CN105755109B - 一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒 - Google Patents

一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系，筛选出41个较常见的苯丙氨酸羟化酶基因突变位点及4个最常见的6‑丙酮酰四氢生物碟呤合成酶(PTPS)基因(PTS)突变位点组成苯丙酮尿症基因突变检测体系。本发明成本低，通量高。与现有技术相比较，在一个体系中检测的突变位点最多，达到45个；综合成本最低，且总成本低于建立的DNA芯片技术，“分子开关”技术，高分辨率熔解曲线法和SNaPShot技术检测PAH基因突变的方法；但检测位点数量最多，是厦门大学建立的高分辨率熔解曲线法检测PAH基因突变位点数量的2倍，是DNA芯片技术和SNaPShot技术的4倍，是“分子开关”技术的6倍。

Description

一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因诊断领域和新生儿疾病筛查领域，具体而言，涉及一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒。
背景技术
苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种常见的氨基酸代谢异常疾病，由苯丙氨酸代谢途径中的苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)缺陷，导致苯丙氨酸转化成酪氨酸的途径受阻，从而造成苯丙氨酸和苯丙酮酸的积累，并影响脑内神经递质的合成。PKU为常染色体隐形遗传，主要引起新生儿神经系统发育异常，主要临床特征为智力低下、精神神经症状、脑电图异常、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等。苯丙氨酸在各国的发病率不同，平均约为1/15000人，而在我国的发病率为1/11144人，高于世界平均水平。目前，已经发现了PAH基因的560多种突变，涉及到PAH基因的13个外显子；在中国人群中发现的PAH致病突变也超过100种。针对PKU的13个外显子进行测序，可以寻找到95％的遗传病因，仍有5％的遗传病因尚不清楚。测序结果表明：40个热点PAH基因突变可以解释80％以上的遗传病因，这也为针对突变位点检测PKU遗传病因的方法提供了优势。
目前，报道的对PKU进行基因诊断的方法主要包括：聚合酶链反应-变性凝胶梯度电泳(PCR-DGGE)，聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，Sanger测序，高分辨率熔解曲线法，微型DNA芯片，“分子开关”技术，SNaPShot基因分型技术，第二代测序技术，聚合酶链-短重复序列多态分析(PCR-STR)。以上技术应用于PKU的基因诊断，都难以使检测通量和成本达到有效的平衡，大大限制了其在实验室的推广。
PCR-DGGE依据双链DNA片段熔解行为的不同，分离聚合酶链反应产物中长度相等但序列不同的DNA标记，可以用于基因突变位点的检测。最早，林长坤等利用PCR-DGGE方法对4例PKU家系进行基因诊断获得成功。但是，此技术不能确定突变的位置，类型，不是针对特定的位点进行检测；通量低，需要特殊的仪器。
PCR-SSCP是一种DNA单链凝胶电泳技术，可根据不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已经被广泛应用于癌基因、遗传病的基因诊断。张志等使用PCR-SSCP方法对PAH基因外显子进行检测，发现了11种突变和3种多态位点。该方法操作复杂，结果影响因素多，自动化程度低，并且通量低。
PCR-RFLP用特定的限制性内切酶水解目标基因的PCR扩增产物，然后分析酶解产物的电泳图谱特征，判断检测位点的基因型。PCR-RFLP技术已经广泛应用于PKU的基因诊断。但是，此技术操作繁琐，检出率低，仅能检测有内切酶识别的位点。
PCR-STR通过检测短重复序列分析子代染色体的来源，并且通过连锁分析来判定子代是否遗传了致病突变。研究结果表明，短重复序列多态性能够为PKU家系提供60％以上的遗传信息。但是，此方法并非直接检测致病突变，应用于基因诊断必须有阳性患儿作对照，并不能用于PKU遗传病因的直接诊断。
Sanger测序是基因检测最准确，突变检出率最高的技术。其可以对PAH基因进行全外显子分析，可一次检测500bp范围内的已知和未知突变。科学家已经通过Sanger测序发现了PAH基因的560多种突变。其在基因突变检测方面的不足之处在于，同时检测相隔较远的多个突变时，不能在一个体系中完成，随位点数量的增多成本会大大提升。此外，GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据。
