CN103509865A - 利用高分辨熔解曲线分析技术检测pah基因突变的方法 - Google Patents

利用高分辨熔解曲线分析技术检测pah基因突变的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，设计PAH基因第3、6、7、11和12外显子序列为模板的检测引物，根据高分辨熔解曲线分析技术对PCR扩增后的基因序列进行突变检测。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可实现对苯丙氨酸羟化酶基因常见突变位点的快速筛查，在PAH基因突变检测方法方面提供了一个新依据。

Description

利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法
技术领域
本发明涉及一种苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH) 基因定位于染色体12q23.2，全长约90kb，包括13个外显子和12个内含子。外显子长为1353bp的单链，mRNA翻译成含451个氨基酸的酶单体，单体聚合成有功能的PAH 酶。PAH基因突变可导致肝脏苯丙氨酸羟化酶缺乏，苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸，从而在肝脏中代谢紊乱，导致患儿出现苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)。苯丙酮尿症是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病。在欧美地区的发病率为1/10000，在我国是1/16000，杂合子频率为1/50。
迄今已经发现PKU 有560多种突变，其中60%为错义突变，致病突变大多位于外显子或内含子与外显子的交接区，严重影响苯丙氨酸羟化酶基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，使其加速降解，从而影响苯丙氨酸羟化酶的催化活性。在不同种族和地区人群之间苯丙氨酸羟化酶基因座突变部位及分布具有较大差异。欧洲PKU 患者的常见突变位于外显子12 的R408Q (31 %)；中国人群PKU 患者最常见的突变为R243Q、V399V、Ex6-96A>G、R111X、R413P和Y356X等，集中于PAH基因第3、6、7、11和12外显子区域，突变发生频率可达80%。苯丙氨酸羟化酶基因常见突变的研究有利于建立苯丙酮尿症的基因诊断，以便于实现苯丙酮尿症的早期诊断和产前诊断。
目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。
本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法——高分辨熔解曲线（High resolution melting，HRM）分析技术。其原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，饱和性荧光染料高浓度占据双链DNA所有碱基对，当双链DNA局部解链时，荧光染料释放，荧光强度的降低精准可靠地反映出DNA分子的解链情况。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，结果准确，且实现了真正的闭管操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单易行的苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测方法。
为了达到上述目的，本发明提供一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步： 采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul；正常人样本DNA为阴性对照。
第二步：根据PAH基因的保守区域，采用在线软件Primer 3设计PAH基因第3、6、7、11和12外显子HRM引物，确定最佳引物为18-25bp大小，PCR产物长度180-300bp。相关引物信息如下：
PAH基因外显子3引物序列：
PAH-E3-F  5′-ccctccccattctctcttct-3′
PAH-E3-R  5′-gacagtgtggagttacttatgttgc-3′
PAH基因外显子6引物序列：
PAH-E6-F  5′-gccctgcttgagacacctat-3′
PAH-E6-R  5′-TCTGCAGGAAcTGAGAAACG-3′
PAH基因外显子7引物序列：
PAH-E7-F  5′-ttcttttcatcccagCTTGC-3′
PAH-E7-R  5′-aaaagatggcgctcattgtg-3′
PAH基因外显子11引物序列：
PAH-E11-F  5′-cttttcacttggggcctaca-3′
PAH-E11-R  5′-agtggctcacctttgtcacc-3′
PAH基因外显子12引物序列：
PAH-E12-F  5′-ccttcactcaagcctgtggt-3′
PAH-E12-R  5′-aaccgagtggcctcgtaag-3′
第三步：每个样本分别进行5个PCR反应，每个PCR反应的总体系为15ul（包括Type-it HRM PCR Mix 7.5ul、正向引物溶液0.5ul及反向引物溶液0.5ul，样本DNA 2ul，灭菌重蒸馏水4.5ul）；在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92-97℃变性5-15分钟，92-97℃变性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件：92-97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，初始熔解温度60-65℃开始程序升温熔解至95℃，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒。
第四步：应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移和曲线形状变化展现不同的基因型。定义已知的正常对照样本后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。
本发明对PAH基因常见突变区域进行检测，可实现对PAH基因突变的快速筛查，有利于建立苯丙酮尿症的早期诊断和产前诊断。
本发明基于HRM分析技术，无需序列特异性探针，采用新型饱和染料，操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快、高通量等优点，而且分辨率高，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染。
附图说明
图1为本发明实施例PAH-E7 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例样本正常对照的测序图；
图3为本发明实施例大样本的HRM标准曲线图；
图4为本发明实施例大样本的HRM差异曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例 以检测PAH基因第7外显子为例
1、采用硅胶吸附法抽提15例被测者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul，电泳胶图如图1所示；
正常对照DNA符合以下条件时视为合格：OD值A260/A280在1.8-2.0之间；电泳条带清晰；测序鉴定PAH基因第7外显子无突变存在，测序结果如图2所示。
2、 根据PAH基因的保守区域，采用在线软件Primer 3设计PAH基因第7外显子HRM引物，确定引物为20bp大小，PCR产物长度204bp（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。用无菌水配制浓度为10umol/L的E7正向引物溶液以及浓度为10umol/L的E7反向引物溶液；E7正向引物的序列为：5′-ttcttttcatcccagCTTGC-3′，E7反向引物的序列为：5′-aaaagatggcgctcattgtg-3′。
3、在每一个PCR反应孔中依次加入Type-it HRM PCR Mix 7.5ul（QIAGEN公司生产，包括2 x HRM PCR Master Mix、10×PCR缓冲液、Q-solution、EvaGreen Dye、HotStarTaq DNA 聚合酶）和步骤2所得的E7正、反向引物溶液各0.5ul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤1得到的检测样品及正常对照品各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为95℃变性10分钟，95℃变性10秒，57℃退火10秒，72℃延伸10秒，40个循环；HRM反应条件：95℃变性1分钟，40℃复性1分钟，初始熔解温度65℃开始程序升温熔解至95℃，过程中实时监测荧光信号，40次每秒。
4、应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，如图3、4所示，在7例正常人中，未筛查出有突变的基因存在；在8例苯丙酮尿症患者中，有2例检测出存在PAH-Exon7突变，检出率在25%，符合国内研究报道的几率。

