calcein(517), FITC(518), FluorX™(519), Alexa™(520), Rhodamine 110(520), Oregon Green™ 500(522), Oregon Green™ 488(524), RiboGreen™(525), Rhodamine Green™(527), Rhodamine 123(529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™(533), TO-PRO™-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3™(570), Alexa™ 546(570), TRITC(572), Magnesium O범위™(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium O범위™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B(580), TAMRA(582), Rhodamine Red™(590), Cy3.5™(596), ROX(608), Calcium Crimson™(615), Alexa™ 594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PRO™-3(631), YOYO™-3(631), R-phycocyanin(642), C-Phycocyanin(648), TO-PRO™-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), Biosearch Blue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL Fluor Red 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 괄호 안의 숫자는 나노미터 단위의 최대 방출 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 형광 분자 및 적합한 리포터-퀀처 쌍은 하기와 같이 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996) 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
광범위한 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 퀀처 분자(예컨대 블랙 퀀처 또는 다크 퀀처)가 본 발명에서 사용될 수 있음에 유의한다.
리포터 및 퀀처 분자를 포함하는 시그널링 시스템에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 다른 파트너(수용체)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료가 리포터로서 사용되고 로다민 염료가 퀀처로서 사용된다.
상호작용적 이중 표지는 이합체 중 하나의 가닥에 연결될 수 있다. 상호작용적 이중 표지를 함유하는 가닥이 단일 가닥 상태를 유지하는 경우, 상기 가닥은 헤어핀 또는 랜덤 코일 구조를 형성하여 상호작용적 이중 표지 간의 퀀칭을 유도한다. 상기 가닥이 이합체를 형성하는 경우, 퀀칭은 줄어든다. 선택적으로, 상호작용적 이중 표지가 가닥 상에 근접하여 위치한 뉴클레오타이드에 연결되는 경우, 상호작용적 이중 표지 사이에 퀀칭이 일어난다. 상기 가닥이 이합체를 형성한 다음 절단되는 경우, 퀀칭은 줄어들게 된다.
상호작용적 이중 표지 각각은 이합체의 2개의 가닥 각각에 연결될 수 있다. 이합체의 형성은 퀀칭을 유도하고 이합체의 변성은 언퀀칭을 유도한다. 선택적으로, 2개의 가닥 중 하나가 절단되는 경우, 언퀀칭이 유도될 수 있다.
본 발명에서 유용한 예시된 인터컬레이팅 염료는 SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TO-PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 싸이아졸 오렌지를 포함한다. 인터컬레이팅 염료는 이중 가닥 핵산 분자에 특이적으로 삽입되어 시그널을 발생시킨다.
삽입 표지가 프라이머 연장 동안 표지를 삽입하여 시그널을 발생시키는 과정에 사용될 수 있다(예컨대, Plexor 방법, Sherrill C B, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-45569(2004)). 또한, 삽입 표지는 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널 발생에서 사용될 수 있다.
삽입 표지는 일반적으로 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 또한, 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비-자연 염기"는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연 염기의 유도체를 의미하며, 이들은 수소-결합 염기쌍을 형성할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비-자연 염기"는, 예를 들어, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호, 및 제6,037,120호에 기재된 바와 같이, 모 화합물로서 자연 염기로부터 상이한 염기쌍 형성 패턴을 갖는 염기를 포함한다. 비-자연 염기 간의 염기쌍 형성은 자연 염기와 같이 2개 또는 3개의 수소 결합을 포함한다. 또한, 비-자연 염기 간의 염기쌍 형성은 특정한 방식으로 형성된다. 비-자연 염기의 특정한 예는 염기쌍 조합에서 하기의 염기를 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J, 및 M/N(미국 특허 제7,422,850호 참고).
PTOCE 방법에 의해 시그널이 발생되는 경우, 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가질 수 있고, CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 검출 또는 정량을 위한 관심 있는 핵산 서열을 지칭한다. 타겟 핵산 서열은 단일 가닥뿐만 아니라 이중 가닥의 서열을 포함한다. 타겟 핵산 서열은 핵산 샘플 내에 초기에 존재하는 서열뿐만 아니라 반응에서 새롭게 생성된 서열을 포함한다.
타겟 핵산 서열은 임의의 DNA(gDNA 및 cDNA), RNA 분자, 이들의 혼성체(키메라 핵산)를 포함할 수 있다. 상기 서열은 이중 가닥 또는 단일-가닥 형태일 수 있다. 출발 물질로서 핵산이 이중 가닥인 경우, 상기 2개의 가닥을 단일 가닥 또는 부분적으로 단일 가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥을 분리하는 공지된 방법은, 가열, 알칼리, 포름아마이드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예컨대, 헬리카제 작용), 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80℃ 내지 105℃ 범위의 온도에서 가열함으로써 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)]에 의해 제공된다.
mRNA를 출발 물질로서 이용하는 경우, 어닐링 단계를 실시하기 전에 역전사 단계가 필요하며, 이의 상세한 내용은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988))]에서 확인된다. 역전사를 위해, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머, 랜덤 프라이머 또는 타겟-특이적 프라이머가 사용될 수 있다.
타겟 핵산 서열은 임의의 자연 원핵세포 핵산, 진핵세포 핵산(예를 들어, 원생동물 및 기생충, 진균류, 효모, 고등 식물, 하등 및 포유동물 및 인간을 포함하는 고등 동물), 바이러스(예를 들어, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오 바이러스 등) 핵산, 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 재조합으로 생산된 또는 생산될 수 있거나, 또는 화학적으로 합성된 또는 합성될 수 있는 임의의 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 핵산 분자는 자연에서 발견되거나 발견되지 않을 수 있다. 타겟 핵산 서열은 공지되거나 공지되지 않은 서열을 포함할 수 있다.
단계 (b): 샘플과 시그널-발생 수단의 인큐베이션 및 시그널 검출
분석할 샘플을 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 상기 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 검출한다.
일 구현예에 따르면, 상응하는 타겟 핵산 서열이 존재하는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도 모두에서 시그널을 발생시키도록 각각의 상응하는 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 각각의 시그널-발생 수단이 설계된다.
상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키며, 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널들은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 샘플의 분석을 위한 인큐베이션 조건은 제1 기준값 및 제2 기준값을 수득하기 위한 인큐베이션 조건과 동일하다.
시그널은 시그널 검출로부터의 다양한 시그널 특징, 예컨대, 시그널 강도 [예컨대, RFU(상대적 형광 단위) 값, 또는 증폭을 실시하는 경우, 특정 사이클, 선택된 사이클 또는 엔드-포인트에서의 RFU 값], 시그널 변화 모양(또는 패턴) 또는 Ct 값, 또는 상기 특징을 수학적으로 처리함으로써 수득된 값을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 기준값 또는 샘플 분석과 관련된 용어 "시그널"은 검출 온도에서 수득된 시그널 자체뿐만 아니라 상기 시그널들을 수학적으로 처리함으로써 제공된 변형된 시그널을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 실시간 PCR에 의해 증폭 곡선이 수득되는 경우, 증폭 곡선으로부터의 다양한 시그널값(또는 특징)이 타겟 존재의 결정을 위해 선택되고 사용될 수 있다(강도, Ct 값 또는 증폭 곡선 데이터).
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 존재에 사용되는 시그널은 유의한 시그널이다. 즉, 상기 시그널은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 발생되는 시그널이다. 일 구현예에 따르면, 검출된 시그널의 유의성은 역치값을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 역치값은 검출기의 백그라운드 시그널, 민감도 또는 사용된 표지를 고려하여 음성 대조군으로부터 미리 결정된 후, 시그널의 유의성이 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 핵산 증폭 없이 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
본 발명에서, 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 타겟 증폭과 동시에 증폭될 수 있다. 선택적으로, 시그널은 타겟 증폭 없이 증폭될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널 발생은 타겟 증폭과 함께 시그널 증폭을 포함하는 과정에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 증폭은 PCR(중합효소 연쇄 반응)에 따라 실시된다. PCR은 타겟 증폭을 위해 당업계에서 널리 이용되며, 이는 타겟 서열의 변성, 타겟 서열과 프라이머 간의 어닐링(혼성화) 및 프라이머 연장의 사이클을 포함한다(Mullis et al. 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354). 시그널은 상술한 시그널 발생 방법(예컨대, TaqMan 방법 및 PTOCE-기반 방법)을 PCR 과정에 적용함으로써 증폭될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 본 발명은 실시간 PCR 방법에 의해 시그널을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 증폭은 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가아제 연쇄 반응, Wiedmann M, et al., "Ligase chain reaction (LCR)- overview 및 applications." PCR Methods and Applications 1994 Feb;3(4):S51-64 참고), GLCR(갭 필링 LCR, WO 제90/01069호, EP 제439182호 및 WO 제93/00447호 참고), Q-beta(Q-베타 레플리카제 증폭, Cahill P, et al., Clin Chem., 37(9):1482-5(1991), 미국 특허 제5556751호 참고), SDA(가닥 치환 증폭, G T Walker et al., Nucleic Acids Res. 20(7):16911696(1992), EP 제497272호 참고), NASBA(핵산 서열-기반 증폭, Compton, J. Nature 350(6313):912(1991)), TMA(전사-매개 증폭, Hofmann WP et al., J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); 미국 특허 제5888779호 참고) 또는 RCA(롤링 서클 증폭, Hutchison C.A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 102:1733217336(2005) 참고)에 의해 수행된다.
상기 기재된 증폭 방법은 온도를 변화시키거나 온도를 변화시키지 않는 일련의 반응의 반복을 통해 타겟 서열을 증폭시킬 수 있다. 일련의 반응의 반복을 포함하는 증폭의 단위는 "사이클"로 표현된다. 사이클의 단위는 증폭 방법에 따라 반복 횟수 또는 시간으로서 표현될 수 있다.
예를 들어, 시그널의 검출은 증폭의 각 사이클, 선택된 몇 개의 사이클 또는 반응의 엔드-포인트에서 실시될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 적어도 2개의 사이클에서 시그널이 검출되는 경우, 각각의 사이클에서의 시그널의 검출은 모든 검출 온도 또는 일부 선택된 검출 온도에서 실시될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출은 홀수 사이클에서는 상대적 고온 검출 온도에서 실시되고 짝수 사이클에서는 상대적 고온 검출 온도에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인큐베이션은 시그널-발생 수단에 의한 시그널 발생뿐만 아니라 타겟 증폭이 가능한 조건에서 수행된다.
타겟 핵산 서열의 증폭은 증폭을 위한 프라이머 세트 및 핵산 중합효소를 포함하는 타겟 증폭 수단에 의해 달성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 뉴클레아제 활성(예컨대 5' 뉴클레아제 활성 또는 3' 뉴클레아제 활성)을 갖는 핵산 중합효소가 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소가 사용될 수 있다.
본 발명에서 유용한 핵산 중합효소는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함하는, 다양한 박테리아 종으로부터 수득된 열안정성 DNA 중합효소이다. 특히, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 증폭은 비대칭 PCR에 의해 달성된다. 프라이머의 비율은 다운스트림 올리고뉴클레오타이드의 절단 또는 혼성화를 고려하여 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 공정에서 실시된다.
시그널이 올리고뉴클레오타이드의 절단을 포함하는 방법에 의해 발생되는 경우, 시그널은 타겟 증폭 없이 증폭될 수 있다. 예를 들어, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)는 CPT 방법(Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148 (1990)), 인베이더 분석(미국 특허 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE-기반 방법(예컨대, PCE-SH 방법, PCE-NH 방법 및 PCEC 방법) 또는 CER 방법(WO 제2011/037306호)에 따라 타겟 서열의 증폭 없는 시그널 증폭으로 실시될 수 있다.
전술한 시그널 증폭 방법은 온도를 변화시키거나 온도를 변화시키지 않는 일련의 반응의 반복을 통해 시그널을 증폭시킬 수 있다. 일련의 반응의 반복을 포함하는 시그널 증폭의 단위는 "사이클"로서 표현된다. 사이클의 단위는 증폭 방법에 따라 반복 횟수 또는 시간으로 표현될 수 있다.
예를 들어, 시그널의 발생 및 검출은 증폭의 각 사이클, 선택된 몇 개 사이클 또는 반응의 엔드-포인트에서 실시될 수 있다.
시그널을 발생시키기 위해 샘플을 2개의 시그널-발생 수단과 인큐베이션(반응)하는 동안 또는 후에, 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기를 사용하여 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도는 시그널-발생 수단에 의해 시그널 발생을 가능하게 하는 온도 범위를 고려하여 미리 결정된다.
본 발명은 시그널-발생 수단에 의존적인 방식으로 시그널 발생을 가능하게 하는 특정 온도 범위가 존재한다는 것을 이용한다.
예를 들어, 시그널-발생 수단이 2개의 핵산 분자 간의 혼성화(또는 결합)시에는 시그널을 발생시키고, 이들 간의 비-혼성화(또는 해리)시에는 시그널을 발생하지 않는 경우, 2개의 핵산 분자 간의 혼성화를 가능하게 하는 온도에서는 시그널이 발생되지만, 2개의 핵산 분자 간에 혼성화되지 못하는 온도에서는 시그널이 발생되지 않는다. 이와 같이, 시그널 발생(즉, 시그널 검출)을 가능한 특정 온도 범위와 시그널 발생이 불가능한 다른 온도 범위가 존재한다. 상기 온도 범위는 시그널-발생 수단에서 사용되는 2개의 핵산 분자의 혼성화물의 Tm 값에 의해 영향을 받는다.
절단 후 표지를 갖는 절단된 단편을 사용하는 시그널 발생 방법이 이용되는 경우, 시그널은 이론적으로 임의의 온도(예컨대, 30-99℃)에서 검출될 수 있다.
검출 온도는 시그널 발생 수단에 의해 시그널 발생이 가능한 온도 범위로부터 선택된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 시그널-발생 수단은 2개의 검출 온도에서 서로 상이한 시그널(예컨대 시그널 강도)을 제공하는 시그널-발생 수단일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단(예컨대 TaqMan 프로브 방법)이 이용되는 경우, 시그널-발생 수단으로부터의 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화 및 염료로부터의 시그널 발생이 온도에 영향을 받을 수 있다는 점에서 검출 온도에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자로 표지된 프로브는 검출 온도에 따라 상이한 시그널을 발생할 수 있으며, 프로브는 상대적 고온 검출 온도보다 상대적 저온 검출 온도에서 더 높은 시그널을 발생시킬 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 상이한 검출 온도 및 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 사용함으로써 2개의 타겟 서열을 검출할 수 있다. 본 발명의 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 모두는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이다.
검출 온도는 시그널 발생 수단에 의해 시그널 발생이 가능한 온도 범위로부터 선택된다. 용어 "검출 온도 범위"는 특히 시그널 발생(즉, 시그널 검출)이 가능한 온도 범위를 특히 기술하기 위해 본원에서 사용된다.
본 발명에 따르면, 각각의 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 온도는 시그널-발생 수단을 고려하여 할당될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 검출이 실시되는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도는 미리 결정될 수 있다. 예를 들어, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도는 각각 72℃ 및 60℃로 미리 결정된 다음, 상기 검출 온도에 적합한 시그널-발생 수단이 제작된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단이 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 검출 온도는 이합체의 Tm 값에 기초하여 선택된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단이 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 검출 온도는 이합체의 Tm 값을 조절함으로써 제어될 수 있다.
예를 들어, 시그널이 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 검출 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 럭스 프로브, 분자 비콘 프로브, 하이비콘 프로브 및 인접한 혼성화 프로브)에 의해 발생되는 경우, 시그널의 검출은 올리고뉴클레오타이드의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이뤄진다. 스콜피온 프라이머가 사용되는 경우, 시그널의 검출은 연장 가닥과 혼성화될 부위의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이뤄진다.
시그널이 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체의 의해 발생되는 경우, 시그널의 검출은 이합체의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이뤄진다. 예를 들어, 시그널이 PTOCE 방법에 의해 발생되는 경우, 시그널의 검출은 CTO 상에서 PTO 단편의 연장에 의해 형성된 연장 이합체의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이뤄진다.
PTOCE-기반의 방법은 이합체 및 상기 이합체에 의해 혼성화가 영향을 받는 제3 혼성체의 Tm 값을 쉽게 조절하는 이점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생하는 경우, 절단에 의해 방출된 표지가 시그널을 방출함에도 불구하고, 검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화가 시그널 발생을 유도하기 때문에, 검출 올리고뉴클레오타이드의 Tm 값에 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용된 검출기는 시그널을 검출할 수 있는 임의의 수단을 포함한다. 예를 들어, 형광 시그널이 사용되는 경우, 형광 시그널의 검출에 적합한 광다이오드가 검출기로 이용될 수 있다. 단일 유형의 검출기를 사용한 검출은 단일 유형의 시그널을 검출할 수 있는 검출기를 사용하여 또는 몇 개의 채널(즉, 광다이오드)을 갖는 검출기의 각각의 채널(즉, 광다이오드)을 사용하여 검출이 실시되는 것을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 시그널의 발생은 표지로부터의 "시그널 발생 또는 소멸" 및 "시그널 증가 또는 감소"를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 생물학적 샘플(예컨대, 생물학적 공급원으로부터의 세포, 조직, 및 유체) 및 비-생물학적 샘플(예컨대, 식품, 물 및 토양)을 포함한다. 생물학적 샘플은 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 객담, 스왑, 흡인물, 기관지 폐포 세척액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 타액, 정액, 뇌 추출물, 척수액(SCF), 충수, 비장 및 편도 조직 추출물, 양수 및 복수를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 샘플은 생물학적 공급원으로부터 단리된 자연 핵산 분자 및 합성 핵산 분자를 포함할 수 있다.
단계 (a)를 실시하기 전에 단계 (b)를 실시할 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 그러한 변화 및 변형은 첨부된 청구범위 및 이의 균등범위에 의해 결정되는 본 발명의 범위에 속한다.
단계 (c): 기준값 및 시그널에 의한 타겟 핵산 서열의 존재의 결정
마지막으로, 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 기준값 중 적어도 하나 및 단계 (b)에서 검출된 시그널에 의해 결정한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 2개의 기준값(즉, 제1 기준값 및 제2 기준값)에 의해 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는데 사용된다.
타겟 핵산 서열의 존재의 결정과 관련하여 본원에 사용된 용어 "기준값 및 시그널에 의해"는, 단계 (a)에서 제공되는 기준값 및 시그널-발생 수단으로부터 발생된 시그널을 직접 또는 간접적으로 사용하거나 변형시키거나 수학적으로 처리함으로써(기준값 및 시그널의 수치 또는 이들의 변형을 사용하는 것, 기준값의 범위를 사용하는 것, 기준값 및 시그널을 플로팅하는 것, 및 시그널의 존재/부재를 사용하는 것 포함) 타겟 핵산 서열의 존재가 결정되는 것을 의미한다. 용어 "기준값 및 시그널에 의해" 및 "기준값 및 시그널을 사용하여" 간에는 어떤 의도된 차이도 없으며, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 것이다.
2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재는 단계 (a)에서 제공된 2개의 기준값 중 적어도 하나 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 사용하여 결정될 수 있으며, 이로써 보다 정확한 결정이 하기와 같이 이뤄진다:
일 구현예에 따르면, 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열의 존재는 제2 기준값 및 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 단계 (b)에서 검출된 시그널에 의해 결정되며, 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열의 존재는 제1 기준값 및 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 단계 (b)에서 검출된 시그널에 의해 결정된다.
일 구현예에 따르면, 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열의 존재는 제2 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 이용하여 계산된 차이에 의해 결정되며, 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열의 존재는 제1 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 이용하여 계산된 차이에 의해 계산된다.
더욱 특히, 제1 타겟 핵산 서열의 존재의 결정은 제2 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 처리하여 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 제거하고 제1 시그널 발생 수단에 의한 시그널의 발생을 결정하는 것을 포함하며; 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정은 제1 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 처리하여 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 제거하고 제2 시그널 발생 수단에 의한 시그널의 발생을 결정하는 것을 포함한다.
더욱더 특히, 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 단계 (b)에서 검출된 시그널로부터 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 수학적으로 제거하는 것이며, 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 단계 (b)에서 검출된 시그널로부터 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 수학적으로 제거하는 것이다.
더욱더 특히, 제2 시그널 발생 수단에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제2 기준값 및 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되며, 이에 의해 제1 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하며, 이는 제1 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부재를 입증한다.
