CN107523608A - 一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒 - Google Patents

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徐沁
梅艳巧
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Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及检测苯丙酮尿症致病基因是否发生突变的试剂盒。该试剂盒的主要成分包括：(1)PAH基因第1到第13外显子区PCR扩增与测序引物13对；(2)PCR扩增试剂；(3)PCR产物纯化试剂；(4)DNA测序试剂。本发明的试剂盒用于检测苯丙酮尿症致病基因PAH基因的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，有助于用于产前诊断、及早阻止患儿出生，降低苯丙酮尿症的发病率。

Description

一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及检测苯丙酮尿症致病基因是否发生突变的试剂盒。
背景技术
现有技术公开了苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU)是一种遗传代谢病，由挪威的Folling医生于1934年发现，因患者尿液中含有大量的苯丙酮酸而得名。研究显示该疾患是由于体内苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性降低或其辅酶四氢生物喋吟缺乏，导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，血液和组织中苯丙氨酸浓度增高，尿中苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸显著增加，称为“苯丙酮尿症”。调查显示该疾患虽为遗传代谢病，但并不少见，我国PKU患病率约为1:10000，美国约为1:14000，北爱尔兰约为1/4400，德国约为1:7000，日本约为1:784000。
目前PKU分为两种类型：经典型PKU和BH4缺乏型PKU；其中经典型PKU占99％，是由于染色体基因突变导致肝脏中PAH缺陷而引起苯丙氨酸代谢障碍所致。
研究报道了人类PAH基因定位于染色体12q22-24.1全长约90Kb，成熟mRNA长约2.4Kb，共有13个外显子和12个内含子，编码由451个氨基酸组成的酶单体。迄今，在PAH基因上发现了大约567个致病突变(http://www.pahdb.mcgill.ca/cgi-bin/pahdb)，其中点突变在85％以上，有研究在中国人群中发现44种PAH的致病突变类型；其中PAH基因突变导致PAH相应氨基酸的改变，形成不稳定的PAH酶蛋白或降低酶的活性；或甚至突变成终止密码子，导致PAH酶的缺失。研究显示，PAH基因突变具有以下特点：(1)突变位置多变：所有外显子、内含子，5/-UTR和3/-UTR区均发现突变，突变不能单从CpG位点解释；(2)突变类型多样：有错义突变、小缺失、剪接位点突变等，但大部分是错义突变；(3)突变呈现明显的异质性：不同种族和地区人群之间PAH基因座突变部位及分布具有较大差异。还有研究显示，PKU是单基因突变且大部分是复合杂合子，因此大部分PAH基因必然有两个等位基因突变。
目前，本领域学者在致力寻找PAH的高频突变等位基因，以探索PKU的基因诊断、产前诊断及携带者检查，如，Guldberg 1996年研究美国PKU患者发现高频突变等位基因为R408W(18.7％)；波兰PKU基因突变高频位点为A403G和R297H；Yoshiyuki研究41例日本PKU，发现高频突变位点为R413P和R243Q。Johannes检测546例PKU，其中411例德国人，65例土耳其人，发现91种突变，最常见的突变是R408W(22％)，并指出欧洲PAH基因突变有明显地区差异，如南欧常见突变为IVS10-11G>A东欧为R408W、(巴厘岛占80％以上)、北欧为IVS12+1G>A(丹麦占37％)或R408W(爱尔兰占42％)。Judith检测西班牙115例PKU和268名亲属，发现57种不同类型的突变。还有临床表型和基因型研究报道R408W纯合子是经典型PKU，R261Q纯合子是中间型PKU；R408W复合杂合子表型取决于其他等位基因的突变类型，R408W/IVSnt-1，R408/R261X表现为经典型PKU，R408W/R252W表现为轻型PKU，R408W亦可见于良性高苯丙氨酸血症；Desviat检测古巴的28例PKU病人，发现古巴PKU患者的突变热点为E208K和R261Q；Giannattasio检测分析意大利PKU患者的289条染色体，发现基因突变具有地区差异，IVS10nt-11G>A和R261Q是意大利PKU患者的突变热点。
目前国内外对苯丙酮尿症患儿的诊断方法主要有尿三氯化铁试验、血清苯丙氨酸浓度测定、尿蝶呤分析、Guthrie细菌抑制试验。实践显示，所述生化检测的方法耗时长且繁琐，而且仅适用与已经出生的婴儿，对产前诊断无能为力。尤其对已生育过苯丙酮尿症患儿的家庭，再次怀孕生育苯丙酮尿症患儿的概率为25％，盲目生育导致悲剧发生的可能性极大。业内共识，由于苯丙酮尿症的致病基因(苯丙氨酸羟化酶基因)仅在肝脏和肾脏中表达，基因诊断成为早期诊断的最有效的手段。有关研究开始对PKU患者的筛查和临床检验，如单链多态性PCR检测(PCR-SSCP)、等位基因特异性寡核苷酸杂交法(PCR-ASO)、限制性内切酶的酶切(PCR-RFLP)、等位基因特异性扩增(ARMS)、短串联重复序列(PCR-STR)及高压液相色谱定量(HPLC)法且已经应用于临床，为PKU的早期诊断和早期治疗提供检验学依据和基础。
基于现有技术的现状和基础，本申请的发明人拟提供检测苯丙酮尿症致病基因是否发生突变的试剂盒。进一步为苯丙酮尿症产前诊断提供有效措施。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，具体涉及一种采用DNA测序技术检测苯丙酮尿症致病基因PAH基因是否突变的试剂盒。
本发明基于PKU的遗传方式为常染色体隐性遗传，先证者父母为携带者，即携带有一个PKU致病突变位点的杂合子，携带者无PKU临床症状；先证者的同胞有1/4的风险患病，1/2的风险成为PKU致病突变携带者，并有1/4的可能性为不带有PKU致病突变的正常人；PKU家庭若要再次生育，需要有基因检测的保证，需进行产前基因诊断；先证者的后代肯定为携带者；若携带者频率为1/50，PKU患者的后代为患者的可能性为1/100，先证者父母的同胞为携带者的可能性为1/2等研究基础，采用一代测序技术对PKU患者PAH基因进行突变检测，检测区域覆盖PAH基因全部13个外显子区域及外显子-内含子交界区(如图1所示)，经应用与产前诊断中，结果表明，经过上述流程明确先证者及其父母的致病突变后，明显有助于作出产前诊断。