Claims (1)

1.一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法，其特征在于，具体步骤为： 
第一步： 采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul；正常人样本DNA为阴性对照；
第二步：根据PAH基因的保守区域，采用在线软件Primer 3设计PAH基因第3、6、7、11和12外显子HRM引物，确定最佳引物为18-25bp大小，PCR产物长度180-300bp；
相关引物信息如下：
PAH基因外显子3引物序列：
PAH-E3-F  5′-ccctccccattctctcttct-3′
PAH-E3-R  5′-gacagtgtggagttacttatgttgc-3′
PAH基因外显子6引物序列：
PAH-E6-F  5′-gccctgcttgagacacctat-3′
PAH-E6-R  5′-TCTGCAGGAAcTGAGAAACG-3′
PAH基因外显子7引物序列：
PAH-E7-F  5′-ttcttttcatcccagCTTGC-3′
PAH-E7-R  5′-aaaagatggcgctcattgtg-3′
PAH基因外显子11引物序列：
PAH-E11-F  5′-cttttcacttggggcctaca-3′
PAH-E11-R  5′-agtggctcacctttgtcacc-3′
PAH基因外显子12引物序列：
PAH-E12-F  5′-ccttcactcaagcctgtggt-3′
PAH-E12-R  5′-aaccgagtggcctcgtaag-3′
第三步：每个样本分别进行5个PCR反应，每个PCR反应的总体系为15ul（包括Type-it HRM PCR Mix 7.5ul、正向引物溶液0.5ul及反向引物溶液0.5ul，样本DNA 2ul，灭菌重蒸馏水4.5ul）；在Rotor-Gene Q上进行反应，PCR反应条件为92-97℃变性5-15分钟，92-97℃变性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，30-50个循环；HRM反应条件：92-97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，初始熔解温度60-65℃开始程序升温熔解至95℃，过程中实时监测荧光信号，30-50次每秒；
第四步：应用Rotor-Gene Q软件分析HRM结果，通过标准曲线基于曲线偏移和曲线形状变化展现不同的基因型；定义已知的正常对照样本后，软件会自动调出所有检测样本的基因型。
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