예를 들어, 제2 기준값이 2개의 검출 온도에서 제2 시그널-발생 수단에 의해 제공된 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득되는 경우, 제1 시그널 발생 수단에 의한 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널의 발생은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에서 값을 빼냄으로써 결정될 수 있고; 상기 값은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 제2 기준값을 곱하거나 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 제2 기준값으로 나눔으로써 수득된다.
일 구현예에 따르면, 검출 온도에서 검출된 시그널을 기준값에 의해 "곱하거나" 또는 "나누는" 것은 상기 비율을 계산하는 방법에 따라 달라진다.
더욱더 특히, 제2 시그널 발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제2 기준값 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되며, 이에 의해 제1 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하며, 이는 제1 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부재를 입증한다.
예를 들어, 제2 기준값이 2개의 검출 온도에서 제2 시그널-발생 수단에 의해 제공된 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득되는 경우, 제1 시그널 발생 수단에 의한 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 발생은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 값을 빼냄으로써 결정될 수 있고; 상기 값은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 제2 기준값을 곱하거나 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 제2 기준값으로 나눔으로써 수득된다.
더욱더 특히, 제1 시그널 발생 수단에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제1 기준값 및 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되며, 이에 의해 제2 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정한다.
예를 들어, 제1 기준값이 2개의 검출 온도에서 제1 시그널-발생 수단에 의해 제공되는 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득되는 경우, 제2 시그널 발생 수단에 의한 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널의 발생은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 값을 빼냄으로써 결정될 수 있고; 상기 값은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 제1 기준값을 곱하거나 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 제1 기준값으로 나눔으로써 수득된다.
더욱더 특히, 제1 시그널 발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제1 기준값 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되며, 이에 의해 제2 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정한다.
예를 들어, 제1 기준값이 2개의 검출 온도에서 제1 시그널-발생 수단에 의해 제공된 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득되는 경우, 제2 시그널 발생 수단에 의한 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 발생은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 값을 빼냄으로써 결정될 수 있고; 상기 값은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 제1 기준값을 곱하거나 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 제1 기준값으로 나눔으로써 수득된다.
본 발명의 기본이 되는 실시 원리가 하기와 같이 실시예 1을 참조하여 설명될 것이다:
실시예 1에서, 제1 타겟 핵산 서열(NG) 및 제1 시그널-발생 수단을 인큐베이션한 다음, 상대적 저온 검출 온도(L) 및 상대적 고온 검출 온도(H)에서 시그널을 측정한다. 제1 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 저온 검출 온도에서의 검출된 시그널(FTL) 대 제1 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 고온 검출 온도에서의 검출된 시그널(FTH)의 비율을 계산하고, 이를 결국 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값(NG의 RV = RVF = (FTL) ÷ (FTH) = 1.8)으로서 사용한다.
제2 타겟 핵산 서열(CT) 및 제2 시그널-발생 수단을 인큐베이션한 다음, 상대적 저온 검출 온도(L) 및 상대적 고온 검출 온도(H)에서 시그널을 측정한다. 제2 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 저온 검출 온도의 검출된 시그널(STL) 대 제2 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 고온 검출 온도에서의 검출된 시그널(STH)의 비율을 계산하고, 이는 결국 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값(CT의 RV = RVS = (STL ) ÷ (STH) = 5.8)으로서 사용한다.
샘플을 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 인큐베이션하는 경우, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출되는 형광 시그널은 각각 FH 및 FL로 표시된다.
실시예 1에서와 같이, 타겟 핵산 서열에 대한 기준값이 비율에 의해 제공되는 경우, 제1 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해 하기 식이 제공될 수 있다(도 1C 및 (ii) 참고): FL - [FH x RVS].
샘플 내의 FH는 상대적 고온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열로부터의 시그널(FTH) 및 제2 타겟 핵산 서열로부터의 시그널(STH)의 합으로서 표현될 수 있고, 샘플 내의 FL은 상대적 저온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열로부터의 시그널(FTL) 및 제2 타겟 핵산 서열로부터의 시그널(STL)의 합으로서 표현될 수 있다: FH = FTH + STH 및 FL = FTL + STL.
FL - [FH x RVS]는 하기와 같이 표현될 수 있다:
FL - [FH x RVS] = (FTL + STL) - [(FTH + STH) x RVS]
= FTL - RVS x FTH + STL - RVS x STH
= FTL - 5.8 x FTH + STL - 5.8 x STH.
샘플이 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 경우, (STL - 5.8 x STH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있는데, RVS = STL / STH = 5.8이기 때문이다.
제2 타겟 핵산 서열이 샘플에 존재하지 않는 경우에도, (STL - 5.8 x STH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있는데, STL 및 STH가 실질적으로 0의 값이기 때문이다.
샘플이 제1 타겟 핵산 서열을 포함하는 경우, (FTL - 5.8 x FTH)는 음의 값을 나타낼 것인데, (FTL - 5.8 x FTH)에서 5.8의 기준값이 사용되는 반면 제1 타겟 핵산의 제1 기준값은 1.8이기 때문이다.
따라서, (FTL - 5.8 x FTH)가 음의 값을 나타내는 경우, 샘플은 제1 타겟 핵산 서열을 포함하는 것으로 결정된다(도 1C 참고).
제1 타겟 핵산 서열이 샘플 내에 존재하지 않는 경우, (FTL - 5.8 x FTH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있다(도 1C 참고).
선택적으로, 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해, 즉 제2 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해, 하기 식이 또한 제공될 수 있다(도 1D 및 (ii) 참고): FL - [FH x RVF].
FL - [FH x RVF]는 하기와 같이 표현될 수 있다:
FL - [FH x RVF] = (FTL + STL) - [(FTH + STH) x RVF]
= FTL - RVF x FTH + STL - RVF x STH
= FTL - 1.8 x FTH + STL - 1.8 x STH.
샘플이 제1 타겟 핵산 서열을 포함하는 경우, FTL - 1.8 x FTH는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있는데, RVF = FTL / FTH = 1.8이기 때문이다.
제1 타겟 핵산 서열이 샘플 내에 존재하지 않는 경우에도, (FTL - 1.8 x FTH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있는데, FTL 및 FTH가 실질적으로 0의 값이기 때문이다.
샘플이 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 경우, (STL - 1.8 x STH)는 양의 값을 나타낼 것인데, (STL - 1.8 x STH)에서 1.8의 기준값이 사용된 반면, 제2 타겟 핵산에 대한 제2 기준값은 5.8이기 때문이다.
따라서, (STL - 1.8 x STH)이 양의 값을 나타내는 경우, 샘플은 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 것으로 결정된다(도 1D 참고).
제2 타겟 핵산 서열이 샘플 내에 존재하지 않는 경우, (STL - 1.8 x STH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있다(도 1D 참고).
전술한 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 분석함으로써 타겟 핵산 서열을 검출하는 원리를 고려할 때, 타겟 핵산 서열의 검출은 하기와 같이 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널을 분석함으로써 달성될 수 있다:
예를 들어, 제1 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해 하기 식이 제공된다(도 1C 및 (i) 참고): FH - [FL ÷ RVS].
선택적으로, 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해, 즉 제2 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해, 하기 식이 또한 제공될 수 있다(도 1D 및 (i) 참고): FH - [FL ÷ RVF].
전술한 구현예를 고려할 때, 당업자는 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 고온 검출 온도에서의 검출된 시그널(FTH) 대 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 저온 검출 온도에서의 검출된 시그널(FTL)의 비율을 계산하고 이를 기준값(즉, RV = (FTH) ÷ (FTL))으로서 사용하여, 본 발명의 방법에 따라 핵산 서열의 존재 또는 부재를 결정한다는 것을 이해할 것이다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 전술한 식에 의한 계산 결과의 유의성을 결정하기 위해 역치값을 추가로 사용한다. 선택된 식에 따라, 상이한 역치값이 적용될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 역치값은 기준값을 상호 보완하기 위해 선택될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널이 PCR에 의한 타겟 증폭과 관련하여 실시간 방식으로 발생되는 경우, 각 증폭 사이클 또는 일부 선택된 사이클에서의 시그널이 기준값을 이용하여 처리되고, 계산 결과가 사이클에 대해 플롯팅되어 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에 사용된다.
일 구현예에 따르면, 하나의 반응 용기는 2개의 타겟 핵산 서열 이외의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 추가적인 2개의 시그널-발생 수단을 각각 함유하는 적어도 하나의 추가적인 세트를 추가로 포함하고; 용기 내의 2개의 시그널-발생 수단 중 각 세트에 의해 발생된 시그널은 서로 구별되며, 상기 시그널은 각각 상이한 유형의 검출기에 의해 검출된다. 예를 들어, 단계 (b)에서 2개의 시그널-발생 수단이 FAM으로 표지되고 추가적인 2개의 시그널-발생 수단이 Quasar 570으로 표지되는 경우, 상기 용기에서 FAM-표지된 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널은 Quasar 570-표지된 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널과 구별되므로, 2개의 상이한 방출 광을 검출하기 위해 2개의 유형의 검출기가 필요하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 2개의 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하고, 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 한 가지 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함하며, 다른 하나는 다른 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 서열이 유사한 연속적인 DNA 세그먼트 중 특정 위치의 DNA 서열에서의 임의의 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적인 DNA 세그먼트는 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 임의의 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이 또는 다형성 대립유전자 변이일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출된 뉴클레오타이드 변이는 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성), 돌연변이, 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 예시된 뉴클레오타이드 변이는 인간 지놈 내의 다양한 변이(예컨대, MTHFR(메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원효소) 유전자에서의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 종양형성 유발 변이를 포함한다. 본원에 사용된 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산 서열의 특정 위치에서의 임의의 변이를 포함한다. 즉, 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산 서열의 특정 위치에서의 야생형 및 그의 임의의 돌연변이형을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체는 제1 시그널-발생 수단을 사용하여 검출되고, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체는 제2 시그널-발생 수단을 사용하여 검출되며, 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체는 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단을 사용하여 검출된다.
본 발명의 기초가 되는 실시 원리하에, 본 발명의 방법은 3개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 검출에 적용될 수 있다.
예를 들어, 3개의 타겟 핵산 서열은 제1 타겟 핵산 서열, 제2 타겟 핵산 서열 및 제3 타겟 핵산 서열을 포함한다. 이들 중, 제1 타겟 핵산 서열은 하기와 같이 검출될 수 있다:
제2 타겟 핵산 서열 및 제3 타겟 핵산 서열이 종합적으로 단일 타겟으로서 고려되는 경우, 제2 타겟 핵산 서열 및 제3 타겟 핵산 서열을 제2 시그널-발생 수단 및 제3 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션함으로써 상기 단일 타겟에 대한 종합적 기준값을 수득할 수 있다. 선택적으로, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값 또는 제3 타겟 핵산 서열에 대한 제3 기준값 중 하나가 종합적 기준값으로서 이용될 수 있다.
그리고 나서, 상기 종합적 기준값 및 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 제1 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
또한, 제2 타겟 핵산 서열 및 제3 타겟 핵산 서열 각각의 존재 또는 부재는 제1 타겟 핵산 서열에 대한 검출 접근법에 따라 결정될 수 있다.
II. 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형 분석
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 방법이 제공된다:
(a) (i) 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값; (ii) 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값; 및 (iii) 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값을 제공하는 단계로서; 상기 3개의 기준값은 서로 상이하며;
(b) 상기 SNP 대립유전자를 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 샘플을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널들은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(c) 상기 기준값 및 상기 단계 (b)에서 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
본 발명은 원칙적으로 전술한 본 발명의 제1 양태를 따르므로, 이들 사이의 공통된 설명은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다. 본 양태를 설명하기 위해 제1 양태에 대한 설명을 언급하는 경우, 본 양태는 제1 양태와 일부 상이하다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 당업자는 제1 양태에 대한 일부 설명이 본 양태에 대한 설명에 직접적으로 적용될 수 있고, 변형된 다른 설명이 본 양태에 대한 설명에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
단계 (a): 기준값의 제공
제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값 및 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값을 제공한다.
본 발명은 3개의 유전자형에 대한 기준값을 이용하는 특징을 갖는다.
각각의 기준값은 상응하는 SNP 유형 및 시그널-발생 수단을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출한 다음, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 얻음으로써 수득될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단은 3개의 기준값이 서로 상이하도록 설계된다.
일 구현예에 따르면, (i) 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값은 (i-1) 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체를 제1 SNP 대립유전자의 검출을 위한 제1 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하는 단계, (i-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출하는 단계, 및 (i-3) 이후 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 수득하는 단계에 의해 수득되며, (ii) 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값은 (ii-1) 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체를 제2 SNP 대립유전자의 검출을 위한 제2 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하는 단계, (ii-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출하는 단계, 및 (ii-3) 이후 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 수득하는 단계에 의해 수득되며; 및 (iii) 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값은 (iii-1) 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체를 제1 SNP 대립유전자의 검출을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 SNP 대립유전자의 검출을 위한 제2 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하는 단계, (iii-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출하는 단계, 및 (iii-3) 이후 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 수득하는 단계에 의해 수득된다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단은 제1 SNP 대립유전자에 대한 기준값이 제2 SNP 대립유전자에 대한 기준값과 상이하도록 설계된다.
SNP 사이트를 함유하는 핵산 서열은 인간의 염색체 쌍을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값 수득시 검출된 시그널 간의 차이는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 기준값 수득시 검출된 시그널 간의 차이는 시그널 간의 비율이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값 수득시 검출된 시그널 간의 차이는 특정 범위를 가지며, 상기 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값으로 또는 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값을 참조하여 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 반응 완료시에 포화 시그널을 제공하기에 충분한 반응 조건 하에서 수득될 수 있다. 예를 들어, 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자 모두로 구성된 이형접합체에 대한 기준값을 수득하기 위해, 각각의 SNP 대립유전자의 함량과 같은 반응 조건은 반응 완료시에 각각의 SNP 대립유전자에 대한 포화 시그널이 제공되도록 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값 계산시 수득된 시그널 간의 차이는 특정 범위를 가지며, 상기 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값으로 또는 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값을 참조하여 선택될 수 있다.
단계 (b): 샘플과 시그널-발생 수단 및 시그널 검출과의 인큐베이션
SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 사이트를 함유하는 핵산 서열을 포함하는 샘플을 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하기 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하고, 상기 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출한다. 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고, 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널들은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 수행된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 수행된다.
단계 (c): SNP 유전자형의 결정
마지막으로, 기준값 및 단계 (b)에서 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정한다.
본 발명은 샘플 내에 어떤 SNP 대립유전자가 존재하는지 결정하지 않고 단지 상응하는 SNP 유전자형의 기준값 및 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 분석할 수 있다.
개별적인 SNP 대립유전자의 존재를 결정하는 것이 필요하지 않은 이유는 3개의 SNP 유전자형이 있고, SNP에 대한 이형접합체가 야생형 대립유전자 및 돌연변이 대립유전자를 1:1의 비율로 포함한다는 점이다. 또한, 상기 이유는 샘플 인큐베이션에서 핵산 분자의 양이 쉽게 조절될 수 있다는 점이다.
일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 검출된 시그널 간의 차이는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 수득되는 차이를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 검출된 시그널 간의 차이는 상기 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 SNP 대립유전자를 함유하는 동형접합체 샘플은 특정 범위 내의 차이(예컨대 비율)을 나타내고, 이형접합체 샘플은 또 다른 범위 내의 차이(예컨대 비율)를 나타내며, 제2 SNP 대립유전자를 함유하는 동형접합체 샘플은 다른 특정 범위 내의 차이(예컨대 비율)를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, SNP 유전자형은 시그널 간의 차이를 기준값과 비교함으로써 결정된다. 예를 들어, 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값이 1.0이고, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값이 5.2이며, 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값이 3.2이고, 단계 (b)에서 시그널 간의 차이가 실질적으로 1.0인 경우, 샘플은 제1 SNP 대립유전자의 동형접합체인 것으로 결정된다.
일 구현예에 따르면, 각 유전자형에 대한 기준값의 범위를 고려하여 2개의 컷오프 값이 확립되고 유전자형 분석에 사용될 수 있다.
IV. 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 키트
본 발명의 추가의 양태에서, 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트가 제공된다:
(a) 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단; 및
(b) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열의 검출이라는 제목의 양태 I의 본 발명의 방법을 기재하는 설명서.
본 발명의 추가의 양태에서, 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트가 제공된다:
(a) 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단; 및
(b) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 검출이라는 제목의 양태 II의 본 발명의 방법을 기재하는 설명서.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 키트가 제공된다:
(a) 제1 SNP 대립유전자를 위한 시그널-발생 수단;
(b) 제2 SNP 대립유전자를 위한 시그널-발생 수단; 및
(c) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형 분석이라는 제목의 양태 III의 본 발명의 방법을 기재하는 설명서.
본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 실시하기 위해 제조되므로, 이들 사이의 공통된 설명은 본 발명의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
전술한 본 발명의 모든 키트는 버퍼, DNA 중합효소 보조인자, 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군을 실시하는데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은 본 개시사항의 이점을 알고 있는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 키트의 구성성분은 개별 용기 내에 존재할 수 있거나, 복수의 구성요소가 하나의 용기 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 방법을 기술하거나 실시하기 위한 설명서는 적합한 기록 매체에 기록될 수 있다. 예를 들어, 설명서는 종이 및 플라스틱과 같은, 기판 상에 인쇄될 수 있다. 다른 구현예에서, 설명서는 CD-ROM 및 디스켓과 같은 적합한 컴퓨터 해독가능한 저장 매체 상에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키트 내에 실질적인 설명서가 포함되지 않을 수 있지만, 원격 소스로부터, 예컨대 인터넷을 통해, 설명서를 얻는 수단이 제공된다. 상기 구현예의 한 가지 예는 설명서를 볼 수 있고/거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다.
V. 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 저장 매체 및 장치
하기 기재된 본 발명의 저장 매체, 장치 및 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터에서 본 발명의 방법을 실시하기 위한 것이므로, 이들 사이의 공통된 설명은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체가 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 타겟 핵산 서열을 위한 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널, 및 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및/또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값에 의해 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 상기 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며; 상기 제1 기준값은 상기 제2 기준값과 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값 및/또는 제2 기준값은 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 본 방법을 실행시 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 타겟 핵산 서열을 위한 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널, 및 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및/또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값에 의해 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 상기 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며; 상기 제1 기준값은 상기 제2 기준값과 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 본 방법을 실행시 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
상기 프로세서에 의해 실행되는 경우, 상기 프로그램 지시가 작동되어, 프로세서가 상술한 본 발명의 방법을 실행하게 한다. 프로그램 지시는 제1 시그널 및 제2 시그널을 수신하는 지시를 포함할 수 있고, 상기 수신된 시그널을 이용하여 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 지시를 포함할 수 있다.
전술한 본 발명의 방법은, 프로세서, 예컨대, 독립형 컴퓨터(stand-alone computer), 네트워크에 연결된 컴퓨터(network attached computer) 또는 실시간 PCR 기기와 같은 데이터 수집 장치(data acquisition device)에 있는 프로세서에서 실행된다.
컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 CD-R, CD-ROM, DVD, 플래쉬 메모리, 플로피 디스크, 하드 드라이브, 포터블 HDD, USB, 마그네틱 테이프, MINIDISC, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 광학 디스크, 광학 기록매체, RAM, ROM, 시스템 메모리 및 웹 서버와 같은 다양한 저장 매체를 포함한다.
시그널과 관련된 데이터(예컨대, 강도, 증폭 사이클 수 및 검출 온도)는 몇 가지 기기를 통해 수신될 수 있다. 예를 들어, 데이터는 PCR 데이터 수집 장치에 있는 프로세서에 의해 수집될 수 있다. 데이터는 데이터가 수집되고 있는 동안 실시간으로 제공될 수 있거나, 또는 메모리 유닛이나 버퍼에 저장될 수 있으며, 실험 완료 후 프로세서에 제공될 수 있다. 유사하게, 상기 데이터 세트는 상기 수집 장치와의 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷 및 인트라넷) 또는 직접 연결(예컨대, USB 또는 다른 직접 유선 연결 또는 무선 연결)에 의해 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 별도의 시스템에 제공될 수 있고, 또는 CD, DVD, 플로피 디스크, 포터블 HDD 등과 같은 휴대용 매체 상에서 독립형 컴퓨터 시스템에 제공될 수 있다. 유사하게, 상기 데이터 세트는 노트북 또는 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 클라이언트에 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷, 인트라넷 및 무선 통신 네트워크)을 통하여 서버 시스템에 제공될 수 있다. 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되는 경우, 데이터가 수신되거나 수집된 후에, 상기 데이터 분석 과정은 타겟 핵산 서열의 존재 결정을 위한 시그널 간의 차이로부터 얻은 처리된 시그널을 제공한다. 프로세서는 시그널과 관련된 수신된 데이터를 처리하여 2개의 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 반영하는 처리된 시그널을 제공한다. 예를 들어, 프로세서는 수신된 데이터를 처리하여 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율을 수득한다.