更具体的，本发明提供了一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，该试剂盒的主要成分包括：
(1)PAH基因第1到第13外显子区PCR扩增与测序引物13对，引物序列如表1所示；
(2)常规PCR扩增试剂，如dNTP、Taq DNA聚合酶等；
(3)常规PCR产物纯化试剂，如SAP酶、ExoI酶等；
(4)常规DNA测序试剂，如BigDye mix、EDTA溶液、乙醇溶液、HI-DI溶液等。
表1 PAH基因第1-13外显子区的PCR扩增与测序引物序列
所述引物序列扩增出的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的试剂盒通过下述方法用于检测苯丙酮尿症致病基因PAH基因的突变体，包括以下步骤：
(1)提取样本的基因组DNA；
(2)PAH基因PCR扩增
针对PAH基因第1-13外显子区按照表2设计引物进行PCR扩增。每个反应体系为总体积16u 1，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、10×PCR反应缓冲液、MgCl2)、去离子水5.5μL、引物对(l0uM)1μL、基因组DNA(100ng/ul)1ul。反应条件为95℃15分钟，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后进行72℃10分钟。
(3)PCR产物纯化
每个反应体系总体积为5.6μL。PCR产物4μL，再加入1.6μL SAP酶混合物(SAP酶、ExoI酶、去离子水)。反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟。
(4)DNA测序反应
每个反应的体系为总体积10u1，PCR酶解产物1μL、BigDye mix(Bigdye、5×seq)2.2μL和测序引物0.5μL，加水补足10μL。反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min。
反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL 70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟。放入测序仪中。
本发明所述的试剂盒用于检测苯丙酮尿症致病基因PAH基因的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断、阻止患儿出生，降低苯丙酮尿的发病率。
附图说明
图1是PAH基因外显子和内含子示意图。
图2是实施例2中PAH基因第1外显子测序结果示意图。
图3是实施例2中PAH基因第2外显子测序结果示意图。
图4是实施例2中PAH基因第3外显子测序结果示意图。
图5是实施例2中PAH基因第4外显子测序结果示意图。
图6是实施例2中PAH基因第5外显子测序结果示意图。
图7是实施例2中PAH基因第6外显子测序结果示意图。
图8是实施例2中PAH基因第7外显子测序结果示意图。
图9是实施例2中PAH基因第8外显子测序结果示意图。
图10是实施例2中PAH基因第9外显子测序结果示意图。
图11是实施例2中PAH基因第10外显子测序结果示意图。
图12是实施例2中PAH基因第11外显子测序结果示意图。
图13是实施例2中PAH基因第12外显子测序结果示意图。
图14是实施例2中PAH基因第13外显子测序结果示意图。
图15是实施例2中PAH基因第7外显子突变p.R241C测序结果示意图。
图16是实施例2中PAH基因第6外显子突变p.Y204C测序结果示意图。
具体实施方式
实施例1
一人份检测苯丙酮尿致病基因PAH是否发生突变的试剂盒，包括以下成分：(1)PAH基因第1到第13外显子区PCR扩增与测序引物13对，每条引物1OD，引物序列参见表1；
(2)PCR扩增试剂：Taq酶混合液7.5μL(dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2)；
(3)PCR产物纯化试剂：1.6μL SAP酶混合物(SAP酶、ExoI酶、去离子水)；
(3)测序试剂：2.2μL BigDye mix(Bigdye、5×seq)、2.5μL EDTA、30μL乙醇溶液(100％)、100μL乙醇溶液(70％)、8μL Hi-Di。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例2
一人份检测苯丙酮尿致病基因PAH是否发生突变的试剂盒的使用步骤包括：
(1)提取样本的基因组DNA；
(2)PAH基因PCR扩增
针对PAH基因第1-13外显子区按照表2设计引物进行PCR扩增。每个反应体系为总体积16u 1，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、10×PCR反应缓冲液、MgCl2)、去离子水5.5μL、引物对(10uM)1μL、基因组DNA(100ng/ul)1ul。反应条件为95℃15分钟，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后进行72℃10分钟。
(3)PCR产物纯化
每个反应体系为总体积5.6μL。PCR产物4μL，再加入1.6μL SAP酶混合物(SAP酶、ExoI酶、去离子水)。反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟。
(4)DNA测序反应
每个反应的体系为总体积10u1，PCR酶解产物1μL、BigDye mix(Bigdye、5×seq)2.2μL和测序引物0.5μL，加水补足10μL。反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min。
反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL 70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟。放入测序仪中。
(5)结果分析
