CN103436616A - 中国人群苯丙酮尿症pah基因筛查试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测中国人群苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因12个突变热点的试剂盒,所述试剂盒以中国人群PAH基因上的12个位点为检测对象,针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物,针对各个目的区段同时进行PCR扩增和标记延伸,通过毛细管电泳分析,一次获得12个突变热点的基因型。本发明针对中国人群苯丙酮尿症PAH基因突变的12个热点,提供一种简单、高通量、高效能、低成本、检测准确的适合中国人群的苯丙酮尿症PAH基因突变筛查用试剂盒,适用于中国人群苯丙酮尿症的群体性筛查。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域中基因突变检测领域,具体涉及一种筛查中国人群苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点试剂盒。
背景技术
苯丙酮尿症(Phenylketonuria,简称PKU)是一种常见先天性氨基酸代谢异常疾病,于1934年由挪威的Folling医生发现,因患者尿液中含有大量的苯丙酮酸而得名。患儿出生时正常,若未经干预,随着进奶以后,一般在3-6个月时,出现症状,周岁时症状明显。其主要症状表现:兴奋不安、多动或嗜睡、萎靡、约25%的患儿出现惊厥,继之智能发育落后日渐明显;因黑色素合成不足,在生后数月毛发、皮肤和虹膜色泽变浅,约1/3患儿伴有湿疹;尿和汗液呈特殊的鼠尿臭味。
PKU的发病机理在于人体必需氨基酸苯丙氨酸在体内一部分被用于合成蛋白质,一部分通过酪氨酸代谢途径被降解。在酪氨酸代谢途径中,苯丙氨酸羟化酶(PAH)及其辅酶四氢生物蝶呤(BH4)催化苯丙氨酸降解成酪氨酸,当此二者中任何一种缺乏时,降解反应不能进行,导致苯丙氨酸的积累。血液中高浓度的苯丙氨酸在转氨酶的作用下生成苯丙酮酸、苯乳酸和苯乙酸等旁路代谢产物。这些产物部分随尿液和汗液排出,使尿液和汗液呈霉烂臭味;而大部分积聚在血液和脑脊液中,对婴幼儿神经系统造成不同程度的毒性作用,引起不可逆的大脑损伤和智力发育障碍。确诊后,上述症状经饮食控制后完全可以逆转,但神经损伤难以转变。因此,早诊断、早治疗对患儿、家庭和社会都有重大意义。
PKU分为两种类型:经典型PKU和BH4缺乏型PKU;其中经典型PKU占99%,是由于染色体基因突变导致肝脏中PAH缺陷从而引起苯丙氨酸代谢障碍所致。PKU是常染色体隐性遗传,其发病率在我国约为1/11144,且北方高于南方。
人类PAH基因定位于染色体12q22-24.1全长约90Kb,成熟mRNA长约2.4Kb,共有13个外显子和12个内含子,编码由451个氨基酸组成的酶单体。迄今,在PAH基因上发现了大约500个致病突变,其中点突变在85%以上,在中国人群中已发现100多种PAH的致病突变类型,其中5%的突变尚未鉴明其致病性。PAH基因突变有的导致PAH相应氨基酸的改变,形成不稳定的PAH酶蛋白或降低酶的活性;有的甚至突变成终止密码子,导致PAH酶的缺失。PAH基因突变位点在不同人种和人群中的突变频率存在差异,我们对10篇国内不同地区PAH基因突变的分子流行病学调研文献及我们的检测结果进行综合分析发现本专利涵盖的12个位点的突变频率较高:168位点G→T突变为0.3%,331位点C→T突变为5.0%,IVS4—1位点G→A突变为3.8%,482位点T→C突变为1.4%,611位点A→G突变为5.0%,721位点C→T突变为2.1%,728位点G→A突变为21.7%,782位点G→A突变为0.8%,977位点G→A突变为1.5%,1033位点G→A突变为0.2%,1068位点C→A突变为5.6%和1238位点G→C突变为6.0%。12种热点突变在我国的总突变率应该在53.4%左右。连锁分析表明,一个位点的纯合致病突变和两个或两个以上的复合杂合致病突变均可导致苯丙酮尿症,而一个杂合突变并不致病。因此,检测这12个热点突变可确诊28.5%的PKU患儿,并为49.8%的PKU患儿提供50%的遗传信息。
目前,PKU是我国法定的两种新生儿筛查疾病之一。在婴儿出生经母乳喂养3天后,采集足跟血,采用时间分辨荧光法、酶法或串联质谱法,检测血液中苯丙氨酸的浓度进行初筛,这些方法都生化筛查手段,阳性病例仍需要进一步临床确诊或进行基因诊断。