본 발명을 실행하는 프로세서를 구현하는 지시들은 로직 시스템에 포함될 수 있다. 상기 지시는 비록 휴대용 HDD, USB, 플로피 디스크, CD 및 DVD와 같은 어떠한 소프트웨어 저장 매체 상으로 제공될 수 있지만, 다운로드되어 메모리 모듈(예컨대, 하드 드라이브 또는 로컬 또는 부착 RAM이나 ROM과 같은 다른 메모리)에 저장될 수 있다. 본 발명을 실행하기 위한 컴퓨터 코드는, C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl 및 XML과 같은 다양한 코딩 언어로 실행될 수 있다. 또한, 다양한 언어 및 프로토콜은 본 발명에 따른 데이터와 명령의 외부 및 내부 저장과 전송에 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 전술한 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 시료 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 장치가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 장치는 시료 및 시그널-발생 수단을 수용할 수 있는 반응 용기, 상기 반응 용기의 온도를 조절하는 온도 조절 수단 및/또는 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널을 검출하기 위한 단일 유형의 검출기를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로세서는 단일 유형의 검출기가 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 할 뿐만 아니라 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 계산할 수 있게 한다. 상기 프로세서는 하나의 프로세서가 두 가지 행위를 하는 방식으로 제작될 수 있다: 2개의 검출 온도에서의 검출 및 차이 계산의 명령. 선택적으로, 프로세서 유닛은 2개의 프로세서가 두 가지 행위를 각각 하는 방식으로 제작될 수 있다.
상기 장치의 첫 번째 필수적인 특징은 상기 장치가 상기 2개의 검출 온도에서 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 하는 프로세서를 가지고 있다는 것이다. 일 구현예에 따르면, 시그널이 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 발생되는 경우, 상기 장치는 매 증폭 사이클마다 상기 2개의 검출 온도에서 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 하는 프로세서를 포함한다.
상기 장치의 두 번째 필수적인 특징은 상기 장치가 상기 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널을 처리하여 상기 시그널 간의 차이를 얻는 프로세서를 가지고 있다는 것이다. 일 구현예에 따르면, 상기 시그널 간의 차이는 수학적인 처리에 의해 수치로서 표현된다.
일 구현예에 따르면, 상기 프로세서는 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 종래의 장치(예컨대, 실시간 PCR 장치)에 소프트웨어가 설치되어 구현될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 장치는 최소 2개의 검출 온도에서 시그널을 검출할 수 있게 하며, 최소 2개의 검출 결과를 수학적으로 처리할 수 있게 하는 프로세서를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체가 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 SNP 대립 유전자를 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널 간의 차이, 및 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값 및 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며, 제3 기준값은 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고; 상기 3개의 기준값은 서로 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값은 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 본 방법을 실행시 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 SNP 대립 유전자를 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널 간의 차이, 및 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값 및 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며, 제3 기준값은 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고; 상기 3개의 기준값은 서로 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 방법을 실행시 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가로 포함한다.
본 발명의 추가 양태에서, (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 전술한 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 포함하는, 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하기 위한 장치가 제공된다.
종래의 실시간 PCR 방법은 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 2가지 유형의 형광 표지 또는 멜팅 분석이 필요하다.
본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 형광 표지를 사용하여 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 실시간 PCR 프로토콜을 가능하게 한다.
본 발명은 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나에 대해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널들 사이의 차이를 반영하는 기준값이 다른 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다는 흥미로운 발견을 이용한다. 본 발명에서 사용되는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널-발생 수단으로부터 시그널을 발생시키고 검출함으로써 실험적으로 수득되는 일정한 값이다. 기준값은 타겟 핵산 서열을 검출하는데 직접 사용될 수 있다. 선택적으로, 기준값은 타겟 핵산 서열의 존재 및 부재를 입증하기 위해 시그널을 처리하는 식에 다양하게 적용될 수 있다.
특히, 본 발명은 복수의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 시그널-발생 수단이 상이한 검출 온도 모두에서 시그널을 발생시키는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
본 발명은 하기와 같이 다양한 양태로 구현될 수 있다:
(a) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 검출; 및
(b) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형 분석.
I. 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명의 일 양태에서, 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법이 제공된다:
(a) (i) 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및/또는 (ii) 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공되는 시그널의 변화의 관계를 나타내는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값을 제공하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 상기 제2 기준값과 상이하며;
(b) 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 샘플을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 상기 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며;
(c) 상기 기준값 중 적어도 하나 및 상기 단계 (b)에서 검출된 시그널에 의해 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계.
증폭 곡선을 사용하는 종래의 실시간 PCR 방법에 따르면, 구별되지 않는 동일한 시그널을 제공하는 시그널-발생 수단을 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 구별하여 검출할 수 없다는 것이 당업계의 일반적인 상식이다.
본 발명은 본 기술분야의 일반적인 상식과 관련된 한계를 극복하고, 매우 개선된 방식으로 타겟 핵산 서열을 검출하는 예기치 않은 결과를 가져온다.
본 발명은 다음과 같이 상세히 설명될 것이다:
단계 (a): 기준값 제공
제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값을 제공한다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 단일 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 미리 결정된 2개의 검출 온도에서 하나의 반응 용기에서 검출되는 경우, 특정 관계(패턴 또는 규칙)로 시그널 변화가 있음을 확인하였다. 예를 들어, 타겟 핵산 서열에 대하여 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 시그널 변화는 특정 관계(패턴 또는 규칙)를 나타낸다. 예를 들어, 상기 시그널의 강도는 서로 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있거나, 또는 상기 시그널의 강도는 2개의 검출 온도에서 특정 범위에서 서로 상이할 수 있다.
본 발명의 특징은 상기 결과를 기준값을 얻고 타겟 핵산 서열을 검출하는데 적용하는 것이다. 하나의 반응 용기에서 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 검출 온도만을 달리하여(예컨대, 타겟 함량의 변화가 없이, 또는 버퍼 조건의 변화 없이) 검출되기 때문에, 2개의 검출 온도 간의 시그널 변화에는 특정 관계(패턴 또는 규칙)가 있다. 시그널 변화에서의 특정 관계(패턴 또는 규칙)에 기초하여, 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 분석하는데 사용될 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 2개의 검출 온도 사이에서의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 변화에 특정 관계(패턴 또는 규칙)를 허용하는 조건에서 실시된다.
타겟 핵산 서열의 "기준값(reference value, RV)"은 2개의 검출 온도에서 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 시그널-발생 수단에 의해 제공된 시그널 변화의 관계를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 각 기준값은 타겟 핵산 서열에 상응하는 표준 물질 및 시그널-발생 수단을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출한 다음, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 얻음으로써 수득된다.
일 구현예에 따르면, (i) 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값은 (i-1) 제1 타겟 핵산 서열을 제1 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 제1 시그널-발생 수단과 인큐베이션하고, (i-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널을 검출하고, (i-3) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널들 간의 차이를 얻음으로써 수득되고, (ii) 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열을 제2 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 제2 시그널-발생 수단과 인큐베이션하고, (ii-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출하고, (ii-3) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널들 간의 차이를 얻음으로써 수득되며; 상기 제1 기준값은 제2 기준값과 상이하다.
각 기준값은 다양한 방식에 따라 제공될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 각 기준값은 본 발명의 방법을 실시하는 자의 실험에 의해 제공된다.
선택적으로, 각 기준값은 본 발명의 키트, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체, 장치 또는 컴퓨터 프로그램의 제작사에 의해 제공된다. 상기 키트, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체 제품, 장치 또는 컴퓨터 프로그램에 포장된 설명서에 관심 있는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값이 포함될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 수득된다.
이러한 수학적 처리는 시그널의 함수이다. 기준값을 수득하기 위해 사용되는 함수는, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널-발생 수단에 의해 제공되는 시그널 변화의 관계를 제공하는 한, 임의의 함수를 포함한다. 예를 들어, 함수는 시그널의 덧셈, 곱셈, 뺄셈 및 나눗셈과 같은 수학적 처리로서 제시될 수 있다.
상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공되는 시그널의 특징이 그 자체로 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 관계를 수득하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널은 상기 시그널의 특징을 수학적으로 처리함으로써 변형될 수 있고 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 관계를 수득하는데 사용될 수 있다.
선택적으로, 초기에 수득된 기준값은 변형될 수 있고 기준값으로 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값과 관련하여 용어 "시그널"은 검출 온도에서 수득된 시그널 자체뿐만 아니라 시그널을 수학적으로 처리함으로써 제공된 변형된 시그널을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 기준값은 다양한 방식으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 기준값은 예측된 값으로 제공될 수 있다. 타겟 서열, 시그널-발생 수단 및 검출 온도를 고려하여, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 관계를 나타내는 기준값이 예측될 수 있다.
기준값의 수득 시 용어 "제1 검출 온도 및 제2 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이"는 제1 검출 온도 및 제2 검출 온도에서의 시그널 변화의 관계의 일 구현예이다.
일 구현예에 따르면, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 수득되는 차이를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 수학적 처리가 수행되는 경우, 시그널의 특징은 수학적 처리가 쉬워야 한다. 특정 구현예에서, 수학적 처리는 시그널을 사용한 계산(예컨대, 덧셈, 곱셈, 뺄셈 및 나눗셈) 또는 시그널로부터 유래된 다른 값을 수득하는 것을 포함한다.
상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이는 다양한 양태로 표현될 수 있다. 예를 들어, 상기 차이는 수치, 시그널의 존재/부재 또는 시그널 특징을 갖는 플롯으로서 표현될 수 있다.
차이를 수득하기 위한 시그널의 수학적 처리는 다양한 계산 방법 및 이들의 변형에 의해 수행될 수 있다.
특히, 차이를 수득하기 위한 시그널의 수학적 처리는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수행될 수 있다.
예를 들어, 제2 검출 온도에서 검출된 시그널의 엔드-포인트(end-point) 강도 대 제1 검출 온도에서 검출된 시그널의 엔드-포인트 강도의 비율이 기준값으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널 간의 차이를 수득하기 위한 시그널의 수학적 처리는 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율의 계산이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널 간의 차이를 수득하기 위한 시그널의 수학적 처리는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율의 계산이다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 뺄셈을 계산함으로써 수득될 수 있다.
차이를 수득하기 위한 수학적 처리는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 수학적 처리는 기계를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 시그널은 검출기 또는 실시간 PCR 장치 내의 프로세서에 의해 수학적으로 처리될 수 있다. 선택적으로, 시그널은 특히 미리 결정된 알고리즘에 따라 수작업으로 수학적으로 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값은 제2 기준값과 상이하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값이 제2 기준값과 상이하도록 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단이 설계된다.
RV 값이 서로 상이한 경우, 차이 정도를 기술하는 정량적 표현은 RV 값을 계산하는 접근법에 따라 달라질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값을 수득하기 위한 시그널은 공통의 계산 방법에 의해 처리되어 비교를 위한 기준값을 제공할 수 있으며, 이후 상기 비교를 위한 기준값을 사용하여 2개의 기준값 간의 차이 정도를 수득할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 공통 계산 방법은 2개의 시그널의 나눗셈이다.
예를 들어, 본 방법의 방법에 따라 시그널을 분석하는데 사용되는 기준값을 수득하기 위해 2개의 시그널이 뺄셈에 의해 처리되는 경우, 상기 2개의 시그널은 비교를 위한 기준값을 수득하기 위해 나눗셈에 의해 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값은 제2 기준값보다 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.7배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배 또는 10배 더 크다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 제2 기준값은 제1 기준값보다 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.5배, 1.7배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배 또는 10배 더 크다.
일 구현예에 따르면, 제1 기준값이 제2 기준값과 상이한지 여부를 결정하기 위해 비교하는 경우, 상기 기준값은 시그널의 나눗셈에 의해 계산된다. 일 구현예에 따르면, 제1 기준값이 제2 기준값과 상이한지 여부를 결정하기 위해 기준값을 계산하는 방법은 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 기준값을 계산하는 방법과 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값을 위한 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 시그널-발생 수단과 동일할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값을 수득하기 위한 인큐베이션 조건은 샘플의 분석을 위한 인큐베이션 조건과 동일하다.
타겟 핵산 서열에 대하여, 기준값은 성분(예컨대 타겟 핵산 서열, 시그널-발생 수단, 효소, 또는 dNTP)의 양, 버퍼 pH 또는 반응 시간을 포함하는 다양한 반응 조건에서 수득될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 반응 완료 시에 포화 시그널을 제공하기에 충분한 반응 조건 하에서 수득될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값 계산시 수득된 시그널 간의 차이는 특정 범위를 갖고, 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값으로 선택될 수 있거나 또는 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값을 참조하여 선택될 수 있다. 특히, 기준값은 다양한 조건에서 수득된 기준값의 표준 편차, 허용 오차 범위, 특이도 또는 민감도를 고려하여 변형될 수 있다.
본 발명은 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 제공하기 위하여 시그널-발생 수단을 이용한다. 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출된다.
본원에 사용된 용어 "시그널-발생 수단"은 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 발생에 사용되는 임의의 물질을 의미하며, 이는 예를 들어 올리고뉴클레오타이드, 표지 및 효소를 포함한다. 선택적으로, 본원에 사용된 용어 "시그널-발생 수단"은 시그널 발생을 위한 물질을 사용하는 임의의 방법을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인큐베이션은 시그널-발생 수단에 의한 시그널이 발생할 수 있는 조건 하에 실시된다. 이러한 조건은 온도, 염 농도 및 용액의 pH를 포함한다.
시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 예는 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 프로브 및 프라이머)를 포함하며; 타겟 핵산 서열에 혼성화된 프로브 또는 프라이머가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 단편에 특이적으로 혼성화되는 캡처 올리고뉴클레오타이드를 포함하고; 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 단편이 연장되어 연장 가닥을 형성하는 경우, 시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하며; 시그널-발생 수단으로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고; 및 시그널-발생 수단으로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 이의 조합을 포함한다.
시그널 발생 원리는 동일하더라도, 사용된 상이한 서열의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 시그널 발생 수단은 서로 상이한 것으로 간주될 수 있다.
표지는 올리고뉴클레오타이드에 연결되거나, 자유로운 형태일 수 있다. 표지는 연장 반응 동안 연장 산물에 삽입될 수 있다.
시그널 발생에서 올리고뉴클레오타이드의 절단이 사용되는 경우, 효소의 예는 5'-뉴클레아제 및 3'-뉴클레아제, 특히 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 3'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제를 포함한다.
본 발명에서, 시그널은 상기 기재된 다양한 물질을 사용하여 다양한 방식으로 발생될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 중 적어도 하나는 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 이합체는 이중 가닥의 타겟 핵산 서열을 포함한다.
시그널-발생 수단과 관련하여, 본원에 사용된 용어 "이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시킨다"는 것은 검출되는 시그널이 2개의 핵산 분자의 결합 또는 해리에 의존적으로 제공되는 것을 의미한다. 상기 표현은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체(예컨대, 표지를 갖는 검출 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열)에 의해 시그널이 제공되는 것을 포함한다. 또한, 상기 표현은 이합체(예컨대, 표지를 갖는 검출 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열)의 혼성화의 억제에 의해 시그널이 제공되는 것을 포함하며, 상기 억제는 다른 이합체의 형성에 의해 일어난다.
특히, 시그널은 타겟 핵산 서열 및 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의해 발생된다.
본원에 사용된 용어 "검출 올리고뉴클레오타이드"는 검출되는 시그널의 발생에 관여하는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 실제 시그널 발생에 관여하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 다른 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 타겟 핵산 서열, 또는 검출 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드)와 검출 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 또는 비-혼성화가 시그널 발생을 결정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지를 포함한다.
타겟 핵산 서열 및 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의한 시그널은 스콜피온 방법(Whitcombe et al, Nature Biotechnology 17:804-807 (1999)), 선라이즈(또는 Amplifluor) 방법(Nazarenko et al, Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521 (1997), 및 미국 특허 제6,117,635호), 럭스 방법(미국 특허 제7,537,886호), 플렉서(Plexor) 방법(Sherrill C B, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-45569 (2004)), 분자 비콘 방법(Tyagi et al, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), 하이비콘(HyBeacon) 방법(French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 인접한 혼성화 프로브 방법(Bernard, P.S. et al., Anal. Biochem., 273:221(1999)) 및 LNA 방법(미국 특허 제6,977,295)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
특히, 시그널은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 발생된다.
본원에 사용된 용어 "매개 올리고뉴클레오타이드"는 타겟 핵산 서열을 포함하지 않는 이합체의 생산을 매개하는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단 자체는 시그널을 발생시키지 않으며, 매개 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 및 절단 후에 상기 절단에 의해 형성된 단편이 시그널 발생을 위한 연속적인 반응에 관여한다.
일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 또는 절단 자체는 시그널을 발생시키지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 절단되어 단편을 방출함으로써 이합체의 생산을 매개하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특히, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 상기 단편의 연장에 의해 이합체의 생산을 매개한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드는 (i) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단은 단편을 방출하며, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되고 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 연장된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드는 절단되어 단편을 방출하고, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되며, 상기 단편은 연장되어 연장 가닥을 형성하고, 이는 상기 연장 가닥 및 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 연장 이합체의 형성을 야기하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 연장 가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 상기 제3 올리고뉴클레오타이드 및 연장 가닥의 혼성화는 다른 유형의 이합체를 형성하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 캡처 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 제3 올리고뉴클레오타이드 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성은 상기 연장 가닥 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의해 억제되어, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단편, 연장 가닥, 캡처 올리고뉴클레오타이드, 제3 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합이 검출 올리고뉴클레오타이드로서 작용할 수 있다.
매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 2012/096523), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442) 및 PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(PCT/KR2013/012312)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
상기 문헌에 개시된 용어와 관련하여, 올리고뉴클레오타이드의 상응하는 예는 하기와 같다: 매개 올리고뉴클레오타이드는 PTO(프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드)에 상응하고, 캡처 올리고뉴클레오타이드는 CTO(캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드)에 상응하며 제3 올리고뉴클레오타이드는 SO(시그널링 올리고뉴클레오타이드) 또는 HO(혼성화 올리고뉴클레오타이드)에 상응한다. SO, HO, CTO, 연장 가닥 또는 이들의 조합은 검출 올리고뉴클레오타이드로서 역할을 할 수 있다.
매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 다른 이합체의 형성이 억제됨으로써 제공된 시그널(예컨대 PCE-NH)을 포함한다.
예를 들어, 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널이 PTOCE 방법에 의해 발생되는 경우, 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO(프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드), CTO(캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드), 적합한 표지 및 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 포함한다. PTO는 (i) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위를 포함한다. CTO는 3'에서 5' 방향으로 (i) PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
PTOCE 방법에 의한 시그널 발생의 특정한 예는 하기의 단계를 포함한다:
(a) 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장 가닥은 상기 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도하며, 상기 절단은 상기 PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 단편과 CTO를 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편은 연장되어 연장 이합체가 형성되며; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (iii) 상기 단편의 서열 및/또는 길이 및 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 Tm 값을 갖고; 상기 연장 이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 적어도 하나의 표지, (ii) 연장 반응 동안 연장 이합체 내로 삽입된 표지, (iii) 연장 반응 동안 연장 이합체 내로 삽입된 표지 및 단편 및/또는 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지에 의해 타겟 시그널을 제공하며; 및 (e) 상기 연장 이합체가 그의 이중 가닥 형태를 유지하는 미리 결정된 온도에서 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장 이합체를 검출하는 단계로서, 상기 연장 이합체의 존재는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다. 이러한 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가로 포함한다.
문구 "반복 사이클 사이에 변성"에서, 용어 "변성"은 이중 가닥 핵산 분자를 단일 가닥 핵산 분자로 분리하는 것을 의미한다.