高分辨率熔解曲线法检测基因突变是通过相同长度，不同序列的DNA片段的熔解温度不同，而区分已知位点的基因型；并且可以检测未知位点，但不能确定位置和突变类型。厦门大学已经建立了检测PAH基因20多个突变位点的方法。但是，此方法在一个体系中仅能检测5个左右的突变位点，通量较低，检测位点数量增加，反应体系也会增加，操作繁琐，成本也相应的提升。
微型DNA芯片技术是在固相支持物上原位合成(insitusynthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息。李云等已经成功建立了DNA芯片检测PAH基因13个突变位点的方法。此方法的不足之处是检测的位点较少，对PKU的基因诊断成功率较低，并且成本也较高。
“分子开关”技术是通过高保真聚合酶对错配碱基的识别，在PCR过程中，配对引物延伸，不配对引物不延伸的原理来分析基因突变的基因型。秦正红等建立了检测PAH基因7个热点突变的方法。此方法的不足之处在于每个体系只能检测一个位点，随着位点数量的增加，反应体系也相应增加，成本相应提升；并且，引物合成经过修饰，成本较高。
SNaPShot技术又称“微测序”，通过单碱基延伸，标记不同荧光的双脱氧核苷酸，毛细管电泳分析，根据不同位置的峰判定突变位点，根据峰的颜色判断突变位点的基因型。陈瑛等运用SNaPShot技术建立例检测PAH基因12个热点突变的方法。但是，此方法的通量仍然较低，突变检出率较低；检测更多的位点，成本也会相应增加。并且，此方法步骤多，操作较复杂。
二代测序技术能够在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，达到实时检测DNA序列的目的。2014年，中国临检中心组织了运用二代测序技术对全国PKU家系进行基因诊断的项目，分析了中国PKU患儿PAH基因的突变位点。但是，此方法成本太高，需要特定的设备，且设备成本太高，难以在普通实验室实现。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒，技术筛选出PAH基因的41个临床常见的突变位点和PTS基因4个常见突变位点，结合PCR技术，DNA链接技术和毛细管电泳技术，建立了一种快速，准确，快速的检测突变位点的体系，可以实现在一个体系中同时检测45个突变位点的基因型，在临床上应用于对PKU和BH4缺乏症的基因诊断领域和新生儿疾病筛查领域。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系，筛选出41个较常见的苯丙氨酸羟化酶基因突变位点及4个最常见的6-丙酮酰四氢生物碟呤合成酶(PTPS)基因(PTS)突变位点组成苯丙酮尿症基因突变检测体系，该体系包括以下反应步骤：
1)检测样本的多重PCR反应，包括14对特异的多重PCR引物，所述的多重PCR引物序列如SEQ ID NO.:1至SEQ ID NO.:28所示；
2)PCR产物纯化；
3)连接反应，包括45组检测探针，每组探针包含2条或者3条鉴别探针及1条通用探针，所述的检测探针序列如SEQ ID NO.:29至SEQ ID NO.:165所示；
4)荧光检测。
优选的，所述的多重PCR引物Tm在64-66℃，PCR产物长度在100-350bp之间。
一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断试剂盒，包括：
多重PCR引物混合物，
PCR缓冲液，
Taq酶，
ExoI/SAP酶，
连接缓冲液，
高温连接酶，
连接引物混合液，
ddH2O。
本发明的有益效果是:
1、成本低，通量高。与PCR-DGGE、PCR-RFLP、PCR-SCCP、PCR-STR、Sanger测序、高分辨率熔解曲线法、微型DNA芯片技术、“分子开关”技术和SNaPShot技术检测PAH基因突变的方法相比较，在一个体系中检测的突变位点最多，达到45个；综合成本最低，且总成本低于建立的DNA芯片技术，“分子开关”技术，高分辨率熔解曲线法和SNaPShot技术检测PAH基因突变的方法；但检测位点数量最多，是厦门大学建立的高分辨率熔解曲线法检测PAH基因突变位点数量的2倍，是DNA芯片技术和SNaPShot技术的4倍，是“分子开关”技术的6倍。
2、应用范围广。本发明技术可以对PTS基因的4个热点突变进行检测，从而对BH4缺乏症进行基因检测，可以检测出40％以上遗传病因对高苯丙氨酸血症进行分型，这是其他方法所不具备的。