基因突变热点筛查,虽然无法替代上述常规技术,但是上述技术的良好的补充,尤其是在揭示是否携带致病基因型及潜在的遗传病因上具有明显优势。
SNaPshot技术是通过多重PCR扩增目的区域后,经寡核苷酸引物延伸标记扩增,突变位点匹配上一个荧光标记的双脱氧核苷酸后终止延伸。然后通过毛细管电泳进行片段分析,相当于单个位点的微测序,可以通过毛细管电泳图直观地判断突变位点的基因型。这一技术已经成功应用于人体叶酸利用能力基因多突变位点检测和耳聋基因多突变位点筛查,表明其是一种综合效益较好的较高通量检测多位点突变的方法。
目前,对PAH基因进行基因检测手段繁多,如:PCR-SSCP、TGGE、DGGE、HRMA、“分子开关”技术、分子信标、DNA直接测序、二代测序等。然而,这些方法有的耗时多、有的成本高、有的效率低。
中国专利CN101899518公开了一种试剂盒及其PCR扩增方法,检测苯丙酮尿症PAH基因7个突变热点。该专利在完成PCR反应和聚丙酰胺凝胶电泳后,通过直接观察产物条带的有无来判断苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的基因型。用聚丙酰胺凝胶电泳结果来判断基因型,分辨率较低,容易造成误判,并且该发明一次只能检测7个突变热点,未能囊括中国人苯丙酮尿症的主要突变基因,通量较低。
由于PKU是我国法定的两种新生儿筛查疾病之一,筛查量非常大,因此在现今背景条件下,急需出现一种成本低、效率高、通量高、检测准确的检测手段。
发明内容
本发明的目的是弥补目前现有突变筛查方法的不足,提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的苯丙酮尿症PAH基因突变筛查用试剂盒。
为达到上述目的,本发明的技术方案是:中国人群苯丙酮尿症PAH基因筛查试剂盒,该试剂盒包括以下内容:
(1)反应试剂,包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、FastTaq酶、SNaPshot Multiplex混合液、包括SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液的纯化试剂、包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照DNA样本、阴性对照DNA样本;
(2)按一定比例混合的针对苯丙酮尿症PAH基因8个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物;
(3)按一定比例混合的针对苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点的PCR延伸引物;
所述试剂盒以PAH基因的168位点G→T突变(位于exon2)、331位点C→T突变(位于exon3)、IVS4—1位点G→A突变(扩增exon5)、482位点T→C突变(位于exon5)、611位点A→G突变(反向T→C突变,位于exon6)、721位点C→T突变(位于exon7)、728位点G→A突变(反向C→T突变,位于exon7)、782位点G→A突变(反向C→T突变,位于exon7)、977位点G→A突变(位于exon10)、1033位点G→A突变(位于exon10)、1068位点C→A突变(位于exon11)和1238位点G→C(位于exon12)突变共12个PAH基因热点突变为检测对象,针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物,针对各个目的区段同时进行多重PCR扩增和标记延伸,通过毛细管电泳分析,一次获得以上12个位点的基因型;
所述PAH基因168位点的扩增引物序列是5’-TTCATGCTTGCTTTGTCC-3’和5’-TTCAAATCTGCCTGTTCC-3’;
所述PAH基因331位点的扩增引物序列是5’-GGGTATAACCAAGGGAAGG-3’和5’-CTCAACAAGCAAGGCAGA-3’;
所述PAH基因IVS4—1位点的扩增引物序列是5’-GGGTATAACCAAGGGAAGG-3’和5’-CTCAACAAGCAAGGCAGA-3’;