PTOCE 방법의 단계 (a)에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드 대신에 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가로 포함한다.
PTOCE 방법은 CTO에 혼성화된 PTO 단편이 연장되어 연장 가닥을 형성한 후, 상기 연장이 검출되는 과정으로서 분류될 수 있다. PTOCE 방법은 연장 가닥 및 CTO 사이의 이합체를 사용하여 연장 가닥의 형성을 검출하는 것을 특징으로 한다.
연장 가닥의 형성을 검출하는 다른 접근법이 있다. 예를 들어, 연장 가닥의 형성은 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 검출될 수 있다(예컨대, PCE-SH 방법). 이 방법에서, 시그널은 (i) 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지, (ii) 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 PTO 단편에 연결된 표지, (iii) 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 연장 반응 동안 연장 가닥에 삽입된 표지, 또는 (iv) 연장가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 인터컬레이팅 염료로부터 제공될 수 있다. 선택적으로, 시그널은 (i) 연장 가닥에 연결된 표지 또는 (ii) 인터컬레이팅 염료로부터 제공될 수 있다.
선택적으로, 연장 가닥의 형성의 검출은 CTO 및 상기 CTO에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 억제를 검출하는 다른 방법(예컨대 PCE-NH 방법)에 의해 실시된다. 이러한 억제는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 것으로 여겨진다. 시그널은 (i) CTO에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지, (ii) CTO에 연결된 표지, (iii) CTO에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지로부터 제공될 수 있다.
일 구현예에 따르면, CTO에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드는 PTO 단편과 겹치는 서열을 갖는다
일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 연장 가닥에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(예컨대, PCE-SH 방법) 및 CTO에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(예컨대 PCE-NH 방법)를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 반응 동안 생성된 연장 가닥 또는 CTO를 포함한다.
PTOCE-기반 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 연장 가닥의 형성을 수반한다. 용어 "PTOCE-기반 방법"은 PTO의 절단 및 연장을 통한 연장 가닥의 형성을 포함하는, 시그널을 제공하는 다양한 방법을 포괄하기 위해 본원에서 사용된다.
PTOCE-기반 방법에 의한 시그널 발생의 예는 하기의 단계를 포함한다: (a) 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장 가닥은 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도하며, 상기 절단은 PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 단편을 CTO와 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; (d) 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편은 연장되어 연장 가닥을 형성하고; 및 (e) 연장 가닥의 존재에 의존적으로 발생되는 시그널을 검출하여 상기 연장 가닥의 형성을 검출하는 단계. 단계 (a)에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드 대신에 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 이합체의 형성에 의해 발생된 시그널은 이합체의 혼성화(예컨대, 이합체 자체의 혼성화 또는 제3 올리고뉴클레오타이드의 혼성화)에 의해 유도된 시그널 또는 이합체의 형성으로 인한 제3 올리고뉴클레오타이드의 혼성화의 억제에 의해 유도된 시그널을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 각 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 중 적어도 하나의 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 모두는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
특히, 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화 이후 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다.
검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화 이후 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널은 TaqMan 프로브 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
시그널이 TaqMan 프로브 방법에 의해 발생되는 경우, 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트, 적합한 표지(예컨대, 상호작용적 이중 표지)를 갖는 TaqMan 프로브 및 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합 효소를 포함한다. 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TaqMan 프로브는 타겟 증폭 동안 절단되어 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다.
TaqMan 프로브 방법에 의해 시그널을 발생시키는 특정한 예는, (a) 프라이머 세트 및 적합한 표지(예컨대, 상호작용적 이중 표지)를 갖는 TaqMan 프로브를 타겟 핵산 서열과 혼성화시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물 및 5'-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소를 사용하여 타겟 핵산 서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 TaqMan 프로브는 절단되어 표지를 방출하고; 및 (c) 상기 방출된 표지로부터 시그널 발생을 검출하는 단계를 포함한다.
특히, 시그널은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 단편은 검출 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되고, 상기 단편은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 단편은 연장되어 캡처 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 검출 올리고뉴클레오타이드를 절단한다.
매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식의 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널은 인베이더 분석(미국 특허 제5,691,142호), PCEC(PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage) 방법(WO 제2012/134195호) 및 미국 특허 제7,309,573호에 기재된 방법을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다. 특히, 미국 특허 제7,309,573호에 기재된 방법은 절단에 의한 시그널 발생을 사용하는 PTOCE-기반 방법 중 하나로 여겨질 수 있고, 상기 방법에서, 연장 가닥의 형성에 의해 CTO에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드의 절단을 검출함으로써 상기 연장 가닥의 형성이 검출될 수 있다. 인베이더 분석은 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 단편을 형성하고, 단편의 연장 없이 연속적인 절단 반응을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 발생되는 경우, 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단은 시그널 변화를 유도하거나 검출될 표지된 단편을 방출시킨다.
시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해서뿐만 아니라 이합체의 형성에 의해 시그널을 발생시키는 경우, 상기 시그널-발생 수단은, 절단에 의해 시그널을 발생시키는데 사용되는 한, 절단에 의해 시그널을 제공하는 시그널 발생 수단으로서 간주될 수 있다.
검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단 시에 시그널을 발생시키지만, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출되는 시그널은 서로 상이하다. 상기 검출된 시그널의 차이(예컨대 시그널 강도의 차이)는 검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화 및/또는 표지(예컨대 염료)의 시그널 발생에 대한 온도 영향에 의한 시그널 때문일 수 있다. 이러한 차이는 TaqMan 프로브 방법을 사용한 실시예에서 다뤄진다.
흥미롭게도, 본 발명은 상이한 검출 온도 및 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 사용하여(예컨대 TaqMan 프로브 방법) 2개의 타겟 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단, 및 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단의 조합이다.
일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드가 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 이는 다양한 방식으로 표지를 가질 수 있다. 예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오타이드 중 하나의 올리고뉴클레오타이드가 적어도 하나의 표지를 가질 수 있거나, 복수의 올리고뉴클레오타이드 모두가 적어도 하나의 표지를 가질 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오타이드의 하나의 부위가 적어도 하나의 표지를 가지고 다른 부위는 표지를 갖지 않을 수 있다.
2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다. 용어 "단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는 시그널"은 이들의 동일하거나 실질적으로 동일한 시그널 특성(예컨대, 광학적 특성, 방출 파장 및 전기적 시그널)으로 인해 시그널이 단일 유형의 검출기에 의해 서로 구별되지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 2개의 타겟 핵산 서열에 대해 동일한 표지(예컨대, FAM)가 사용되고 FAM으로부터의 방출 파장을 검출하기 위해 단일 유형의 검출기가 사용되는 경우, 시그널은 구별되게 검출되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "단일 유형의 시그널"은 동일하거나 실질적으로 동일한 시그널 특성(예컨대, 광학적 특성, 방출 파장 및 전기적 시그널)을 제공하는 시그널들을 의미한다. 예를 들어, FAM 및 CAL Fluor 610은 상이한 유형의 시그널을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "단일 유형의 검출기"는 단일 유형의 시그널을 위한 검출 수단을 의미한다. 몇 개의 상이한 유형의 시그널을 위한 몇 개의 채널(예컨대, 광다이오드)을 포함하는 검출기에서, 각 채널(예컨대, 광다이오드)이 "단일 유형의 검출기"에 해당한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명에서 유용한 표지는 본 기술분야에서 알려진 다양한 표지를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 표지는 단일 표지, 상호작용 이중 표지, 인터컬레이팅 염료 및 삽입(incorporating) 표지를 포함한다.
단일 표지는, 예를 들어, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학 표지 및 금속 표지를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 단일 표지는 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 시그널(예컨대, 상이한 시그널 강도)을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 단일 표지는 형광 표지이다. 본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 바람직한 유형 및 결합 사이트는 미국 특허 제7,537,886호 및 제7,348,141호에 개시되어 있으며, 이의 교시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다. 예를 들어, 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 단일 표지는 다양한 방법에 의해 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 표지는 탄소 원자를 함유하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 프로브에 연결된다.
대타겟인 상호작용적 표지 시스템으로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서, 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이며, 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성, 예컨대 생물발광성, 화학발광성, 전기화학발광성이며, 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템은 "접촉-매개 퀀칭(on contact-mediated quenching)"에 기반한 이중 표지를 포함한다(Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 및 Johansson et al., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 상호작용적 표지 시스템은 적어도 2개의 분자(예컨대 염료) 간의 상호작용에 의해 시그널 변화를 유도하는 임의의 표지 시스템을 포함한다.
본 발명에 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 본 기술분야에 알려진 임의의 분자를 포함할 수 있다. 이들의 예는 하기와 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1(509), YOYO™-1(509), Calcein(517), FITC(518), FluorX™(519), Alexa™(520), Rhodamine 110(520), Oregon Green™ 500(522), Oregon Green™ 488(524), RiboGreen™(525), Rhodamine Green™(527), Rhodamine 123(529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™(533), TO-PRO™-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3™(570), Alexa™ 546(570), TRITC(572), Magnesium O범위™(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium O범위™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B(580), TAMRA(582), Rhodamine Red™(590), Cy3.5™(596), ROX(608), Calcium Crimson™(615), Alexa™ 594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PRO™-3(631), YOYO™-3(631), R-phycocyanin(642), C-Phycocyanin(648), TO-PRO™-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), Biosearch Blue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL Fluor Red 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 괄호 안의 숫자는 나노미터 단위의 최대 방출 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 형광 분자 및 적합한 리포터-퀀처 쌍은 하기와 같이 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996) 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
광범위한 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 퀀처 분자(예컨대 블랙 퀀처 또는 다크 퀀처)가 본 발명에서 사용될 수 있음에 유의한다.
리포터 및 퀀처 분자를 포함하는 시그널링 시스템에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 다른 파트너(수용체)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료가 리포터로서 사용되고 로다민 염료가 퀀처로서 사용된다.
상호작용적 이중 표지는 이합체 중 하나의 가닥에 연결될 수 있다. 상호작용적 이중 표지를 함유하는 가닥이 단일 가닥 상태를 유지하는 경우, 상기 가닥은 헤어핀 또는 랜덤 코일 구조를 형성하여 상호작용적 이중 표지 간의 퀀칭을 유도한다. 상기 가닥이 이합체를 형성하는 경우, 퀀칭은 줄어든다. 선택적으로, 상호작용적 이중 표지가 가닥 상에 근접하여 위치한 뉴클레오타이드에 연결되는 경우, 상호작용적 이중 표지 사이에 퀀칭이 일어난다. 상기 가닥이 이합체를 형성한 다음 절단되는 경우, 퀀칭은 줄어들게 된다.
상호작용적 이중 표지 각각은 이합체의 2개의 가닥 각각에 연결될 수 있다. 이합체의 형성은 퀀칭을 유도하고 이합체의 변성은 언퀀칭을 유도한다. 선택적으로, 2개의 가닥 중 하나가 절단되는 경우, 언퀀칭이 유도될 수 있다.
본 발명에서 유용한 예시된 인터컬레이팅 염료는 SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TO-PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 싸이아졸 오렌지를 포함한다. 인터컬레이팅 염료는 이중 가닥 핵산 분자에 특이적으로 삽입되어 시그널을 발생시킨다.
삽입 표지가 프라이머 연장 동안 표지를 삽입하여 시그널을 발생시키는 과정에 사용될 수 있다(예컨대, Plexor 방법, Sherrill C B, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-45569(2004)). 또한, 삽입 표지는 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널 발생에서 사용될 수 있다.
삽입 표지는 일반적으로 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 또한, 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "비-자연 염기"는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연 염기의 유도체를 의미하며, 이들은 수소-결합 염기쌍을 형성할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비-자연 염기"는, 예를 들어, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호, 및 제6,037,120호에 기재된 바와 같이, 모 화합물로서 자연 염기로부터 상이한 염기쌍 형성 패턴을 갖는 염기를 포함한다. 비-자연 염기 간의 염기쌍 형성은 자연 염기와 같이 2개 또는 3개의 수소 결합을 포함한다. 또한, 비-자연 염기 간의 염기쌍 형성은 특정한 방식으로 형성된다. 비-자연 염기의 특정한 예는 염기쌍 조합에서 하기의 염기를 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J, 및 M/N(미국 특허 제7,422,850호 참고).
PTOCE 방법에 의해 시그널이 발생되는 경우, 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가질 수 있고, CTO는 상기 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 검출 또는 정량을 위한 관심 있는 핵산 서열을 지칭한다. 타겟 핵산 서열은 단일 가닥뿐만 아니라 이중 가닥의 서열을 포함한다. 타겟 핵산 서열은 핵산 샘플 내에 초기에 존재하는 서열뿐만 아니라 반응에서 새롭게 생성된 서열을 포함한다.
타겟 핵산 서열은 임의의 DNA(gDNA 및 cDNA), RNA 분자, 이들의 혼성체(키메라 핵산)를 포함할 수 있다. 상기 서열은 이중 가닥 또는 단일-가닥 형태일 수 있다. 출발 물질로서 핵산이 이중 가닥인 경우, 상기 2개의 가닥을 단일 가닥 또는 부분적으로 단일 가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥을 분리하는 공지된 방법은, 가열, 알칼리, 포름아마이드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예컨대, 헬리카제 작용), 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80℃ 내지 105℃ 범위의 온도에서 가열함으로써 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)]에 의해 제공된다.
mRNA를 출발 물질로서 이용하는 경우, 어닐링 단계를 실시하기 전에 역전사 단계가 필요하며, 이의 상세한 내용은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988))]에서 확인된다. 역전사를 위해, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머, 랜덤 프라이머 또는 타겟-특이적 프라이머가 사용될 수 있다.
타겟 핵산 서열은 임의의 자연 원핵세포 핵산, 진핵세포 핵산(예를 들어, 원생동물 및 기생충, 진균류, 효모, 고등 식물, 하등 및 포유동물 및 인간을 포함하는 고등 동물), 바이러스(예를 들어, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오 바이러스 등) 핵산, 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 재조합으로 생산된 또는 생산될 수 있거나, 또는 화학적으로 합성된 또는 합성될 수 있는 임의의 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 핵산 분자는 자연에서 발견되거나 발견되지 않을 수 있다. 타겟 핵산 서열은 공지되거나 공지되지 않은 서열을 포함할 수 있다.
단계 (b): 샘플과 시그널-발생 수단의 인큐베이션 및 시그널 검출
분석할 샘플을 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 상기 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 검출한다.
일 구현예에 따르면, 상응하는 타겟 핵산 서열이 존재하는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도 모두에서 시그널을 발생시키도록 각각의 상응하는 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 각각의 시그널-발생 수단이 설계된다.
상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키며, 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널들은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 샘플의 분석을 위한 인큐베이션 조건은 제1 기준값 및 제2 기준값을 수득하기 위한 인큐베이션 조건과 동일하다.
시그널은 시그널 검출로부터의 다양한 시그널 특징, 예컨대, 시그널 강도 [예컨대, RFU(상대적 형광 단위) 값, 또는 증폭을 실시하는 경우, 특정 사이클, 선택된 사이클 또는 엔드-포인트에서의 RFU 값], 시그널 변화 모양(또는 패턴) 또는 Ct 값, 또는 상기 특징을 수학적으로 처리함으로써 수득된 값을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 기준값 또는 샘플 분석과 관련된 용어 "시그널"은 검출 온도에서 수득된 시그널 자체뿐만 아니라 상기 시그널들을 수학적으로 처리함으로써 제공된 변형된 시그널을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 실시간 PCR에 의해 증폭 곡선이 수득되는 경우, 증폭 곡선으로부터의 다양한 시그널값(또는 특징)이 타겟 존재의 결정을 위해 선택되고 사용될 수 있다(강도, Ct 값 또는 증폭 곡선 데이터).
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 존재에 사용되는 시그널은 유의한 시그널이다. 즉, 상기 시그널은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 발생되는 시그널이다. 일 구현예에 따르면, 검출된 시그널의 유의성은 역치값을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 역치값은 검출기의 백그라운드 시그널, 민감도 또는 사용된 표지를 고려하여 음성 대조군으로부터 미리 결정된 후, 시그널의 유의성이 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 핵산 증폭 없이 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
본 발명에서, 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 타겟 증폭과 동시에 증폭될 수 있다. 선택적으로, 시그널은 타겟 증폭 없이 증폭될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널 발생은 타겟 증폭과 함께 시그널 증폭을 포함하는 과정에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 증폭은 PCR(중합효소 연쇄 반응)에 따라 실시된다. PCR은 타겟 증폭을 위해 당업계에서 널리 이용되며, 이는 타겟 서열의 변성, 타겟 서열과 프라이머 간의 어닐링(혼성화) 및 프라이머 연장의 사이클을 포함한다(Mullis et al. 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354). 시그널은 상술한 시그널 발생 방법(예컨대, TaqMan 방법 및 PTOCE-기반 방법)을 PCR 과정에 적용함으로써 증폭될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 본 발명은 실시간 PCR 방법에 의해 시그널을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 증폭은 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가아제 연쇄 반응, Wiedmann M, et al., "Ligase chain reaction (LCR)- overview 및 applications." PCR Methods and Applications 1994 Feb;3(4):S51-64 참고), GLCR(갭 필링 LCR, WO 제90/01069호, EP 제439182호 및 WO 제93/00447호 참고), Q-beta(Q-베타 레플리카제 증폭, Cahill P, et al., Clin Chem., 37(9):1482-5(1991), 미국 특허 제5556751호 참고), SDA(가닥 치환 증폭, G T Walker et al., Nucleic Acids Res. 20(7):16911696(1992), EP 제497272호 참고), NASBA(핵산 서열-기반 증폭, Compton, J. Nature 350(6313):912(1991)), TMA(전사-매개 증폭, Hofmann WP et al., J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); 미국 특허 제5888779호 참고) 또는 RCA(롤링 서클 증폭, Hutchison C.A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 102:1733217336(2005) 참고)에 의해 수행된다.
상기 기재된 증폭 방법은 온도를 변화시키거나 온도를 변화시키지 않는 일련의 반응의 반복을 통해 타겟 서열을 증폭시킬 수 있다. 일련의 반응의 반복을 포함하는 증폭의 단위는 "사이클"로 표현된다. 사이클의 단위는 증폭 방법에 따라 반복 횟수 또는 시간으로서 표현될 수 있다.
예를 들어, 시그널의 검출은 증폭의 각 사이클, 선택된 몇 개의 사이클 또는 반응의 엔드-포인트에서 실시될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 적어도 2개의 사이클에서 시그널이 검출되는 경우, 각각의 사이클에서의 시그널의 검출은 모든 검출 온도 또는 일부 선택된 검출 온도에서 실시될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 검출은 홀수 사이클에서는 상대적 고온 검출 온도에서 실시되고 짝수 사이클에서는 상대적 고온 검출 온도에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인큐베이션은 시그널-발생 수단에 의한 시그널 발생뿐만 아니라 타겟 증폭이 가능한 조건에서 수행된다.
타겟 핵산 서열의 증폭은 증폭을 위한 프라이머 세트 및 핵산 중합효소를 포함하는 타겟 증폭 수단에 의해 달성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 뉴클레아제 활성(예컨대 5' 뉴클레아제 활성 또는 3' 뉴클레아제 활성)을 갖는 핵산 중합효소가 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 뉴클레아제 활성이 없는 핵산 중합효소가 사용될 수 있다.
본 발명에서 유용한 핵산 중합효소는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함하는, 다양한 박테리아 종으로부터 수득된 열안정성 DNA 중합효소이다. 특히, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 증폭은 비대칭 PCR에 의해 달성된다. 프라이머의 비율은 다운스트림 올리고뉴클레오타이드의 절단 또는 혼성화를 고려하여 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 공정에서 실시된다.
시그널이 올리고뉴클레오타이드의 절단을 포함하는 방법에 의해 발생되는 경우, 시그널은 타겟 증폭 없이 증폭될 수 있다. 예를 들어, 단계 (a) 및/또는 단계 (b)는 CPT 방법(Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148 (1990)), 인베이더 분석(미국 특허 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE-기반 방법(예컨대, PCE-SH 방법, PCE-NH 방법 및 PCEC 방법) 또는 CER 방법(WO 제2011/037306호)에 따라 타겟 서열의 증폭 없는 시그널 증폭으로 실시될 수 있다.