3、操作简单，易于遗传实验室普及。较通量较高的SNaPShot基因分型技术和DNA芯片技术，本发明技术操作步骤少；与DNA芯片技术和高分辨率熔解曲线法相比，不需要特定的设备，只需遗传实验室常备的PCR仪和遗传分析仪即可实现，易于实验室普及。本方法检测可在一个工作日内完成，最低仅需10纳克的DNA即可，可对2个新生儿筛查滤纸片中提取的DNA进行检测，得到准确的检测结果。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为基于多重PCR和LDR技术的检测流程图；
图2为检测探针的结构示意图；
图3为3A各位点毛细管电泳总峰图；
图4为3A各位点毛细管电泳蓝色(FAM)荧光峰图；
图5为3A各位点毛细管电泳绿色(VIC)荧光峰图；
图6为3A各位点毛细管电泳黄色(NED)荧光峰图；
图7为3A各位点毛细管电泳红色(PET)荧光峰图；
图8为3B PAH:c.782G>A杂合突变；
图9为3C PAH:c.1238G>C杂合突变。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
本技术筛选出41个较常见的苯丙氨酸羟化酶基因突变位点及4个最常见的6-丙酮酰四氢生物碟呤合成酶(PTPS)基因(PTS)突变位点组成苯丙酮尿症基因突变检测体系，检测的突变位点信息见表1。该技术的实验流程为：1.检测样本的多重PCR反应，多重PCR引物信息见表2；2.PCR产物纯化；3.连接反应，检测探针序列见表3；4.荧光检测。检测体系实验流程较为简单，通量高，能在一个反应体系内同时对45个突变位点进行检测。在检测体系中，共设计了14对特异的多重PCR引物，PCR引物Tm在65℃左右，PCR产物长度在100-350bp之间；另设计了45组检测探针，每组探针包含2条或者3条鉴别探针及1条通用探针。
本体系中的45个苯丙酮尿症基因突变位点选取原则是：1.导致苯丙酮尿症和BH4缺乏症的致病突变，同一个基因的纯合突变或两个杂合突变即可导致苯丙酮尿症的发生；2.SCI文献报道突变频率相对较高的突变位点；3.参考苏州地区苯丙酮尿症患儿的PAH基因突变位点。
表1本体系检测45个基因突变位点的基本信息
表2.多重PCR引物序列及浓度信息
Primer Name Primer concentration Primer sequence
PAH-E02-F 1uL GCTTGCTTTGTCCATGGAGGTT
PAH-E02-R 1uL CATGGAAGTTTGCTACGACATTATCC
PAH-E03-F 1uL CTCCTCACCCTCCCCATTCTCT
PAH-E03-F3 1uL GATCTTGAGGCATGACATTGGTG
PAH-E03-R3 1uL TCAGAGCAGGCAGGCTACGTT
PAH-E03-R4 1uL TGCTGTTATTTTATGAAGACAGTGTGG
PAH-E04-F 1uL CCTGGTTCCCAAGAACCATTCA
PAH-E04-R 1uL CCCAGCCCTCGTGTAAATAGGA
PAH-E05-F 1uL GCCCCCATTCAAAGCATTCATA
PAH-E05-R 1uL CCCTCAACAAGCAAGGCAGACT
PAH-E06-F 1uL CAAGTGATGGCAGCTCACAGGT
PAH-E06-R 1uL AACTTTCTGCAGGGCCATTGAC
PAH-E07-F 1uL AAGCCTATGTCCCTGGGCAGTT
PAH-E07-R 1uL CATTGTGCCTGGCAACTGGTAG
PAH-E08-F 1uL TTCCATTCTTTCTGCCCATTCC
PAH-E08-R 1uL GGCAAAGCTGCGATCTGAAAAC
PAH-E10-F 1uL CCACTGACTCACATGCCAATCC
PAH-E10-R 1uL TCCTTGGTTCCTGTGAAGGTCA
PAH-E11-F 1uL GGAATCGGGGTGAGATGAGAGA
PAH-E11-R 1uL CCCAGAGCTAGTGGCTCACCTT
PAH-E12-F 1uL CCCTTCACTCAAGCCTGTGGTT
PAH-E12-R 1uL ATGGCGATGGTAGGGAAAGACA
PTS-E02-1F 1uL AGATAGTAAGCCACTTTGCGGATCA
PTS-E02-1R 1uL CCCCTTGTTCCACAGCAACTG
PTS-E02-2F 1uL TTGGGAAATGCAACAATCCAAA
PTS-E02-2R2 1uL CAAGGCTCAAAGCATTCACACTG
PTS-E05-F 1uL TGGAACAATTTGGAATTTGAGTCGTA
PTS-E05-R 1uL ATACAGTGCCACCCACCTCACC