所述PAH基因IVS4—1位点的扩增引物序列与所述PAH基因482位点的扩增引物序列一致;为5’-GGGTATAACCAAGGGAAGG-3’和5’-CTCAACAAGCAAGGCAGA-3’;
所述PAH基因611位点的扩增引物序列是5’-CCCCGACTCCCTCTGCTAA-3和5’-TGCCTCCACATACTTGTCTTCC-3’;
所述PAH基因721位点的扩增引物序列与所述PAH基因728位点和782位点的扩增引物序列一致;为:5’-CGTCAAAGCCTATGTCCC-3’和5’-GCAATGAACCCAAACCTC-3’;
所述PAH基因977位点的扩增引物序列是5’-CCCTCCAGAAACACCCTCATAG-3’和5’-CCCACAGCCATCATCAAATC-3’;
所述PAH基因977位点的扩增引物序列与所述PAH基因1033位点的扩增引物序列一致;为:5’-CCCTCCAGAAACACCCTCATAG-3’和5’-CCCACAGCCATCATCAAATC-3’;
所述PAH基因1068位点的扩增引物序列是:5’-GGGCTGTGATGTAGAAGG-3’和5’-CACCTTTGTCACCACCTC-3’;
所述PAH基因1238位点的扩增引物序列是5’-TAGGGAGGTGTCCGTGTT-3’和5’-TGTGGAAAGGTGGAATGA-3’。
其中,所述针对中国人群苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点的PCR延伸引物的终浓度分别为:PAH基因168位点、331位点、IVS4—1位点、482位点、611位点、721位点、728位点、782位点、977位点、1033位点、1068位点和1238位点分别为0.25μM、0.25μM、0.5μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM和0.5μM。
该中国人群苯丙酮尿症PAH基因筛查用试剂盒以PAH基因的168位点G→T突变(位于exon2)、331位点C→T突变(位于exon3)、IVS4—1位点G→A突变(扩增exon5)、482位点T→C突变(位于exon5)、611位点A→G突变(反向T→C突变,位于exon6)、721位点C→T突变(位于exon7)、728位点G→A突变(反向C→T突变,位于exon7)、782位点G→A突变(反向C→T突变,位于exon7)、977位点G→A突变(位于exon10)、1033位点G→A突变(位于exon10)、1068位点C→A突变(位于exon11)和1238位点G→C(位于exon12)突变共12个PAH基因热点突变为检测对象,针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物,针对各个目的区段同时进行多重PCR扩增和标记延伸,通过毛细管电泳分析,一次获得以上12个位点的基因型。
本发明中试剂盒的PCR扩增和延伸引物浓度的优化配置,使其能够在扩增时兼顾各个目的DNA区段和延伸标记产物的产量,有利于后续检测中各个位点突变情况的判断识别。
本发明使用Gene Runner和Primer Premier5引物设计程序(加拿大PREMIER生物软件公司)协助设计引物,通过多重PCR扩增,使被检测样本的8个目的区段得到扩增富集。PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游100-200bp的距离引物设计的起始部位,引物与序列匹配的特异性要好,引物间的退火温度要尽量一致,且保持在55℃左右。使在一个多重PCR反应中的各个扩增引物的扩增效率相当。8个扩增片段包含所要检测的12个突变位点,PAH基因的168位点G→T突变(位于exon2)、331位点C→T突变(位于exon3)、IVS4—1位点G→A突变(扩增exon5)、482位点T→C突变(位于exon5)、611位点A→G突变(反向T→C突变,位于exon6)、721位点C→T突变(位于exon7)、728位点G→A突变(反向C→T突变,位于exon7)、782位点G→A突变(反向C→T突变,位于exon7)、977位点G→A突变(位于exon10)、1033位点G→A突变(位于exon10)、1068位点C→A突变(位于exon11)和1238位点G→C(位于exon12)。扩增结束后可通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增片段检测,发现8条扩增条带。