전술한 시그널 증폭 방법은 온도를 변화시키거나 온도를 변화시키지 않는 일련의 반응의 반복을 통해 시그널을 증폭시킬 수 있다. 일련의 반응의 반복을 포함하는 시그널 증폭의 단위는 "사이클"로서 표현된다. 사이클의 단위는 증폭 방법에 따라 반복 횟수 또는 시간으로 표현될 수 있다.
예를 들어, 시그널의 발생 및 검출은 증폭의 각 사이클, 선택된 몇 개 사이클 또는 반응의 엔드-포인트에서 실시될 수 있다.
시그널을 발생시키기 위해 샘플을 2개의 시그널-발생 수단과 인큐베이션(반응)하는 동안 또는 후에, 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기를 사용하여 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도는 시그널-발생 수단에 의해 시그널 발생을 가능하게 하는 온도 범위를 고려하여 미리 결정된다.
본 발명은 시그널-발생 수단에 의존적인 방식으로 시그널 발생을 가능하게 하는 특정 온도 범위가 존재한다는 것을 이용한다.
예를 들어, 시그널-발생 수단이 2개의 핵산 분자 간의 혼성화(또는 결합)시에는 시그널을 발생시키고, 이들 간의 비-혼성화(또는 해리)시에는 시그널을 발생하지 않는 경우, 2개의 핵산 분자 간의 혼성화를 가능하게 하는 온도에서는 시그널이 발생되지만, 2개의 핵산 분자 간에 혼성화되지 못하는 온도에서는 시그널이 발생되지 않는다. 이와 같이, 시그널 발생(즉, 시그널 검출)을 가능한 특정 온도 범위와 시그널 발생이 불가능한 다른 온도 범위가 존재한다. 상기 온도 범위는 시그널-발생 수단에서 사용되는 2개의 핵산 분자의 혼성화물의 Tm 값에 의해 영향을 받는다.
절단 후 표지를 갖는 절단된 단편을 사용하는 시그널 발생 방법이 이용되는 경우, 시그널은 이론적으로 임의의 온도(예컨대, 30-99℃)에서 검출될 수 있다.
검출 온도는 시그널 발생 수단에 의해 시그널 발생이 가능한 온도 범위로부터 선택된다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 시그널-발생 수단은 2개의 검출 온도에서 서로 상이한 시그널(예컨대 시그널 강도)을 제공하는 시그널-발생 수단일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단(예컨대 TaqMan 프로브 방법)이 이용되는 경우, 시그널-발생 수단으로부터의 시그널은 검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화 및 염료로부터의 시그널 발생이 온도에 영향을 받을 수 있다는 점에서 검출 온도에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자로 표지된 프로브는 검출 온도에 따라 상이한 시그널을 발생할 수 있으며, 프로브는 상대적 고온 검출 온도보다 상대적 저온 검출 온도에서 더 높은 시그널을 발생시킬 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 상이한 검출 온도 및 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 사용함으로써 2개의 타겟 서열을 검출할 수 있다. 본 발명의 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 모두는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이다.
검출 온도는 시그널 발생 수단에 의해 시그널 발생이 가능한 온도 범위로부터 선택된다. 용어 "검출 온도 범위"는 특히 시그널 발생(즉, 시그널 검출)이 가능한 온도 범위를 특히 기술하기 위해 본원에서 사용된다.
본 발명에 따르면, 각각의 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 온도는 시그널-발생 수단을 고려하여 할당될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 검출이 실시되는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도는 미리 결정될 수 있다. 예를 들어, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도는 각각 72℃ 및 60℃로 미리 결정된 다음, 상기 검출 온도에 적합한 시그널-발생 수단이 제작된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단이 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 검출 온도는 이합체의 Tm 값에 기초하여 선택된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단이 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 검출 온도는 이합체의 Tm 값을 조절함으로써 제어될 수 있다.
예를 들어, 시그널이 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 검출 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 럭스 프로브, 분자 비콘 프로브, 하이비콘 프로브 및 인접한 혼성화 프로브)에 의해 발생되는 경우, 시그널의 검출은 올리고뉴클레오타이드의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이뤄진다. 스콜피온 프라이머가 사용되는 경우, 시그널의 검출은 연장 가닥과 혼성화될 부위의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이뤄진다.
시그널이 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체의 의해 발생되는 경우, 시그널의 검출은 이합체의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이뤄진다. 예를 들어, 시그널이 PTOCE 방법에 의해 발생되는 경우, 시그널의 검출은 CTO 상에서 PTO 단편의 연장에 의해 형성된 연장 이합체의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이뤄진다.
PTOCE-기반의 방법은 이합체 및 상기 이합체에 의해 혼성화가 영향을 받는 제3 혼성체의 Tm 값을 쉽게 조절하는 이점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생하는 경우, 절단에 의해 방출된 표지가 시그널을 방출함에도 불구하고, 검출 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 서열의 혼성화가 시그널 발생을 유도하기 때문에, 검출 올리고뉴클레오타이드의 Tm 값에 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용된 검출기는 시그널을 검출할 수 있는 임의의 수단을 포함한다. 예를 들어, 형광 시그널이 사용되는 경우, 형광 시그널의 검출에 적합한 광다이오드가 검출기로 이용될 수 있다. 단일 유형의 검출기를 사용한 검출은 단일 유형의 시그널을 검출할 수 있는 검출기를 사용하여 또는 몇 개의 채널(즉, 광다이오드)을 갖는 검출기의 각각의 채널(즉, 광다이오드)을 사용하여 검출이 실시되는 것을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 시그널의 발생은 표지로부터의 "시그널 발생 또는 소멸" 및 "시그널 증가 또는 감소"를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 생물학적 샘플(예컨대, 생물학적 공급원으로부터의 세포, 조직, 및 유체) 및 비-생물학적 샘플(예컨대, 식품, 물 및 토양)을 포함한다. 생물학적 샘플은 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 객담, 스왑, 흡인물, 기관지 폐포 세척액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 타액, 정액, 뇌 추출물, 척수액(SCF), 충수, 비장 및 편도 조직 추출물, 양수 및 복수를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 샘플은 생물학적 공급원으로부터 단리된 자연 핵산 분자 및 합성 핵산 분자를 포함할 수 있다.
단계 (a)를 실시하기 전에 단계 (b)를 실시할 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 그러한 변화 및 변형은 첨부된 청구범위 및 이의 균등범위에 의해 결정되는 본 발명의 범위에 속한다.
단계 (c): 기준값 및 시그널에 의한 타겟 핵산 서열의 존재의 결정
마지막으로, 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 기준값 중 적어도 하나 및 단계 (b)에서 검출된 시그널에 의해 결정한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 2개의 기준값(즉, 제1 기준값 및 제2 기준값)에 의해 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는데 사용된다.
타겟 핵산 서열의 존재의 결정과 관련하여 본원에 사용된 용어 "기준값 및 시그널에 의해"는, 단계 (a)에서 제공되는 기준값 및 시그널-발생 수단으로부터 발생된 시그널을 직접 또는 간접적으로 사용하거나 변형시키거나 수학적으로 처리함으로써(기준값 및 시그널의 수치 또는 이들의 변형을 사용하는 것, 기준값의 범위를 사용하는 것, 기준값 및 시그널을 플로팅하는 것, 및 시그널의 존재/부재를 사용하는 것 포함) 타겟 핵산 서열의 존재가 결정되는 것을 의미한다. 용어 "기준값 및 시그널에 의해" 및 "기준값 및 시그널을 사용하여" 간에는 어떤 의도된 차이도 없으며, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 것이다.
2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재는 단계 (a)에서 제공된 2개의 기준값 중 적어도 하나 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 사용하여 결정될 수 있으며, 이로써 보다 정확한 결정이 하기와 같이 이뤄진다:
일 구현예에 따르면, 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열의 존재는 제2 기준값 및 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 단계 (b)에서 검출된 시그널에 의해 결정되며, 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열의 존재는 제1 기준값 및 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 단계 (b)에서 검출된 시그널에 의해 결정된다.
일 구현예에 따르면, 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열의 존재는 제2 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 이용하여 계산된 차이에 의해 결정되며, 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열의 존재는 제1 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 이용하여 계산된 차이에 의해 계산된다.
더욱 특히, 제1 타겟 핵산 서열의 존재의 결정은 제2 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 처리하여 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 제거하고 제1 시그널 발생 수단에 의한 시그널의 발생을 결정하는 것을 포함하며; 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정은 제1 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 처리하여 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 제거하고 제2 시그널 발생 수단에 의한 시그널의 발생을 결정하는 것을 포함한다.
더욱더 특히, 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 단계 (b)에서 검출된 시그널로부터 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 수학적으로 제거하는 것이며, 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 단계 (b)에서 검출된 시그널로부터 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 수학적으로 제거하는 것이다.
더욱더 특히, 제2 시그널 발생 수단에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제2 기준값 및 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되며, 이에 의해 제1 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하며, 이는 제1 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부재를 입증한다.
예를 들어, 제2 기준값이 2개의 검출 온도에서 제2 시그널-발생 수단에 의해 제공된 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득되는 경우, 제1 시그널 발생 수단에 의한 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널의 발생은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에서 값을 빼냄으로써 결정될 수 있고; 상기 값은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 제2 기준값을 곱하거나 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 제2 기준값으로 나눔으로써 수득된다.
일 구현예에 따르면, 검출 온도에서 검출된 시그널을 기준값에 의해 "곱하거나" 또는 "나누는" 것은 상기 비율을 계산하는 방법에 따라 달라진다.
더욱더 특히, 제2 시그널 발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제2 기준값 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되며, 이에 의해 제1 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하며, 이는 제1 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부재를 입증한다.
예를 들어, 제2 기준값이 2개의 검출 온도에서 제2 시그널-발생 수단에 의해 제공된 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득되는 경우, 제1 시그널 발생 수단에 의한 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 발생은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 값을 빼냄으로써 결정될 수 있고; 상기 값은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 제2 기준값을 곱하거나 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 제2 기준값으로 나눔으로써 수득된다.
더욱더 특히, 제1 시그널 발생 수단에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제1 기준값 및 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되며, 이에 의해 제2 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정한다.
예를 들어, 제1 기준값이 2개의 검출 온도에서 제1 시그널-발생 수단에 의해 제공되는 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득되는 경우, 제2 시그널 발생 수단에 의한 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널의 발생은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 값을 빼냄으로써 결정될 수 있고; 상기 값은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 제1 기준값을 곱하거나 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 제1 기준값으로 나눔으로써 수득된다.
더욱더 특히, 제1 시그널 발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제1 기준값 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되며, 이에 의해 제2 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정한다.
예를 들어, 제1 기준값이 2개의 검출 온도에서 제1 시그널-발생 수단에 의해 제공된 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득되는 경우, 제2 시그널 발생 수단에 의한 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 발생은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 값을 빼냄으로써 결정될 수 있고; 상기 값은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 제1 기준값을 곱하거나 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 제1 기준값으로 나눔으로써 수득된다.
본 발명의 기본이 되는 실시 원리가 하기와 같이 실시예 1을 참조하여 설명될 것이다:
실시예 1에서, 제1 타겟 핵산 서열(NG) 및 제1 시그널-발생 수단을 인큐베이션한 다음, 상대적 저온 검출 온도(L) 및 상대적 고온 검출 온도(H)에서 시그널을 측정한다. 제1 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 저온 검출 온도에서의 검출된 시그널(FTL) 대 제1 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 고온 검출 온도에서의 검출된 시그널(FTH)의 비율을 계산하고, 이를 결국 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값(NG의 RV = RVF = (FTL) ÷ (FTH) = 1.8)으로서 사용한다.
제2 타겟 핵산 서열(CT) 및 제2 시그널-발생 수단을 인큐베이션한 다음, 상대적 저온 검출 온도(L) 및 상대적 고온 검출 온도(H)에서 시그널을 측정한다. 제2 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 저온 검출 온도의 검출된 시그널(STL) 대 제2 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 고온 검출 온도에서의 검출된 시그널(STH)의 비율을 계산하고, 이는 결국 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값(CT의 RV = RVS = (STL ) ÷ (STH) = 5.8)으로서 사용한다.
샘플을 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 인큐베이션하는 경우, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출되는 형광 시그널은 각각 FH 및 FL로 표시된다.
실시예 1에서와 같이, 타겟 핵산 서열에 대한 기준값이 비율에 의해 제공되는 경우, 제1 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해 하기 식이 제공될 수 있다(도 1C 및 (ii) 참고): FL - [FH x RVS].
샘플 내의 FH는 상대적 고온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열로부터의 시그널(FTH) 및 제2 타겟 핵산 서열로부터의 시그널(STH)의 합으로서 표현될 수 있고, 샘플 내의 FL은 상대적 저온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열로부터의 시그널(FTL) 및 제2 타겟 핵산 서열로부터의 시그널(STL)의 합으로서 표현될 수 있다: FH = FTH + STH 및 FL = FTL + STL.
FL - [FH x RVS]는 하기와 같이 표현될 수 있다:
FL - [FH x RVS] = (FTL + STL) - [(FTH + STH) x RVS]
= FTL - RVS x FTH + STL - RVS x STH
= FTL - 5.8 x FTH + STL - 5.8 x STH.
샘플이 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 경우, (STL - 5.8 x STH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있는데, RVS = STL / STH = 5.8이기 때문이다.
제2 타겟 핵산 서열이 샘플에 존재하지 않는 경우에도, (STL - 5.8 x STH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있는데, STL 및 STH가 실질적으로 0의 값이기 때문이다.
샘플이 제1 타겟 핵산 서열을 포함하는 경우, (FTL - 5.8 x FTH)는 음의 값을 나타낼 것인데, (FTL - 5.8 x FTH)에서 5.8의 기준값이 사용되는 반면 제1 타겟 핵산의 제1 기준값은 1.8이기 때문이다.
따라서, (FTL - 5.8 x FTH)가 음의 값을 나타내는 경우, 샘플은 제1 타겟 핵산 서열을 포함하는 것으로 결정된다(도 1C 참고).
제1 타겟 핵산 서열이 샘플 내에 존재하지 않는 경우, (FTL - 5.8 x FTH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있다(도 1C 참고).
선택적으로, 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해, 즉 제2 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해, 하기 식이 또한 제공될 수 있다(도 1D 및 (ii) 참고): FL - [FH x RVF].
FL - [FH x RVF]는 하기와 같이 표현될 수 있다:
FL - [FH x RVF] = (FTL + STL) - [(FTH + STH) x RVF]
= FTL - RVF x FTH + STL - RVF x STH
= FTL - 1.8 x FTH + STL - 1.8 x STH.
샘플이 제1 타겟 핵산 서열을 포함하는 경우, FTL - 1.8 x FTH는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있는데, RVF = FTL / FTH = 1.8이기 때문이다.
제1 타겟 핵산 서열이 샘플 내에 존재하지 않는 경우에도, (FTL - 1.8 x FTH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있는데, FTL 및 FTH가 실질적으로 0의 값이기 때문이다.
샘플이 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 경우, (STL - 1.8 x STH)는 양의 값을 나타낼 것인데, (STL - 1.8 x STH)에서 1.8의 기준값이 사용된 반면, 제2 타겟 핵산에 대한 제2 기준값은 5.8이기 때문이다.
따라서, (STL - 1.8 x STH)이 양의 값을 나타내는 경우, 샘플은 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 것으로 결정된다(도 1D 참고).
제2 타겟 핵산 서열이 샘플 내에 존재하지 않는 경우, (STL - 1.8 x STH)는 실질적으로 0의 값을 나타낼 수 있다(도 1D 참고).
전술한 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 분석함으로써 타겟 핵산 서열을 검출하는 원리를 고려할 때, 타겟 핵산 서열의 검출은 하기와 같이 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널을 분석함으로써 달성될 수 있다:
예를 들어, 제1 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해 하기 식이 제공된다(도 1C 및 (i) 참고): FH - [FL ÷ RVS].
선택적으로, 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해, 즉 제2 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부를 결정하기 위해, 하기 식이 또한 제공될 수 있다(도 1D 및 (i) 참고): FH - [FL ÷ RVF].
전술한 구현예를 고려할 때, 당업자는 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 고온 검출 온도에서의 검출된 시그널(FTH) 대 시그널-발생 수단에 의해 제공된 상대적 저온 검출 온도에서의 검출된 시그널(FTL)의 비율을 계산하고 이를 기준값(즉, RV = (FTH) ÷ (FTL))으로서 사용하여, 본 발명의 방법에 따라 핵산 서열의 존재 또는 부재를 결정한다는 것을 이해할 것이다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 전술한 식에 의한 계산 결과의 유의성을 결정하기 위해 역치값을 추가로 사용한다. 선택된 식에 따라, 상이한 역치값이 적용될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 역치값은 기준값을 상호 보완하기 위해 선택될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널이 PCR에 의한 타겟 증폭과 관련하여 실시간 방식으로 발생되는 경우, 각 증폭 사이클 또는 일부 선택된 사이클에서의 시그널이 기준값을 이용하여 처리되고, 계산 결과가 사이클에 대해 플롯팅되어 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에 사용된다.
일 구현예에 따르면, 하나의 반응 용기는 2개의 타겟 핵산 서열 이외의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 추가적인 2개의 시그널-발생 수단을 각각 함유하는 적어도 하나의 추가적인 세트를 추가로 포함하고; 용기 내의 2개의 시그널-발생 수단 중 각 세트에 의해 발생된 시그널은 서로 구별되며, 상기 시그널은 각각 상이한 유형의 검출기에 의해 검출된다. 예를 들어, 단계 (b)에서 2개의 시그널-발생 수단이 FAM으로 표지되고 추가적인 2개의 시그널-발생 수단이 Quasar 570으로 표지되는 경우, 상기 용기에서 FAM-표지된 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널은 Quasar 570-표지된 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널과 구별되므로, 2개의 상이한 방출 광을 검출하기 위해 2개의 유형의 검출기가 필요하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 2개의 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하고, 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 한 가지 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함하며, 다른 하나는 다른 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 서열이 유사한 연속적인 DNA 세그먼트 중 특정 위치의 DNA 서열에서의 임의의 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적인 DNA 세그먼트는 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 임의의 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이 또는 다형성 대립유전자 변이일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출된 뉴클레오타이드 변이는 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성), 돌연변이, 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 예시된 뉴클레오타이드 변이는 인간 지놈 내의 다양한 변이(예컨대, MTHFR(메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원효소) 유전자에서의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 종양형성 유발 변이를 포함한다. 본원에 사용된 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산 서열의 특정 위치에서의 임의의 변이를 포함한다. 즉, 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산 서열의 특정 위치에서의 야생형 및 그의 임의의 돌연변이형을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체는 제1 시그널-발생 수단을 사용하여 검출되고, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체는 제2 시그널-발생 수단을 사용하여 검출되며, 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체는 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단을 사용하여 검출된다.
본 발명의 기초가 되는 실시 원리하에, 본 발명의 방법은 3개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 검출에 적용될 수 있다.
예를 들어, 3개의 타겟 핵산 서열은 제1 타겟 핵산 서열, 제2 타겟 핵산 서열 및 제3 타겟 핵산 서열을 포함한다. 이들 중, 제1 타겟 핵산 서열은 하기와 같이 검출될 수 있다:
제2 타겟 핵산 서열 및 제3 타겟 핵산 서열이 종합적으로 단일 타겟으로서 고려되는 경우, 제2 타겟 핵산 서열 및 제3 타겟 핵산 서열을 제2 시그널-발생 수단 및 제3 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션함으로써 상기 단일 타겟에 대한 종합적 기준값을 수득할 수 있다. 선택적으로, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값 또는 제3 타겟 핵산 서열에 대한 제3 기준값 중 하나가 종합적 기준값으로서 이용될 수 있다.
그리고 나서, 상기 종합적 기준값 및 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 제1 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
또한, 제2 타겟 핵산 서열 및 제3 타겟 핵산 서열 각각의 존재 또는 부재는 제1 타겟 핵산 서열에 대한 검출 접근법에 따라 결정될 수 있다.