对PAH基因进行直接测序，在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果。将测定的各样本序列与GenBank数据库PAH基因序列(NM_000277)进行比较，PAH基因序列如SEQ N0.1所示，对应编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，测序结果如图2至图16所示，结果表明，本发明的试剂盒用于检测苯丙酮尿症致病基因PAH基因的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，有助于应用于产前诊断、及早阻止患儿出生，降低苯丙酮尿症的发病率。
本发明为检出患者的PAH基因突变并查找出相应的携带者进一步减少或预防苯丙酮尿症患儿出生提供了有效治疗措施。
SEQUENCE LISTING
<110> 海门中科基因生物科技有限公司
<120> 一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒
<130> 20160622
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<170> PatentIn version 3.3
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ggataaacgt agcctgcctg ctctgacaaa catcatcaag atcttgaggc atgacattgg 780
tgccactgtc catgagcttt cacgagataa gaagaaagac acagtgccct ggttcccaag 840
aaccattcaa gagctggaca gatttgccaa tcagattctc agctatggag cggaactgga 900
tgctgaccac cctggtttta aagatcctgt gtaccgtgca agacggaagc agtttgctga 960
cattgcctac aactaccgcc atgggcagcc catccctcga gtggaataca tggaggaaga 1020
aaagaaaaca tggggcacag tgttcaagac tctgaagtcc ttgtataaaa cccatgcttg 1080
ctatgagtac aatcacattt ttccacttct tgaaaagtac tgtggcttcc atgaagataa 1140
cattccccag ctggaagacg tttctcaatt cctgcagact tgcactggtt tccgcctccg 1200
acctgtggct ggcctgcttt cctctcggga tttcttgggt ggcctggcct tccgagtctt 1260
ccactgcaca cagtacatca gacatggatc caagcccatg tatacccccg aacctgacat 1320
ctgccatgag ctgttgggac atgtgccctt gttttcagat cgcagctttg cccagttttc 1380
ccaggaaatt ggccttgcct ctctgggtgc acctgatgaa tacattgaaa agctcgccac 1440
aatttactgg tttactgtgg agtttgggct ctgcaaacaa ggagactcca taaaggcata 1500
tggtgctggg ctcctgtcat cctttggtga attacagtac tgcttatcag agaagccaaa 1560
gcttctcccc ctggagctgg agaagacagc catccaaaat tacactgtca cggagttcca 1620
gcccctgtat tacgtggcag agagttttaa tgatgccaag gagaaagtaa ggaactttgc 1680
tgccacaata cctcggccct tctcagttcg ctacgaccca tacacccaaa ggattgaggt 1740
cttggacaat acccagcagc ttaagatttt ggctgattcc attaacagtg aaattggaat 1800
cctttgcagt gccctccaga aaataaagta aagccatgga cagaatgtgg tctgtcagct 1860
gtgaatctgt tgatggagat ccaactattt ctttcatcag aaaaagtccg aaaagcaaac 1920
cttaatttga aataacagcc ttaaatcctt tacaagatgg agaaacaaca aataagtcaa 1980
aataatctga aatgacagga tatgagtaca tactcaagag cataatggta aatcttttgg 2040
ggtcatcttt gatttagaga tgataatccc atactctcaa ttgagttaaa tcagtaatct 2100
gtcgcatttc atcaagatta attaaaattt gggacctgct tcattcaagc ttcatatatg 2160
ctttgcagag aactcataaa ggagcatata aggctaaatg taaaacacaa gactgtcatt 2220
agaattgaat tattgggctt aatataaatc gtaacctatg aagtttattt tctattttag 2280
ttaactatga ttccaattac tactttgtta ttgtacctaa gtaaattttc tttaggtcag 2340
aagcccatta aaatagttac aagcattgaa cttctttagt attatattaa tataaaaaca 2400
tttttgtatg ttttattgta atcataaata ctgctgtata aggtaataaa actctgcacc 2460
taatccccat aacttccagt atcattttcc aattaattat caagtctgtt ttgggaaaca 2520
ctttgaggac atttatgatg cagcagatgt tgactaaagg cttggttggt agatattcag 2580
gaaatgttca ctgaataaat aagtaaatac attattgaaa agcaaatctg tataaatgtg 2640
aaatttttat ttgtattagt aataaaacat tagtagttta 2680
<210> 28
<211> 452
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 28
Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser
1 5 10 15
Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn
20 25 30
Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu
35 40 45
Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His
50 55 60
Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe
65 70 75 80
Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys
85 90 95
Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp
100 105 110
Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu
115 120 125
Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala
130 135 140
Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Pro Val Tyr Arg Ala Arg Arg Lys Gln
145 150 155 160
Phe Ala Asp Ile Ala Tyr Asn Tyr Arg His Gly Gln Pro Ile Pro Arg
165 170 175
Val Glu Tyr Met Glu Glu Glu Lys Lys Thr Trp Gly Thr Val Phe Lys
180 185 190
Thr Leu Lys Ser Leu Tyr Lys Thr His Ala Cys Tyr Glu Tyr Asn His
195 200 205
Ile Phe Pro Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Gly Phe His Glu Asp Asn Ile
210 215 220
Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Gln Phe Leu Gln Thr Cys Thr Gly Phe
225 230 235 240
Arg Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ser Arg Asp Phe Leu Gly
245 250 255
Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly
260 265 270
Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu
275 280 285
Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln
290 295 300
Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys
305 310 315 320
Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln
325 330 335
Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly
340 345 350
Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu
355 360 365
Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro
370 375 380
Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg
385 390 395 400
Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro
405 410 415
Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile
420 425 430
Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu
435 440 445
Gln Lys Ile Lys
450

Claims (3)

1.一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，其包括以下成分:PAH基因第1到第13外显子区PCR扩增与测序引物13对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；
所述引物序列为：
2.如权利要求1检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，所述引物序列扩增出的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，通过下述检测苯丙酮尿症致病基因突变，
(1)提取样本的基因组DNA；
(2)PAH基因PCR扩增；
采用权利要求1所述引物序列；每个PCR扩增体系总体积为16μL，包含Taq酶混合液7.5μL、去离子水5.5μL、引物对1μL、基因组DNA 1ul；PCR反应条件为95℃15分钟，进行14个循环的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后进行72℃10分钟；
(3)PCR产物纯化
每个反应体系总体积为5.6μL，包括PCR产物4μL和1.6μL SAP酶混合物，反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟；
(4)DNA测序反应
每个反应的体系为总体积10u1，包括PCR酶解产物1μL、BigDye mix 2.2μL和测序引物0.5μL，余量为去离子水；反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；
反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL 70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟，放入测序仪中测序。
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