然后进行扩增产物的酶反应纯化,去除多余的引物及dNTP等杂质。再对8个富集的片段进行寡核苷酸引物的PCR扩增,又进一步针对经过扩增的12个突变位点进行延伸引物设计,引物设计的指导思想是:仅在突变点的上下游设计正向或反向的延伸引物,引物设计长度较扩增片段长度少1个碱基,延伸的单个碱基为带有相应颜色荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP。各个引物扩增片段长度应该有一定的差异,均匀分布在18-60bp之间,以便于毛细管电泳能检测。理论上,PAH基因的168位点G→T突变(位于exon2)、331位点C→T突变(位于exon3)、IVS4—1位点G→A突变(扩增exon5)、482位点T→C突变(位于exon5)、611位点A→G突变(反向T→C突变,位于exon6)、721位点C→T突变(位于exon7)、728位点G→A突变(反向C→T突变,位于exon7)、782位点G→A突变(反向C→T突变,位于exon7)、977位点G→A突变(位于exon10)、1033位点G→A突变(位于exon10)、1068位点C→A突变(位于exon11)和1238位点G→C(位于exon12)的延伸引物片段在经过毛细管电泳后的长度为依次为49bp、51bp、53bp、37bp、48bp、44bp、35bp、46bp、34bp、40bp、28bp和25bp,如表1所示。实际电泳过程可能会存在飘移现象,尤其是发生了突变的位点的峰漂移更多,即与分子量marker所测片段大小有差距,但不会影响整体结果判读。表1是12个位点延伸片段理论长度。
表1 苯丙酮尿症PAH基因12个位点延伸片段理论长度
这样,经过对突变位点的单个碱基进行荧光标记PCR延伸扩增后,再进行一次扩增产物的酶反应纯化,带有不同荧光的不同长度的片段经遗传分析仪毛细管电泳后就能够分析出相应片段所携带的碱基类型,延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色,延伸引物的片段长度决定峰的位置,延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。峰的颜色为绿色,则代表A碱基,蓝色为G碱基,红色为T碱基,黑色为C碱基,如表2所示。
表2 荧光标记颜色
根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型(正常)还是突变型,如表3所示。
表3 苯丙酮尿症PAH基因突变热点野生型与突变型颜色标记
*所示设计为反向测序反应,因此在毛细管电泳结果中野生型与突变型均要按反向测序去判断。PAH基因的611位点,正向测序突变类型为A→G,反向测序即为T→C;728正向测序突变类型为G→A,反向测序即为C→T;782位点正向测序突变类型为G→A,反向测序即为C→T。
本发明将上述12个位点集中在一个反应中检测,大大节省了检测的时间、试剂、人力和物力,提高了诊断效率。
PCR扩增引物序列见表4所示。
表4 苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点PCR扩增引物
PCR延伸引物见表5所示。
表5 苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点PCR延伸引物
为了使检测准确可靠、简单易行,本试剂盒含有PCR扩增反应试剂,包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、FastTaq酶、引物混合液、延伸引物混合液、SNaPshot Mix混合液、纯化用SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液;阳性对照DNA样本、阴性对照DNA样本以及说明书。其主要功能在于,将所需的试剂集成在一个试剂盒内,核酸片段扩增、纯化可以在试剂盒提供试剂的基础上顺次而简便地完成。
在过去的十几年中,虽然已有多种突变检测的技术得到发展,但总的来说,尚缺乏一种适用于苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点筛查的技术手段。
本发明基于以往中国PKU患者人群的特点,普遍研究和比较现有技术手段的基础上,集成创新,对已知突变热点的检测精度和检测通量进行技术革新,弥补现有基因突变筛查方法的不足,提供一种简单、高通量、低成本的适合中国人群的PAH基因突变筛查试剂盒及其使用方法。