II. 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형 분석
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 방법이 제공된다:
(a) (i) 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값; (ii) 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값; 및 (iii) 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값을 제공하는 단계로서; 상기 3개의 기준값은 서로 상이하며;
(b) 상기 SNP 대립유전자를 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 샘플을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널들은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(c) 상기 기준값 및 상기 단계 (b)에서 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
본 발명은 원칙적으로 전술한 본 발명의 제1 양태를 따르므로, 이들 사이의 공통된 설명은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다. 본 양태를 설명하기 위해 제1 양태에 대한 설명을 언급하는 경우, 본 양태는 제1 양태와 일부 상이하다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 당업자는 제1 양태에 대한 일부 설명이 본 양태에 대한 설명에 직접적으로 적용될 수 있고, 변형된 다른 설명이 본 양태에 대한 설명에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
단계 (a): 기준값의 제공
제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값 및 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값을 제공한다.
본 발명은 3개의 유전자형에 대한 기준값을 이용하는 특징을 갖는다.
각각의 기준값은 상응하는 SNP 유형 및 시그널-발생 수단을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출한 다음, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 얻음으로써 수득될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단은 3개의 기준값이 서로 상이하도록 설계된다.
일 구현예에 따르면, (i) 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값은 (i-1) 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체를 제1 SNP 대립유전자의 검출을 위한 제1 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하는 단계, (i-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출하는 단계, 및 (i-3) 이후 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 수득하는 단계에 의해 수득되며, (ii) 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값은 (ii-1) 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체를 제2 SNP 대립유전자의 검출을 위한 제2 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하는 단계, (ii-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출하는 단계, 및 (ii-3) 이후 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 수득하는 단계에 의해 수득되며; 및 (iii) 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값은 (iii-1) 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체를 제1 SNP 대립유전자의 검출을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 SNP 대립유전자의 검출을 위한 제2 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하는 단계, (iii-2) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 검출하는 단계, 및 (iii-3) 이후 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 수득하는 단계에 의해 수득된다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단은 제1 SNP 대립유전자에 대한 기준값이 제2 SNP 대립유전자에 대한 기준값과 상이하도록 설계된다.
SNP 사이트를 함유하는 핵산 서열은 인간의 염색체 쌍을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값 수득시 검출된 시그널 간의 차이는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 기준값 수득시 검출된 시그널 간의 차이는 시그널 간의 비율이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값 수득시 검출된 시그널 간의 차이는 특정 범위를 가지며, 상기 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값으로 또는 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값을 참조하여 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 반응 완료시에 포화 시그널을 제공하기에 충분한 반응 조건 하에서 수득될 수 있다. 예를 들어, 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자 모두로 구성된 이형접합체에 대한 기준값을 수득하기 위해, 각각의 SNP 대립유전자의 함량과 같은 반응 조건은 반응 완료시에 각각의 SNP 대립유전자에 대한 포화 시그널이 제공되도록 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값 계산시 수득된 시그널 간의 차이는 특정 범위를 가지며, 상기 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값으로 또는 상기 특정 범위의 최대값 또는 최소값을 참조하여 선택될 수 있다.
단계 (b): 샘플과 시그널-발생 수단 및 시그널 검출과의 인큐베이션
SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 사이트를 함유하는 핵산 서열을 포함하는 샘플을 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하기 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하고, 상기 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출한다. 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고, 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널들은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 수행된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 수행된다.
단계 (c): SNP 유전자형의 결정
마지막으로, 기준값 및 단계 (b)에서 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정한다.
본 발명은 샘플 내에 어떤 SNP 대립유전자가 존재하는지 결정하지 않고 단지 상응하는 SNP 유전자형의 기준값 및 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 분석할 수 있다.
개별적인 SNP 대립유전자의 존재를 결정하는 것이 필요하지 않은 이유는 3개의 SNP 유전자형이 있고, SNP에 대한 이형접합체가 야생형 대립유전자 및 돌연변이 대립유전자를 1:1의 비율로 포함한다는 점이다. 또한, 상기 이유는 샘플 인큐베이션에서 핵산 분자의 양이 쉽게 조절될 수 있다는 점이다.
일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 검출된 시그널 간의 차이는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 수득되는 차이를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 검출된 시그널 간의 차이는 상기 시그널 간의 비율을 계산함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 SNP 대립유전자를 함유하는 동형접합체 샘플은 특정 범위 내의 차이(예컨대 비율)을 나타내고, 이형접합체 샘플은 또 다른 범위 내의 차이(예컨대 비율)를 나타내며, 제2 SNP 대립유전자를 함유하는 동형접합체 샘플은 다른 특정 범위 내의 차이(예컨대 비율)를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, SNP 유전자형은 시그널 간의 차이를 기준값과 비교함으로써 결정된다. 예를 들어, 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값이 1.0이고, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값이 5.2이며, 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값이 3.2이고, 단계 (b)에서 시그널 간의 차이가 실질적으로 1.0인 경우, 샘플은 제1 SNP 대립유전자의 동형접합체인 것으로 결정된다.
일 구현예에 따르면, 각 유전자형에 대한 기준값의 범위를 고려하여 2개의 컷오프 값이 확립되고 유전자형 분석에 사용될 수 있다.
IV. 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 키트
본 발명의 추가의 양태에서, 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트가 제공된다:
(a) 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단; 및
(b) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열의 검출이라는 제목의 양태 I의 본 발명의 방법을 기재하는 설명서.
본 발명의 추가의 양태에서, 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트가 제공된다:
(a) 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단; 및
(b) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 검출이라는 제목의 양태 II의 본 발명의 방법을 기재하는 설명서.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 키트가 제공된다:
(a) 제1 SNP 대립유전자를 위한 시그널-발생 수단;
(b) 제2 SNP 대립유전자를 위한 시그널-발생 수단; 및
(c) 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 샘플 내 핵산 서열의 SNP 유전자형 분석이라는 제목의 양태 III의 본 발명의 방법을 기재하는 설명서.
본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 실시하기 위해 제조되므로, 이들 사이의 공통된 설명은 본 발명의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
전술한 본 발명의 모든 키트는 버퍼, DNA 중합효소 보조인자, 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군을 실시하는데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은 본 개시사항의 이점을 알고 있는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 키트의 구성성분은 개별 용기 내에 존재할 수 있거나, 복수의 구성요소가 하나의 용기 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 방법을 기술하거나 실시하기 위한 설명서는 적합한 기록 매체에 기록될 수 있다. 예를 들어, 설명서는 종이 및 플라스틱과 같은, 기판 상에 인쇄될 수 있다. 다른 구현예에서, 설명서는 CD-ROM 및 디스켓과 같은 적합한 컴퓨터 해독가능한 저장 매체 상에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키트 내에 실질적인 설명서가 포함되지 않을 수 있지만, 원격 소스로부터, 예컨대 인터넷을 통해, 설명서를 얻는 수단이 제공된다. 상기 구현예의 한 가지 예는 설명서를 볼 수 있고/거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다.
V. 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 저장 매체 및 장치
하기 기재된 본 발명의 저장 매체, 장치 및 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터에서 본 발명의 방법을 실시하기 위한 것이므로, 이들 사이의 공통된 설명은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체가 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 타겟 핵산 서열을 위한 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널, 및 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및/또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값에 의해 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 상기 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며; 상기 제1 기준값은 상기 제2 기준값과 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값 및/또는 제2 기준값은 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 본 방법을 실행시 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 타겟 핵산 서열을 위한 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널, 및 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및/또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값에 의해 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 상기 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며; 상기 제1 기준값은 상기 제2 기준값과 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 본 방법을 실행시 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값 및/또는 제2 기준값을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
상기 프로세서에 의해 실행되는 경우, 상기 프로그램 지시가 작동되어, 프로세서가 상술한 본 발명의 방법을 실행하게 한다. 프로그램 지시는 제1 시그널 및 제2 시그널을 수신하는 지시를 포함할 수 있고, 상기 수신된 시그널을 이용하여 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 지시를 포함할 수 있다.
전술한 본 발명의 방법은, 프로세서, 예컨대, 독립형 컴퓨터(stand-alone computer), 네트워크에 연결된 컴퓨터(network attached computer) 또는 실시간 PCR 기기와 같은 데이터 수집 장치(data acquisition device)에 있는 프로세서에서 실행된다.
컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 CD-R, CD-ROM, DVD, 플래쉬 메모리, 플로피 디스크, 하드 드라이브, 포터블 HDD, USB, 마그네틱 테이프, MINIDISC, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 광학 디스크, 광학 기록매체, RAM, ROM, 시스템 메모리 및 웹 서버와 같은 다양한 저장 매체를 포함한다.
시그널과 관련된 데이터(예컨대, 강도, 증폭 사이클 수 및 검출 온도)는 몇 가지 기기를 통해 수신될 수 있다. 예를 들어, 데이터는 PCR 데이터 수집 장치에 있는 프로세서에 의해 수집될 수 있다. 데이터는 데이터가 수집되고 있는 동안 실시간으로 제공될 수 있거나, 또는 메모리 유닛이나 버퍼에 저장될 수 있으며, 실험 완료 후 프로세서에 제공될 수 있다. 유사하게, 상기 데이터 세트는 상기 수집 장치와의 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷 및 인트라넷) 또는 직접 연결(예컨대, USB 또는 다른 직접 유선 연결 또는 무선 연결)에 의해 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 별도의 시스템에 제공될 수 있고, 또는 CD, DVD, 플로피 디스크, 포터블 HDD 등과 같은 휴대용 매체 상에서 독립형 컴퓨터 시스템에 제공될 수 있다. 유사하게, 상기 데이터 세트는 노트북 또는 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 클라이언트에 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷, 인트라넷 및 무선 통신 네트워크)을 통하여 서버 시스템에 제공될 수 있다. 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되는 경우, 데이터가 수신되거나 수집된 후에, 상기 데이터 분석 과정은 타겟 핵산 서열의 존재 결정을 위한 시그널 간의 차이로부터 얻은 처리된 시그널을 제공한다. 프로세서는 시그널과 관련된 수신된 데이터를 처리하여 2개의 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 반영하는 처리된 시그널을 제공한다. 예를 들어, 프로세서는 수신된 데이터를 처리하여 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율을 수득한다.
본 발명을 실행하는 프로세서를 구현하는 지시들은 로직 시스템에 포함될 수 있다. 상기 지시는 비록 휴대용 HDD, USB, 플로피 디스크, CD 및 DVD와 같은 어떠한 소프트웨어 저장 매체 상으로 제공될 수 있지만, 다운로드되어 메모리 모듈(예컨대, 하드 드라이브 또는 로컬 또는 부착 RAM이나 ROM과 같은 다른 메모리)에 저장될 수 있다. 본 발명을 실행하기 위한 컴퓨터 코드는, C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl 및 XML과 같은 다양한 코딩 언어로 실행될 수 있다. 또한, 다양한 언어 및 프로토콜은 본 발명에 따른 데이터와 명령의 외부 및 내부 저장과 전송에 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 전술한 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 시료 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 장치가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 장치는 시료 및 시그널-발생 수단을 수용할 수 있는 반응 용기, 상기 반응 용기의 온도를 조절하는 온도 조절 수단 및/또는 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널을 검출하기 위한 단일 유형의 검출기를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로세서는 단일 유형의 검출기가 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 할 뿐만 아니라 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 계산할 수 있게 한다. 상기 프로세서는 하나의 프로세서가 두 가지 행위를 하는 방식으로 제작될 수 있다: 2개의 검출 온도에서의 검출 및 차이 계산의 명령. 선택적으로, 프로세서 유닛은 2개의 프로세서가 두 가지 행위를 각각 하는 방식으로 제작될 수 있다.
상기 장치의 첫 번째 필수적인 특징은 상기 장치가 상기 2개의 검출 온도에서 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 하는 프로세서를 가지고 있다는 것이다. 일 구현예에 따르면, 시그널이 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 발생되는 경우, 상기 장치는 매 증폭 사이클마다 상기 2개의 검출 온도에서 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 하는 프로세서를 포함한다.
상기 장치의 두 번째 필수적인 특징은 상기 장치가 상기 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널을 처리하여 상기 시그널 간의 차이를 얻는 프로세서를 가지고 있다는 것이다. 일 구현예에 따르면, 상기 시그널 간의 차이는 수학적인 처리에 의해 수치로서 표현된다.
일 구현예에 따르면, 상기 프로세서는 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 종래의 장치(예컨대, 실시간 PCR 장치)에 소프트웨어가 설치되어 구현될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 장치는 최소 2개의 검출 온도에서 시그널을 검출할 수 있게 하며, 최소 2개의 검출 결과를 수학적으로 처리할 수 있게 하는 프로세서를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체가 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 SNP 대립 유전자를 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널 간의 차이, 및 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값 및 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며, 제3 기준값은 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고; 상기 3개의 기준값은 서로 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값은 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 본 방법을 실행시 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 저장 매체는 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 SNP 대립 유전자를 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널 간의 차이, 및 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값 및 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며, 제3 기준값은 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고; 상기 3개의 기준값은 서로 상이하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 방법을 실행시 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값 및/또는 제2 기준값 및/또는 제3 기준값을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가로 포함한다.
본 발명의 추가 양태에서, (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 전술한 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 포함하는, 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하기 위한 장치가 제공된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 상이한 검출 온도를 이용하는 본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지만으로도 종래의 실시간 방식으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 종래의 기술은 타겟 증폭 후 멜팅 분석에 의해 복수의 타겟 핵산 서열을 검출한다. 이와 달리, 본 발명은 타겟 증폭 후 멜팅 분석이 필요하지 않으므로, 분석 시간이 획기적으로 단축된다.
(b) 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 2개의 검출 온도에서 발생되는 경우에도, 본 발명은 각각의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 이러한 이점은 각각의 타겟 핵산 서열에 대하여 절단에 의해 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 사용할 수 있게 해준다.
(c) 상이한 검출 온도를 사용하는 본 발명에서, 각각의 타겟 핵산 서열에 대하여, 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성되는 이합체에 의해 시그널을 제공하는 시그널-발생 수단의 사용(예컨대, PTOCE-기반 방법)은 예기치 않은 결과를 유도할 수 있다. 첫째로, PTOCE-기반 방법과 같이 매개 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법은 형성된 이합체의 Tm 값을 용이하게 조절하여 검출 온도를 간편하게 선택할 수 있게 해준다. 상기 특징에 의해, 원하는 기준값(또는 기준값의 차이)을 갖도록 더 간편하게 조절가능하게 된다. 나아가, PTOCE-기반 방법과 같이 매개 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법에서, 특정 Tm 값을 갖는 이합체가 형성될 수 있는데, 상기 이합체가 타겟 핵산 서열과 무관한 서열을 가지기 때문이다. 이와 달리, 타겟 핵산 서열과 직접 혼성화되는 프로브를 사용하는 방법에서, 형성된 이합체 중 적어도 하나의 가닥이 타겟 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하기 때문에, 타겟 핵산 서열 상에 변이가 존재하는 경우에 의도하지 않은 Tm 값을 갖는 이합체가 형성될 수 있다.
(a) 상이한 검출 온도를 이용하는 본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지만으로도 종래의 실시간 방식으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 종래의 기술은 타겟 증폭 후 멜팅 분석에 의해 복수의 타겟 핵산 서열을 검출한다. 이와 달리, 본 발명은 타겟 증폭 후 멜팅 분석이 필요하지 않으므로, 분석 시간이 획기적으로 단축된다.
(b) 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 2개의 검출 온도에서 발생되는 경우에도, 본 발명은 각각의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 이러한 이점은 각각의 타겟 핵산 서열에 대하여 절단에 의해 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 사용할 수 있게 해준다.
(c) 상이한 검출 온도를 사용하는 본 발명에서, 각각의 타겟 핵산 서열에 대하여, 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성되는 이합체에 의해 시그널을 제공하는 시그널-발생 수단의 사용(예컨대, PTOCE-기반 방법)은 예기치 않은 결과를 유도할 수 있다. 첫째로, PTOCE-기반 방법과 같이 매개 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법은 형성된 이합체의 Tm 값을 용이하게 조절하여 검출 온도를 간편하게 선택할 수 있게 해준다. 상기 특징에 의해, 원하는 기준값(또는 기준값의 차이)을 갖도록 더 간편하게 조절가능하게 된다. 나아가, PTOCE-기반 방법과 같이 매개 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법에서, 특정 Tm 값을 갖는 이합체가 형성될 수 있는데, 상기 이합체가 타겟 핵산 서열과 무관한 서열을 가지기 때문이다. 이와 달리, 타겟 핵산 서열과 직접 혼성화되는 프로브를 사용하는 방법에서, 형성된 이합체 중 적어도 하나의 가닥이 타겟 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하기 때문에, 타겟 핵산 서열 상에 변이가 존재하는 경우에 의도하지 않은 Tm 값을 갖는 이합체가 형성될 수 있다.
도 1A는 상대적 고온 검출 온도(72℃) 및 상대적 저온 검출 온도(60℃)에서 타겟 핵산 서열(클라미디아 트라코마티스의 지놈 DNA, CT), 타겟 핵산 서열(나이세리아 고노로애의 지놈 DNA, NG) 및 이들의 조합의 검출 결과를 나타낸다. CT 및 NG에 대한 시그널은 TaqMan 프로브 방법에 의해 발생되었다.
도 1B는 도 1A의 검출 결과에 기초하여 기준값을 수득하는 것을 나타낸다. 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율이 기준값으로 사용되었다.
도 1C는 도 1B에서 수득된 CT의 기준값 및 도 1A에서 검출된 시그널을 사용하여 타겟 핵산 서열(나이세리아 고노로애의 지놈 DNA, NG)의 존재를 결정하는 것을 도식적으로 나타낸다. 점선은 역치값을 나타낸다.
도 1D는 도 1B에서 수득된 NG의 기준값 및 도 1A에서 검출된 시그널을 사용하여 타겟 핵산 서열(클라미디아 트라코마티스의 지놈 DNA, CT)의 존재를 결정하는 것을 도식적으로 나타낸다. 점선은 역치값을 나타낸다.
도 2A는 상대적 고온 검출 온도(67.8℃) 및 상대적 저온 검출 온도(60℃)에서 타겟 핵산 서열(클라미디아 트라코마티스의 지놈 DNA, CT), 타겟 핵산 서열(나이세리아 고노로애의 지놈 DNA, NG) 및 이들의 조합의 검출 결과를 나타낸다. CT 및 NG에 대한 시그널은 PTOCE 방법에 의해 발생되었다.
도 2B는 도 2A의 검출 결과에 기초하여 기준값을 수득하는 것을 나타낸다. 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율이 기준값으로 사용되었다.
도 2C는 도 2B에서 수득된 CT의 기준값 및 도 2A에서 검출된 시그널을 사용하여 타겟 핵산 서열(나이세리아 고노로애의 지놈 DNA, NG)의 존재를 결정하는 것을 도식적으로 나타낸다. 점선은 역치값을 나타낸다.
도 2D는 도 2B에서 수득된 NG의 기준값 및 도 2A에서 검출된 시그널을 사용하여 타겟 핵산 서열(클라미디아 트라코마티스의 지놈 DNA, CT)의 존재를 결정하는 것을 도식적으로 나타낸다. 점선은 역치값을 나타낸다.
도 3A는 상대적 고온 검출 온도(64℃) 및 상대적 저온 검출 온도(60℃)에서 각각의 SNP 유전자형(야생형 동형접합체, 돌연변이 동형접합체 및 이형접합체)의 검출 결과를 나타낸다. 시그널은 PTOCE 방법에 의해 발생되었다.
도 3B는 도 3A의 검출 결과에 기초하여 기준값을 수득하는 것을 나타낸다. 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율이 기준값으로 사용되었다.
도 1B는 도 1A의 검출 결과에 기초하여 기준값을 수득하는 것을 나타낸다. 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율이 기준값으로 사용되었다.
도 1C는 도 1B에서 수득된 CT의 기준값 및 도 1A에서 검출된 시그널을 사용하여 타겟 핵산 서열(나이세리아 고노로애의 지놈 DNA, NG)의 존재를 결정하는 것을 도식적으로 나타낸다. 점선은 역치값을 나타낸다.
도 1D는 도 1B에서 수득된 NG의 기준값 및 도 1A에서 검출된 시그널을 사용하여 타겟 핵산 서열(클라미디아 트라코마티스의 지놈 DNA, CT)의 존재를 결정하는 것을 도식적으로 나타낸다. 점선은 역치값을 나타낸다.
도 2A는 상대적 고온 검출 온도(67.8℃) 및 상대적 저온 검출 온도(60℃)에서 타겟 핵산 서열(클라미디아 트라코마티스의 지놈 DNA, CT), 타겟 핵산 서열(나이세리아 고노로애의 지놈 DNA, NG) 및 이들의 조합의 검출 결과를 나타낸다. CT 및 NG에 대한 시그널은 PTOCE 방법에 의해 발생되었다.