如果采用直接测序法,对逐个外显子一个一个地PCR扩增,PAH基因有13个外显子,就需要准备13个反应管,独立进行13个PCR反应、13个测序反应,费时费力,对实验室人力、物力、时间资源都是一种较大的消耗,而本发明采用SNaPshot技术,能够在一个实验反应管中就同时完成对8个外显子内的12个突变热点的检测,可以对多个位点在一个反应管中同时进行基因分型检测,是一种全新的创新型技术,不仅节约成本,节约人力物力,而且更重要的是迅速便捷,适合批量检测。由于集成到一个反应检测,折算每个位点的检测成本只相当于直接测序法的1/10。
本发明针对中国人群苯丙酮尿症PAH基因突变的热点,选择覆盖范围广泛的12个突变热点作为筛查目标,弥补目前现有突变筛查方法的不足,提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的苯丙酮尿症PAH基因突变筛查用试剂盒,弥补了上述缺陷。
附图说明
图1是本发明中一个PKU家系的检测结果毛细管电泳图及结果判断;
图2是中国人群苯丙酮尿症PAH基因突变热点SNaPshot筛查过程。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1,中国人群苯丙酮尿症PAH基因突变热点筛查检测
样本选择:样本来源于苏州市立医院生殖与遗传中心PKU患者家系DNA文库,共27个家系,库中所有患者样本收集前均签署了知情同意书,并承诺配合后续的诊疗和随访。
步骤一,针对中国人群苯丙酮尿症PAH基因突变热点8个区段进行多重PCR扩增反应。
PCR反应体系10μL,含样本DNA10ng,dNTP2mM,10×Buffer(含Mg2+)1.0μL,MgCl225mM,FastTaq酶0.15U,各扩增引物对的终浓度为参照表4。PCR反应条件为:95℃预变性4min;94℃变性30s,66℃退火50s,每循环降0.5℃,72℃延伸50S,11个循环;94℃变性30S,61℃退火50S,72℃延伸50S,24个循环;72℃充分延伸10min,4℃保存,PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。扩增引物序列见表4。
步骤二,扩增产物的纯化
取1.0μl步骤二的扩增产物,加入2.0U SAP酶,2.0U Exon I酶,去离子水2.6μL,反应总体系为6μL,混匀后37℃反应80min,80℃终止反应15min,4℃保存。
步骤三,延伸标记、纯化
PCR反应体系为6.0μL,含纯化产物1μL,5×Seq Buffer1.2μL,SNaPshot Mix1.0μL,去离子水1.8μL,12个位点的延伸引物及终浓度分别为:PAH基因168位点、331位点、IVS4—1位点、482位点、611位点、721位点、728位点、782位点、977位点、1033位点、1068位点和1238位点分别为0.25μM、0.25μM、0.5μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM和0.5μM。PCR反应条件为:96℃预变性1min;96℃变性10s,52℃退火5s,60℃延伸30s,28个循环,4℃保存,PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。反应结束后进行第二次纯化,每反应产物中加入1U SAP酶,37℃反应60min,75℃灭活反应15min,4℃保存。延伸引物序列见表5。
步骤四,毛细管电泳
每个反应体系中加入Hi—Di甲酰胺(ABI公司)9μl,内标LIZ-120(ABI公司)0.22μL,步骤四的第二次纯化产物1μL,混匀离心后,95℃变性7min,立即置冰上5min,在ABI公司遗传分析仪进行毛细管电泳,电泳结果用GeneMaper系列软件进行数据的采集和分析。
步骤五,检测结果
根据野生型电泳峰型颜色和突变峰型颜色不同进行判断,电泳顺序由左向右依次为:1238、1068、977、728、482、1033、721、782、611、168、331、IVS4—1,如图1所示。
图1中,A为先证者:PAH基因721位点C→T突变和611位点A→G突变联合杂合突变;B为患儿父亲:PAH基因721位点C→T突变单独杂合突变;C为患儿母亲:PAH基因611位点A→G突变单独杂合突变;D为患儿母亲exon6正向测序:PAH基因611位点A→G突变;E为患儿父亲exon7正向测序:PAH基因721位点C→T突变;*表示突变型;↓表示突变位置。
筛查检测程序如图2所示。
本发明的筛查方法及试剂盒使用方便,操作简单,成本低,通量高,检测结果直接可靠,适合于中国人群PAH基因突变的大规模筛查。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.中国人群苯丙酮尿症PAH基因筛查试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含以下内容:
(1)反应试剂,包括dNTP、5×和10×PCR缓冲液、Mg2+离子、FastTaq酶、SNaPshot Multiplex混合液、包括SAP酶、Exon I酶及其配套的缓冲液的纯化试剂、包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照DNA样本、阴性对照DNA样本;
(2)按一定比例混合的针对PAH基因突变热点所在的8个外显子进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物;
(3)按一定比例混合的针对PAH基因12个突变热点的PCR延伸引物;
所述试剂盒以PAH基因的168位点G→T突变、331位点C→T突变、IVS4—1位点G→A突变、482位点T→C突变、611位点A→G突变、721位点C→T突变、728位点G→A突变、782位点G→A突变、977位点G→A突变、1033位点G→A突变、1068位点C→A突变和1238位点G→C突变共12个PAH基因突变热点为检测对象,针对每个位点的突变类型分别设计出扩增引物和延伸引物,针对各个目的区段同时进行多重PCR扩增和标记延伸,通过毛细管电泳分析,在一个反应管中一次可以获得以上12个位点的基因分型;
所述PAH基因168位点的扩增引物序列是5'-TTCATGCTTGCTTTGTCC-3’和5'-TTCAAATCTGCCTGTTCC-3’;
所述PAH基因331位点的扩增引物序列是5’-GGGTATAACCAAGGGAAGG-3’和5’-CTCAACAAGCAAGGCAGA-3’;
所述PAH基因IVS4—1位点的扩增引物序列与所述PAH基因482位点的扩增引物序列一致,为5’-GGGTATAACCAAGGGAAGG-3’和5’-CTCAACAAGCAAGGCAGA-3’;
所述PAH基因611位点的扩增引物序列是5’-CCCCGACTCCCTCTGCTAA-3和5’-TGCCTCCACATACTTGTCTTCC-3’;
所述PAH基因721位点的扩增引物序列与所述PAH基因728位点和782位点的扩增引物序列一致,为:5’-CGTCAAAGCCTATGTCCC-3’和5’-GCAATGAACCCAAACCTC-3;
所述PAH基因977位点的扩增引物序列是5’-CCCTCCAGAAACACCCTCATAG-3’和5’-CCCACAGCCATCATCAAATC-3’;
所述PAH基因1033位点的扩增引物序列与所述PAH基因977位点的扩增引物序列一致,为:5’-CCCTCCAGAAACACCCTCATAG-3’和5’-CCCACAGCCATCATCAAATC-3’;
所述PAH基因1068位点的扩增引物序列是:5’-GGGCTGTGATGTAGAAGG-3’和5’-CACCTTTGTCACCACCTC-3’;
所述PAH基因1238位点的扩增引物序列是5’-TAGGGAGGTGTCCGTGTT-3’和5’-TGTGGAAAGGTGGAATGA-3’。
2.根据权利要求1所述的中国人群苯丙酮尿症PAH基因筛查试剂盒,其特征在于,所述针对中国人群苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点的PCR延伸引物的终浓度分别为:PAH基因168位点、331位点、IVS4—1位点、482位点、611位点、721位点、728位点、782位点、977位点、1033位点、1068位点和1238位点分别为0.25μM、0.25μM、0.5μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM、0.25μM和0.5μM。
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