도 2B는 도 2A의 검출 결과에 기초하여 기준값을 수득하는 것을 나타낸다. 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율이 기준값으로 사용되었다.
도 2C는 도 2B에서 수득된 CT의 기준값 및 도 2A에서 검출된 시그널을 사용하여 타겟 핵산 서열(나이세리아 고노로애의 지놈 DNA, NG)의 존재를 결정하는 것을 도식적으로 나타낸다. 점선은 역치값을 나타낸다.
도 2D는 도 2B에서 수득된 NG의 기준값 및 도 2A에서 검출된 시그널을 사용하여 타겟 핵산 서열(클라미디아 트라코마티스의 지놈 DNA, CT)의 존재를 결정하는 것을 도식적으로 나타낸다. 점선은 역치값을 나타낸다.
도 3A는 상대적 고온 검출 온도(64℃) 및 상대적 저온 검출 온도(60℃)에서 각각의 SNP 유전자형(야생형 동형접합체, 돌연변이 동형접합체 및 이형접합체)의 검출 결과를 나타낸다. 시그널은 PTOCE 방법에 의해 발생되었다.
도 3B는 도 3A의 검출 결과에 기초하여 기준값을 수득하는 것을 나타낸다. 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율이 기준값으로 사용되었다.
본 발명은 실시예에 의해 보다 상세히 설명될 것이다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 첨부된 청구범위에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 TaqMan 실시간 PCR에 의한 다수의 타겟 검출
본 발명자들은 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 샘플 내의 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는지 조사하였다. 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 하기 검출 과정을 수행하였고, TaqMan 실시간 PCR을 시그널 발생 수단으로서 적용하였다.
5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운 프라이머의 연장, 및 TaqMan 프로브의 절단을 위해 사용하였다. 나이세리아 고노로애(NG)의 지놈 DNA 및 클라미디아 트라코마티스(CT)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다. 4가지 유형의 샘플(NG, CT, NG+CT 및 타겟이 없는 대조군)을 준비하고 분석하였다.
TaqMan 실시간 PCR을 이용하여 NG 및 CT를 검출하였다. 타겟 핵산이 존재하는 경우, TaqMan 프로브는 절단되고 표지된 단편이 방출된다. 증폭 곡선은 표지된 단편으로부터 시그널을 측정함으로써 수득될 수 있다.
NG에 대한 TaqMan 프로브는 그의 5'-말단에 형광 리포터 분자(Quasar 670) 및 그의 3'-말단에 퀀처 분자로 표지되었고(서열번호: 3), CT에 대한 TaqMan 프로브는 그의 5'-말단에 형광 리포터 분자(Quasar 670) 및 내부 부분에 퀀처 분자(BHQ-2)로 표지되었다(서열번호: 6).
이 실시예에서, TaqMan 프로브로부터의 시그널이 서로 구별되지 않음에도 불구하고, 각 타겟 서열에 대한 기준값 및 2개의 검출 온도(72℃ 및 60℃)로부터의 시그널을 사용한 플롯팅 방법은 각 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 증폭 곡선을 제공한다.
기준값에 대한 계산식 및 각 타겟 핵산 서열에 대한 증폭 곡선을 수득하기 위한 플롯팅 식은 하기와 같다:
(1) NG 또는 CT의 기준값(RV)
엔드-포인트에서 60℃에서의 RFU ÷ 72℃에서의 RFU
(2) NG 타겟에 대한 플롯팅 식:
(i) 72℃에서의 RFU - (60℃에서의 RFU ÷ CT 타겟의 RV)
또는 (ii) 60℃에서의 RFU - (72℃에서의 RFU Ⅹ CT 타겟의 RV)
(3) CT 타겟에 대한 플롯팅 식:
(i) 72℃에서의 RFU - (60℃에서의 RFU ÷ NG 타겟의 RV)
또는 (ii) 60℃에서의 RFU - (72℃에서의 RFU Ⅹ NG 타겟의 RV)
상기 식에서, RFU(상대적인 형광 단위) 값은 실시간 PCR의 각 사이클에서 측정된 값이며, RV는 기준값을 나타낸다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머 및 프로브의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호: 1)
NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호: 2)
NG-P 5'-[Quasar 670]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2]-3' (서열번호: 3)
CT-F1 5'-TCCGAATGGATAAAGCGTGACIIIIIATGAACTCAC-3' (서열번호: 4)
CT-R1 5'-AACAATGAATCCTGAGCAAAGGIIIIICGTTAGAGTC-3' (서열번호: 5)
CT-P 5'-[Quasar 670]CATTGTAAAGA[T(BHQ-2)]ATGGTCTGCTTCGACCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 6)
(I: 데옥시이노신)
실시간 PCR은 타겟 핵산(1 pg의 NG 지놈 DNA, 10 pg의 CT 지놈 DNA 또는 1 pg의 NG 지놈 DNA 및 10 pg의 CT 지놈 DNA의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 및 10 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 2), 1.5 pmole의 TaqMan 프로브(서열번호: 3), CT 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 4) 및 10 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 5), 3 pmole의 TaqMan 프로브(서열번호: 6), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스 [최종, 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 20 μl의 최종 부피로 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 50℃에서 5분간 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 넣고, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초의 50 사이클을 실시하였다. 시그널을 매 사이클마다 60℃ 및 72℃에서 검출하였다.
도 1A에 나타난 바와 같이, NG, CT, 또는 NG + CT의 존재시 60℃ 및 72℃ 모두에서 시그널이 검출되었다. 타겟 핵산의 부재시 시그널이 검출되지 않았다. 각 타겟 서열에 대한 기준값은 NG 단독 샘플 또는 CT 단독 샘플의 시그널을 사용하여 계산하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, NG 및 CT 타겟에 대한 기준값은 각각 1.8 및 5.8이었다.
이후, 타겟 서열을 확인하기 위하여, 상응하는 기준값 및 72℃ 및 60℃에서의 RFU를 플롯팅 식(도 1C 및 도 1D에서 (i) 또는 (ii) 식)에 적용하고, 각 타겟 서열의 증폭 곡선을 수득하였다. 상기 수득된 증폭 곡선의 유의성을 확보하기 위하여 NG 단독 샘플 및 CT 단독 샘플의 결과를 참조하여 적절한 역치를 선택하였다.
도 1C 및 도 1D에 나타난 바와 같이, 플롯팅 방법으로부터 유래된 증폭 곡선은 각 샘플 내 NG 또는 CT의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다.
따라서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 TaqMan 실시간 PCR에 의해 단일 검출 채널을 사용하는 경우에도 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산이 검출될 수 있음이 이해될 수 있다.
실시예 2: 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하는 것을 포함하는 PTOCE 실시간 PCR에 의한 다수의 타겟 검출
본 발명자들은 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 샘플 내의 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는지 여부를 조사하였다. 하기 검출 과정은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 수행하였으며, PTOCE 실시간 PCR을 시그널 발생 수단으로서 적용하였다.
5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단, 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다. 나이세리아 고노로애(NG)의 지놈 DNA 및 클라미디아 트라코마티스(CT)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다. 4개의 유형의 샘플(NG, CT, NG+CT 및 주형이 없는 대조군)을 준비하고 분석하였다.
PTOCE 실시간 PCR을 사용하여 CT 및 NG를 검출하였다. 타겟이 존재하는 경우, PTO가 절단되고 PTO 단편이 생산된다. 상기 PTO 단편은 CTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, CTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어 CTO와 연장 이합체(이합된 CTO)를 형성한다. 연장 이합체의 형성은 시그널을 제공하며, 연장이합체-형성 온도에서 시그널을 측정함으로써 증폭 곡선을 수득할 수 있다.
PTO 및 CTO는 그들의 연장을 방지하기 위해 그들의 3'-말단에 카본 스페이서로 블로킹되어 있다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되어 있다(서열번호: 8 및 12).
본 실시예에서, 67.8℃ 및 60℃를 시그널 검출 온도로서 선택하였다. 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 생성된 연장 이합체는 그들의 서열 및 길이에 의해 조절된 제어가능한 Tm 값을 갖는다. 본 실시예에서, NG 및 CT에 대한 연장 이합체의 서열 및 길이는 67.8℃ 및 60℃ 모두에서 시그널을 제공하도록 설계된다. 시그널-발생 수단으로부터의 시그널이 서로 구별되지 않음에도 불구하고, 각 타겟에 대한 기준값 및 2개의 검출 온도(67.8℃ 및 60℃)로부터의 시그널을 사용한 플롯팅 방법은 각 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 증폭 곡선을 제공한다.
기준값에 대한 계산식 및 각 타겟 핵산 서열에 대한 증폭 곡선을 수득하기 위한 플롯팅 식은 하기와 같다:
(1) NG 또는 CT의 기준값(RV)
엔드-포인트에서 60℃에서의 RFU ÷ 67.8℃에서의 RFU
(2) NG 타겟에 대한 플롯팅 식:
(i) 67.8℃에서의 RFU - (60℃에서의 RFU ÷ CT 타겟의 RV)
또는 (ii) 60℃에서의 RFU - (67.8℃에서의 RFU Ⅹ CT 타겟의 RV)
(3) CT 타겟에 대한 플롯팅 식:
(i) 67.8℃에서의 RFU - (60℃에서의 RFU ÷ NG 타겟의 RV)
또는 (ii) 60℃에서의 RFU - (67.8℃에서의 RFU Ⅹ NG 타겟의 RV)
상기 식에서, RFU(상대적인 형광 단위) 값은 실시간 PCR의 각 사이클에서 측정된 값이고, RV는 기준값을 나타낸다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호: 1)
NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호: 2)
NG-PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 7)
NG-CTO 5'- [BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3' (서열번호: 8)
CT-F2 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3' (서열번호: 9)
CT-R2 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3' (서열번호: 10)
CT-PTO 5'-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 11)
CT-CTO 5'-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(Cal Fluor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3 spacer]-3' (서열번호: 12)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO의 5'-태깅 부위를 가리킨다)
실시간 PCR을 타겟 핵산(10 pg의 NG 지놈 DNA, 10 pg의 CT 지놈 DNA 또는 10 pg의 NG 지놈 DNA 및 10 pg의 CT 지놈 DNA의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 및 5 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 2), 3 pmole의 PTO(서열번호: 7), 1 pmole의 CTO(서열번호: 8), CT 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 9) 및 5 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 10), 3 pmole의 PTO(서열번호: 11), 1 pmole의 CTO(서열번호: 12), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스 [최종, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 20 μl의 최종 부피로 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 50℃에서 5분간 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 넣고, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초, 67.8℃에서 5초의 50 사이클을 실시하였다. 시그널을 매 사이클마다 60℃ 및 67.8℃에서 검출하였다.
도 2A에 나타난 바와 같이, NG, CT, 또는 NG + CT의 존재시 60℃ 및 67.8℃ 모두에서 시그널이 검출되었다. 타겟 핵산의 부재시 시그널이 검출되지 않았다. 각 타겟의 기준값을 NG 단독 샘플 또는 CT 단독 샘플의 시그널을 사용하여 계산하였다. 도 2B에 나타난 바와 같이, NG 및 CT 타겟에 대한 기준값은 각각 6.1 및 1.0이었다.
그리고 나서, 각 샘플을 확인하기 위해, 상응하는 기준값 및 67.8℃ 및 60℃에서의 RFU를 플롯팅 식(도 2C 및 도 2D에서 (i) 또는 (ii) 식)에 적용하고, 각 타겟 서열의 증폭 곡선을 수득하였다. 수득된 증폭 곡선의 유의성을 확보하기 위하여 NG 단독 샘플 및 CT 단독 샘플의 결과를 참조하여 적절한 역치를 선택하였다.
도 2C 및 도 2D에 나타난 바와 같이, 플롯팅 방법으로부터 유래된 증폭 곡선은 각 샘플 내 NG 또는 CT의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다.
따라서, 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 PTOCE 실시간 PCR에 의해 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있다.
따라서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 PTOCE 실시간 PCR에 의해 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있음이 이해될 수 있다.
실시예 3: 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 SNP 유전형 분석
본 발명자들은 본 발명의 방법이 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 SNP 유전자형을 분석하는데 적용될 수 있는지 조사하였다. PTOCE 실시간 PCR을 시그널 발생 수단으로 적용하였다.
5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머, PTO의 절단, 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다. MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 야생형(C) 동형접합체, 돌연변이형(T) 동형접합체, 및 이형접합체를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다.
PTOCE 실시간 PCR을 사용하여 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 야생형(C) 대립유전자 및 돌연변이형(T) 대립유전자를 검출하였다. 타겟 대립유전자가 존재하는 경우, PTO가 방출되고 PTO 단편이 생산된다. 상기 PTO 단편은 CTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, CTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어 CTO와 연장 이합체(이합된 CTO)를 형성한다. 상기 연장 이합체의 형성은 시그널을 제공하고, 연장 이합체-형성 온도에서 시그널을 측정함으로써 증폭 곡선이 수득될 수 있다.
PTO 및 CTO는 이들의 연장을 방지하기 위해 이들의 3'-말단에 카본 스페이서로 블로킹되었다. 야생형(C) 대립유전자 또는 돌연변이형(T) 대립유전자에 대한 CTO는 그의 5'-말단에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 그의 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되었다(서열번호: 16 및 18).
본 실시예에서, 64℃ 및 60℃를 시그널 검출 온도로서 선택하였다. 야생형(C) 대립유전자 또는 돌연변이형(T) 대립유전자의 존재에 의존적으로 생성된 연장 이합체는 이들의 서열 및 길이에 조절된 제어가능한 Tm 값을 갖는다. 본 실시예에서, 야생형(C) 대립유전자 및 돌연변이형(T) 대립유전자에 대한 연장 이합체의 서열 및 길이는 64℃ 및 60℃ 모두에서 시그널을 제공하도록 설계되었다. 연장 이합체 및 2개의 검출 온도를 포함하는 반응 조건은 야생형(C) 대립유전자의 기준값이 돌연변이형(T) 대립유전자의 기준값과 상이하도록 설계 및 선택하였다.
MTHFR(C677T) 유전자를 포함하는 알려지지 않은 샘플의 유전자형은 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널들 간의 차이를 상기 3개의 유전자형에 대한 기준값과 비교함으로써 결정될 수 있다.
MTHFR(C677T) 유전자의 SNP 유전자형을 확인하기 위해, 각 유전자형에 대한 기준값을 계산하였다. 각 유전자형에 대한 기준값은 구별될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 2개의 컷오프 값을 이용하여 각 유전자형에 대한 기준값의 범위를 나눌 수 있다. 본 실시예에서 사용된 각 유전자형에 대한 기준값을 하기와 같이 계산하였다:
야생형 동형접합체, 돌연변이 동형접합체 및 이형접합체에 대한 기준값
엔드-포인트에서 60℃에서의 RFU ÷ 64℃에서의 RFU
상기 식에서, RFU(상대적인 형광 단위) 값은 실시간 PCR의 엔드-포인트에서 측정된 값이다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
M677-F 5'-CCACCCCGAAGCAGGGAIIIIIGAGGCTGACC-3' (서열번호: 13)
M677-R 5'-CAAGTGATGCCCATGTCGGIIIIIGCCTTCACAA-3' (서열번호: 14)
M677-W-PTO 5'-GGTCCCGACGTTAGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTC[C3 spacer]-3' (서열번호: 15)
M677-W-CTO 5'-[BHQ-2]CCTCGGTGCCACGCCATCGG[T(CAL Fluor Red 610)]TCTTCTAACGTCGGGACC[C3 spacer]-3' (서열번호: 16)
M677-M-PTO 5'-ACGTCGATTCGCACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA[C3 spacer]-3' (서열번호: 17)
M677-M-CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red 610)]ATTCTGCGAATCGACGT[C3 spacer] -3' (서열번호:18)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO의 5'-태깅 부위를 가리킨다)
실시간 PCR을 타겟 핵산(10 ng의 야생형(C) 동형이합체 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA, 10 ng의 돌연변이(T) 동형이합체 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA, 또는 10 ng의 이형이합체 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA), 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 13) 및 5 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 14), 3 pmole의 각각의 PTO(서열번호: 15 및 17), 1 pmole의 각각의 CTO(서열번호: 16 및 18), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스 [최종, 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 20 μl의 최종 부피로 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 50℃에서 5분간 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 넣고, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초, 64℃에서 5초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널을 매 사이클마다 60℃ 및 64℃에서 검출하였다.
도 3A에 나타난 바와 같이, 야생형(C) 동형접합체, 돌연변이(T) 동형접합체, 또는 이형접합체의 존재시 60℃ 및 64℃ 모두에서 형광 시그널이 검출되었다. 타겟 핵산의 부재시 시그널이 검출되지 않았다. 3개의 유전자형에 대한 기준값을 계산하고, 각 유전자형이 컷오프 값에 의해 구별될 수 있음을 확인하였다.
도 3B에 나타난 바와 같이, 야생형(C) 동형접합체, 이형접합체, 및 돌연변이(T) 동형접합체에 대한 기준값은 각각 1.0, 1.3, 및 2.7이었다. 각 유전자형에 대한 기준값은 각 유전자형이 구별될 수 있음을 확인시켜 주었다.
이들 결과는 본 발명의 방법이 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 SNP 유전자형을 분석하는데 적용될 수 있음을 보여준다. 흥미롭게도, 대립유전자로부터의 시그널이 서로 구별될 수 없음에도 불구하고, 본 발명의 방법은 단일 검출 채널을 사용하여 SNP 유전자형 분석을 정확하게 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예가 기술되었음에도 불구하고, 본 발명의 정신에 속하는 이의 변화 및 변형이 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위와 그의 균등물에 의해 결정되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1: 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 TaqMan 실시간 PCR에 의한 다수의 타겟 검출
본 발명자들은 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 샘플 내의 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는지 조사하였다. 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 하기 검출 과정을 수행하였고, TaqMan 실시간 PCR을 시그널 발생 수단으로서 적용하였다.
5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운 프라이머의 연장, 및 TaqMan 프로브의 절단을 위해 사용하였다. 나이세리아 고노로애(NG)의 지놈 DNA 및 클라미디아 트라코마티스(CT)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다. 4가지 유형의 샘플(NG, CT, NG+CT 및 타겟이 없는 대조군)을 준비하고 분석하였다.
TaqMan 실시간 PCR을 이용하여 NG 및 CT를 검출하였다. 타겟 핵산이 존재하는 경우, TaqMan 프로브는 절단되고 표지된 단편이 방출된다. 증폭 곡선은 표지된 단편으로부터 시그널을 측정함으로써 수득될 수 있다.
NG에 대한 TaqMan 프로브는 그의 5'-말단에 형광 리포터 분자(Quasar 670) 및 그의 3'-말단에 퀀처 분자로 표지되었고(서열번호: 3), CT에 대한 TaqMan 프로브는 그의 5'-말단에 형광 리포터 분자(Quasar 670) 및 내부 부분에 퀀처 분자(BHQ-2)로 표지되었다(서열번호: 6).
이 실시예에서, TaqMan 프로브로부터의 시그널이 서로 구별되지 않음에도 불구하고, 각 타겟 서열에 대한 기준값 및 2개의 검출 온도(72℃ 및 60℃)로부터의 시그널을 사용한 플롯팅 방법은 각 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 증폭 곡선을 제공한다.
기준값에 대한 계산식 및 각 타겟 핵산 서열에 대한 증폭 곡선을 수득하기 위한 플롯팅 식은 하기와 같다:
(1) NG 또는 CT의 기준값(RV)
엔드-포인트에서 60℃에서의 RFU ÷ 72℃에서의 RFU
(2) NG 타겟에 대한 플롯팅 식:
(i) 72℃에서의 RFU - (60℃에서의 RFU ÷ CT 타겟의 RV)
또는 (ii) 60℃에서의 RFU - (72℃에서의 RFU Ⅹ CT 타겟의 RV)
(3) CT 타겟에 대한 플롯팅 식:
(i) 72℃에서의 RFU - (60℃에서의 RFU ÷ NG 타겟의 RV)
또는 (ii) 60℃에서의 RFU - (72℃에서의 RFU Ⅹ NG 타겟의 RV)
상기 식에서, RFU(상대적인 형광 단위) 값은 실시간 PCR의 각 사이클에서 측정된 값이며, RV는 기준값을 나타낸다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머 및 프로브의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호: 1)
NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호: 2)
NG-P 5'-[Quasar 670]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2]-3' (서열번호: 3)
CT-F1 5'-TCCGAATGGATAAAGCGTGACIIIIIATGAACTCAC-3' (서열번호: 4)
CT-R1 5'-AACAATGAATCCTGAGCAAAGGIIIIICGTTAGAGTC-3' (서열번호: 5)
CT-P 5'-[Quasar 670]CATTGTAAAGA[T(BHQ-2)]ATGGTCTGCTTCGACCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 6)
(I: 데옥시이노신)
실시간 PCR은 타겟 핵산(1 pg의 NG 지놈 DNA, 10 pg의 CT 지놈 DNA 또는 1 pg의 NG 지놈 DNA 및 10 pg의 CT 지놈 DNA의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 및 10 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 2), 1.5 pmole의 TaqMan 프로브(서열번호: 3), CT 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 4) 및 10 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 5), 3 pmole의 TaqMan 프로브(서열번호: 6), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스 [최종, 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 20 μl의 최종 부피로 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 50℃에서 5분간 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 넣고, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초의 50 사이클을 실시하였다. 시그널을 매 사이클마다 60℃ 및 72℃에서 검출하였다.
도 1A에 나타난 바와 같이, NG, CT, 또는 NG + CT의 존재시 60℃ 및 72℃ 모두에서 시그널이 검출되었다. 타겟 핵산의 부재시 시그널이 검출되지 않았다. 각 타겟 서열에 대한 기준값은 NG 단독 샘플 또는 CT 단독 샘플의 시그널을 사용하여 계산하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, NG 및 CT 타겟에 대한 기준값은 각각 1.8 및 5.8이었다.
이후, 타겟 서열을 확인하기 위하여, 상응하는 기준값 및 72℃ 및 60℃에서의 RFU를 플롯팅 식(도 1C 및 도 1D에서 (i) 또는 (ii) 식)에 적용하고, 각 타겟 서열의 증폭 곡선을 수득하였다. 상기 수득된 증폭 곡선의 유의성을 확보하기 위하여 NG 단독 샘플 및 CT 단독 샘플의 결과를 참조하여 적절한 역치를 선택하였다.
도 1C 및 도 1D에 나타난 바와 같이, 플롯팅 방법으로부터 유래된 증폭 곡선은 각 샘플 내 NG 또는 CT의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다.
따라서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 TaqMan 실시간 PCR에 의해 단일 검출 채널을 사용하는 경우에도 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산이 검출될 수 있음이 이해될 수 있다.
실시예 2: 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하는 것을 포함하는 PTOCE 실시간 PCR에 의한 다수의 타겟 검출
본 발명자들은 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 샘플 내의 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는지 여부를 조사하였다. 하기 검출 과정은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 수행하였으며, PTOCE 실시간 PCR을 시그널 발생 수단으로서 적용하였다.
5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단, 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다. 나이세리아 고노로애(NG)의 지놈 DNA 및 클라미디아 트라코마티스(CT)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다. 4개의 유형의 샘플(NG, CT, NG+CT 및 주형이 없는 대조군)을 준비하고 분석하였다.
PTOCE 실시간 PCR을 사용하여 CT 및 NG를 검출하였다. 타겟이 존재하는 경우, PTO가 절단되고 PTO 단편이 생산된다. 상기 PTO 단편은 CTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, CTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어 CTO와 연장 이합체(이합된 CTO)를 형성한다. 연장 이합체의 형성은 시그널을 제공하며, 연장이합체-형성 온도에서 시그널을 측정함으로써 증폭 곡선을 수득할 수 있다.
PTO 및 CTO는 그들의 연장을 방지하기 위해 그들의 3'-말단에 카본 스페이서로 블로킹되어 있다. CTO는 그의 템플레이팅 부위에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되어 있다(서열번호: 8 및 12).
본 실시예에서, 67.8℃ 및 60℃를 시그널 검출 온도로서 선택하였다. 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 생성된 연장 이합체는 그들의 서열 및 길이에 의해 조절된 제어가능한 Tm 값을 갖는다. 본 실시예에서, NG 및 CT에 대한 연장 이합체의 서열 및 길이는 67.8℃ 및 60℃ 모두에서 시그널을 제공하도록 설계된다. 시그널-발생 수단으로부터의 시그널이 서로 구별되지 않음에도 불구하고, 각 타겟에 대한 기준값 및 2개의 검출 온도(67.8℃ 및 60℃)로부터의 시그널을 사용한 플롯팅 방법은 각 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 증폭 곡선을 제공한다.
기준값에 대한 계산식 및 각 타겟 핵산 서열에 대한 증폭 곡선을 수득하기 위한 플롯팅 식은 하기와 같다:
(1) NG 또는 CT의 기준값(RV)
엔드-포인트에서 60℃에서의 RFU ÷ 67.8℃에서의 RFU
(2) NG 타겟에 대한 플롯팅 식:
(i) 67.8℃에서의 RFU - (60℃에서의 RFU ÷ CT 타겟의 RV)
또는 (ii) 60℃에서의 RFU - (67.8℃에서의 RFU Ⅹ CT 타겟의 RV)
(3) CT 타겟에 대한 플롯팅 식:
(i) 67.8℃에서의 RFU - (60℃에서의 RFU ÷ NG 타겟의 RV)
또는 (ii) 60℃에서의 RFU - (67.8℃에서의 RFU Ⅹ NG 타겟의 RV)
상기 식에서, RFU(상대적인 형광 단위) 값은 실시간 PCR의 각 사이클에서 측정된 값이고, RV는 기준값을 나타낸다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호: 1)
NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호: 2)
NG-PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 7)
NG-CTO 5'- [BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3' (서열번호: 8)
CT-F2 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3' (서열번호: 9)
CT-R2 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3' (서열번호: 10)
CT-PTO 5'-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 11)
CT-CTO 5'-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(Cal Fluor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3 spacer]-3' (서열번호: 12)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO의 5'-태깅 부위를 가리킨다)
실시간 PCR을 타겟 핵산(10 pg의 NG 지놈 DNA, 10 pg의 CT 지놈 DNA 또는 10 pg의 NG 지놈 DNA 및 10 pg의 CT 지놈 DNA의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 및 5 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 2), 3 pmole의 PTO(서열번호: 7), 1 pmole의 CTO(서열번호: 8), CT 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 9) 및 5 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 10), 3 pmole의 PTO(서열번호: 11), 1 pmole의 CTO(서열번호: 12), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스 [최종, 200 uM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 20 μl의 최종 부피로 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 50℃에서 5분간 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 넣고, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초, 67.8℃에서 5초의 50 사이클을 실시하였다. 시그널을 매 사이클마다 60℃ 및 67.8℃에서 검출하였다.
도 2A에 나타난 바와 같이, NG, CT, 또는 NG + CT의 존재시 60℃ 및 67.8℃ 모두에서 시그널이 검출되었다. 타겟 핵산의 부재시 시그널이 검출되지 않았다. 각 타겟의 기준값을 NG 단독 샘플 또는 CT 단독 샘플의 시그널을 사용하여 계산하였다. 도 2B에 나타난 바와 같이, NG 및 CT 타겟에 대한 기준값은 각각 6.1 및 1.0이었다.
그리고 나서, 각 샘플을 확인하기 위해, 상응하는 기준값 및 67.8℃ 및 60℃에서의 RFU를 플롯팅 식(도 2C 및 도 2D에서 (i) 또는 (ii) 식)에 적용하고, 각 타겟 서열의 증폭 곡선을 수득하였다. 수득된 증폭 곡선의 유의성을 확보하기 위하여 NG 단독 샘플 및 CT 단독 샘플의 결과를 참조하여 적절한 역치를 선택하였다.
도 2C 및 도 2D에 나타난 바와 같이, 플롯팅 방법으로부터 유래된 증폭 곡선은 각 샘플 내 NG 또는 CT의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다.
따라서, 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 PTOCE 실시간 PCR에 의해 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있다.
따라서, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 PTOCE 실시간 PCR에 의해 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있음이 이해될 수 있다.
실시예 3: 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 SNP 유전형 분석
본 발명자들은 본 발명의 방법이 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 SNP 유전자형을 분석하는데 적용될 수 있는지 조사하였다. PTOCE 실시간 PCR을 시그널 발생 수단으로 적용하였다.
5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머, PTO의 절단, 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다. MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 야생형(C) 동형접합체, 돌연변이형(T) 동형접합체, 및 이형접합체를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다.
PTOCE 실시간 PCR을 사용하여 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 야생형(C) 대립유전자 및 돌연변이형(T) 대립유전자를 검출하였다. 타겟 대립유전자가 존재하는 경우, PTO가 방출되고 PTO 단편이 생산된다. 상기 PTO 단편은 CTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, CTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어 CTO와 연장 이합체(이합된 CTO)를 형성한다. 상기 연장 이합체의 형성은 시그널을 제공하고, 연장 이합체-형성 온도에서 시그널을 측정함으로써 증폭 곡선이 수득될 수 있다.
PTO 및 CTO는 이들의 연장을 방지하기 위해 이들의 3'-말단에 카본 스페이서로 블로킹되었다. 야생형(C) 대립유전자 또는 돌연변이형(T) 대립유전자에 대한 CTO는 그의 5'-말단에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 그의 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되었다(서열번호: 16 및 18).
본 실시예에서, 64℃ 및 60℃를 시그널 검출 온도로서 선택하였다. 야생형(C) 대립유전자 또는 돌연변이형(T) 대립유전자의 존재에 의존적으로 생성된 연장 이합체는 이들의 서열 및 길이에 조절된 제어가능한 Tm 값을 갖는다. 본 실시예에서, 야생형(C) 대립유전자 및 돌연변이형(T) 대립유전자에 대한 연장 이합체의 서열 및 길이는 64℃ 및 60℃ 모두에서 시그널을 제공하도록 설계되었다. 연장 이합체 및 2개의 검출 온도를 포함하는 반응 조건은 야생형(C) 대립유전자의 기준값이 돌연변이형(T) 대립유전자의 기준값과 상이하도록 설계 및 선택하였다.
MTHFR(C677T) 유전자를 포함하는 알려지지 않은 샘플의 유전자형은 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널들 간의 차이를 상기 3개의 유전자형에 대한 기준값과 비교함으로써 결정될 수 있다.
MTHFR(C677T) 유전자의 SNP 유전자형을 확인하기 위해, 각 유전자형에 대한 기준값을 계산하였다. 각 유전자형에 대한 기준값은 구별될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 2개의 컷오프 값을 이용하여 각 유전자형에 대한 기준값의 범위를 나눌 수 있다. 본 실시예에서 사용된 각 유전자형에 대한 기준값을 하기와 같이 계산하였다:
야생형 동형접합체, 돌연변이 동형접합체 및 이형접합체에 대한 기준값
엔드-포인트에서 60℃에서의 RFU ÷ 64℃에서의 RFU
상기 식에서, RFU(상대적인 형광 단위) 값은 실시간 PCR의 엔드-포인트에서 측정된 값이다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
M677-F 5'-CCACCCCGAAGCAGGGAIIIIIGAGGCTGACC-3' (서열번호: 13)
M677-R 5'-CAAGTGATGCCCATGTCGGIIIIIGCCTTCACAA-3' (서열번호: 14)
M677-W-PTO 5'-GGTCCCGACGTTAGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTC[C3 spacer]-3' (서열번호: 15)
M677-W-CTO 5'-[BHQ-2]CCTCGGTGCCACGCCATCGG[T(CAL Fluor Red 610)]TCTTCTAACGTCGGGACC[C3 spacer]-3' (서열번호: 16)
M677-M-PTO 5'-ACGTCGATTCGCACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA[C3 spacer]-3' (서열번호: 17)
M677-M-CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red 610)]ATTCTGCGAATCGACGT[C3 spacer] -3' (서열번호:18)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO의 5'-태깅 부위를 가리킨다)
실시간 PCR을 타겟 핵산(10 ng의 야생형(C) 동형이합체 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA, 10 ng의 돌연변이(T) 동형이합체 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA, 또는 10 ng의 이형이합체 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA), 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호: 13) 및 5 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호: 14), 3 pmole의 각각의 PTO(서열번호: 15 및 17), 1 pmole의 각각의 CTO(서열번호: 16 및 18), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스 [최종, 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소]를 함유하는 20 μl의 최종 부피로 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 50℃에서 5분간 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 넣고, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초, 64℃에서 5초의 50 사이클을 수행하였다. 시그널을 매 사이클마다 60℃ 및 64℃에서 검출하였다.
도 3A에 나타난 바와 같이, 야생형(C) 동형접합체, 돌연변이(T) 동형접합체, 또는 이형접합체의 존재시 60℃ 및 64℃ 모두에서 형광 시그널이 검출되었다. 타겟 핵산의 부재시 시그널이 검출되지 않았다. 3개의 유전자형에 대한 기준값을 계산하고, 각 유전자형이 컷오프 값에 의해 구별될 수 있음을 확인하였다.
도 3B에 나타난 바와 같이, 야생형(C) 동형접합체, 이형접합체, 및 돌연변이(T) 동형접합체에 대한 기준값은 각각 1.0, 1.3, 및 2.7이었다. 각 유전자형에 대한 기준값은 각 유전자형이 구별될 수 있음을 확인시켜 주었다.
이들 결과는 본 발명의 방법이 단일 검출 채널을 사용하여 하나의 반응 용기에서 SNP 유전자형을 분석하는데 적용될 수 있음을 보여준다. 흥미롭게도, 대립유전자로부터의 시그널이 서로 구별될 수 없음에도 불구하고, 본 발명의 방법은 단일 검출 채널을 사용하여 SNP 유전자형 분석을 정확하게 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예가 기술되었음에도 불구하고, 본 발명의 정신에 속하는 이의 변화 및 변형이 당업자에게 명백할 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위와 그의 균등물에 의해 결정되는 것으로 이해되어야 한다.
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DETECTION TEMPERATURES AND REFERENCE VALUES
<130> PI170007
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<151> 2014-12-09
<160> 18
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 1
tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 2
caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-P
<400> 3
tgcccctcat tggcgtgttt cg 22
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-F1
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 4
tccgaatgga taaagcgtga cnnnnnatga actcac 36
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-R1
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(27)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 5
aacaatgaat cctgagcaaa ggnnnnncgt tagagtc 37
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-P
<400> 6
cattgtaaag atatggtctg cttcgaccg 29
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-PTO
<400> 7
gtacgcgata cgggcccctc attggcgtgt ttcg 34
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-CTO
<400> 8
tttttttttt tttttttttg tactgcccgt atcgcgtac 39
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-F2
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 9
gagttttaaa atgggaaatt ctggtnnnnn tttgtataac 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-R2
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 10
ccaattgtaa tagaagcatt ggttgnnnnn ttattggaga 40
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-PTO
<400> 11
gattacgcga ccgcatcaga agctgtcatt ttggctgcg 39
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-CTO
<400> 12
gcgctggata ccctggacga tatgtgcggt cgcgtaatc 39
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(22)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 13
ccaccccgaa gcagggannn nngaggctga cc 32
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(24)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 14
caagtgatgc ccatgtcggn nnnngccttc acaa 34
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<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-W-PTO
<400> 15
ggtcccgacg ttagctcccg cagacacctt ctccttc 37
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-W-CTO
<400> 16
cctcggtgcc acgccatcgg ttcttctaac gtcgggacc 39
<210> 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-M-PTO
<400> 17
acgtcgattc gcactcccgc agacaccttc tccttcaa 38
<210> 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-M-CTO
<400> 18
tttttttttt tttttttttt tattctgcga atcgacgt 38
Claims (28)
- 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법:
(a) (i) 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 제1 타겟 핵산 서열에 대한 제1 기준값 및/또는 (ii) 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공되는 시그널의 변화의 관계를 나타내는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 제2 기준값을 제공하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 상기 제2 기준값과 상이하며;
(b) 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 샘플을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 상기 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며;
(c) 제2 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 처리하여 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 제거하고 제1 시그널 발생 수단에 의한 시그널의 발생을 결정함으로써 제1 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하거나; 제1 기준값 및 단계 (b)에서 검출된 시그널을 처리하여 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 제거하고 제2 시그널 발생 수단에 의한 시그널의 발생을 결정함으로써 제2 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 단계 (b)는 핵산 증폭이 수반되거나 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 수행되는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 2개의 시그널-발생 수단 중 적어도 하나는 이합체의 형성의 의존적인 방식으로 시그널을 발생하는 시그널-발생 수단인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 2개의 시그널-발생 수단 중 적어도 하나는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단인 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 시그널 변화의 관계는 단계 (a)에서 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 수득되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 단계 (b)에서 검출된 시그널로부터 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 수학적으로 제거하는 것이고, 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 단계 (b)에서 검출된 시그널로부터 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 수학적으로 제거하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 제2 시그널 발생 수단에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제2 기준값 및 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되고; 제1 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부가 결정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 제2 시그널 발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제2 기준값 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되고; 제1 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부가 결정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 시그널 발생 수단에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제1 기준값 및 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되고; 제2 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부가 결정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 제1 시그널 발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 발생된 시그널은 제1 기준값 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 제거되고; 제2 시그널 발생 수단이 상대적 고온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는지 여부가 결정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하나의 반응 용기가 2개의 타겟 핵산 서열 이외의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 추가적인 2개의 시그널-발생 수단을 각각 함유하는 적어도 하나의 추가적인 세트를 추가로 포함하고; 용기 내의 2개의 시그널-발생 수단 중 각 세트에 의해 발생된 시그널은 서로 구별되며, 상기 시그널은 각각 상이한 유형의 검출기에 의해 검출되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 2개의 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하고, 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 한 가지 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함하며, 다른 하나는 다른 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 방법.
- 삭제
- 하기 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 방법:
(a) (i) 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값; (ii) 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값; 및 (iii) 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내는 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값을 제공하는 단계로서; 상기 3개의 기준값은 서로 상이하며;
(b) 상기 SNP 대립유전자를 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단과 함께 샘플을 인큐베이션하고, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 2개의 시그널-발생 수단으로부터의 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널들은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(c) 상기 기준값 및 상기 단계 (b)에서 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
- 제18항에 있어서, 상기 SNP 유전자형은 단계 (c)에서의 차이를 기준값과 비교함으로써 결정되는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 차이가 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 수득되는 차이를 포함하는 방법.
- 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단; 및
(b) 제1항, 제4항, 제6항 내지 제7항 및 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법을 기재하는 설명서.
- 하기를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 키트:
(a) 제1 SNP 대립유전자를 위한 시그널-발생 수단;
(b) 제2 SNP 대립유전자를 위한 시그널-발생 수단; 및
(c) 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법을 기재하는 설명서.
- 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열을 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 타겟 핵산 서열을 위한 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 제2 기준값 및 단계 (a)에서 수신된 시그널을 처리하여 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 제거하고 제1 시그널 발생 수단에 의한 시그널의 발생을 결정함으로써 제1 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하거나; 제1 기준값 및 단계 (a)에서 수신된 시그널을 처리하여 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널을 제거하고 제2 시그널 발생 수단에 의한 시그널의 발생을 결정함으로써 제2 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 상기 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며; 상기 제1 기준값은 상기 제2 기준값과 상이하다.
- 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 저장 매체로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 SNP 대립 유전자를 위한 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단으로부터 발생된 샘플 내 시그널을 수신하는 단계로서; 상기 2개의 시그널-발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며; 및
(b) 단계 (a)에서 수신된 시그널 간의 차이, 및 제1 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제1 기준값, 제2 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대한 제2 기준값 및 제1 SNP 대립유전자 및 제2 SNP 대립유전자로 구성된 이형접합체에 대한 제3 기준값에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 제1 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고, 제2 기준값은 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내며, 제3 기준값은 제1 시그널-발생 수단 및 제2 시그널-발생 수단에 의해 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제공된 시그널 변화의 관계를 나타내고; 상기 3개의 기준값은 서로 상이하다.
- (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 제23항의 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 시료 내 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함하는 2개의 타겟 핵산 서열 중 적어도 하나의 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 장치.
- (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 제24항의 컴퓨터 해독가능한 저장 매체를 포함하는, 샘플 내 핵산 서열의 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 유전자형을 분석하기 위한 장치.
- 삭제
- 삭제
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