表3.突变位点检测探针的序列信息
参照图1、图2所示，具体实验操作步骤：
1、DNA样本准备
选取1个PKU患儿样本和1个非PKU患儿的DNA足跟血滤纸血片，运用新生儿血片打孔钳打取2个直径3.2mm的血斑；运用DNA提取试剂盒抽提全基因组DNA，运用NanoDropTM2000测量样本的质量及浓度，然后将样本稀释到工作浓度5～10ng/μl。样本DNA提取对象也可为外周血和组织。
2、PCR反应
取iMLDRTM多重SNP分型试剂盒中的多重PCR引物混合物1.5ul以及PCR缓冲液7ul与4ul样本DNA，0.07ulTakraTaq混匀。PCR循环程序：95℃2min；11cycles x(94℃20s,65℃-0.5℃/cycle 40s,72℃1min30s)；27cycles x(94℃20s,59℃30s,72℃1min30s)；72℃2min；4℃for ever。
3、多重PCR产物纯化
在PCR产物中加入试剂盒中的ExoI/SAP酶1ul，37℃温浴1小时,然后75℃灭活15分钟。
4、双连接反应
反应体系准备：连接分为两个体系进行，分别取试剂盒中的连接缓冲液4ul、高温连接酶0.5ul、连接引物混合液Ⅰ(Ⅱ)1.5ul与3)中的纯化后多重PCR产物3ul、ddH2O 1ul混匀。
连接程序：38cycles x(94℃1min,58℃4min)；4℃for ever。
5、连接产物上ABI3130XL测序仪
分别取0.5μl稀释后的两个连接体系的产物混合，与0.1μl Liz500SIZESTANDARD，8.9μl Hi-Di混匀，95℃变性5分钟后上ABI3130XL测序仪。
6、因所用突变位点检测引物带有荧光，通过毛细管电泳检测不同颜色荧光及不同大小的扩增片断，检测得到的峰图(参照图3至图7所示)与表4的信息比对以分析得出各检测位点是否发生突变，以及判断该突变为纯合突变还是杂合突变。对比显示图3所示样本各位点均为单峰，说明该样本中检测45个位点均未发生突变，为正常对照样本；图8所示为PAH:c.782位点杂合突变的样本，为c.782G>A杂合突变；图9所示为PAH:c.1238位点杂合突变的样本，为PAH:c.1238G>C杂合突变。
表4峰型对比信息表
本发明的优越性在于通过对现有多重核酸分子扩增技术加以改进，设计特定的检测探针，优化特定的检测体系组分和反应条件，能够在一个体系中同时检测45个突变位点，包括PAH基因的41个突变位点，和PTS基因的4个热点突变。这些位点是根据文献资料报道的中国人群PKU患儿的突变热点，及我们发现的苏州地区患儿的突变热点整理选择得到。与PCR-DGGE、PCR-RFLP、PCR-SCCP、PCR-STR、Sanger测序、高分辨率熔解曲线法、微型DNA芯片技术、“分子开关”技术和SNaPShot技术检测PAH基因突变的方法相比较，在一个体系中检测的突变位点最多，达到41个；综合成本最低，且总成本低于建立的DNA芯片技术，“分子开关”技术，高分辨率熔解曲线法和SNaPShot技术检测PAH基因突变的方法；但检测位点数量最多，是厦门大学建立的高分辨率熔解曲线法检测PAH基因突变位点数量的2倍，是DNA芯片技术和SNaPShot技术的4倍，是“分子开关”技术的6倍。并且，本发明可以检测到BH4缺乏症40％以上的遗传病因，这是其他技术所不具备的。本方法检测可在一个工作日内完成，最低仅需10纳克的DNA即可，可对2个新生儿筛查滤纸片中提取的DNA进行检测，得到准确的检测结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种苯丙酮尿症基因筛查和诊断试剂盒，其特征在于，包括：
多重PCR 引物混合物，所述的多重PCR 引物序列如SEQ ID NO.:1 至SEQ ID NO.:28所示；
PCR 缓冲液；
Taq 酶；
ExoI/SAP 酶；
连接缓冲液；
高温连接酶；
连接引物混合液，所述连接引物混合液中包括45 组检测探针，每组探针包含2 条或者3 条鉴别探针及1 条通用探针，所述的检测探针序列如SEQ ID NO.:29 至SEQ ID NO.:165所示；
ddH2O。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544431A (zh) * 2016-10-28 2017-03-29 林巍 高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变的测序文库构建方法
CN106841427B (zh) * 2016-12-30 2019-05-14 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种检测pku和cah的串联质谱试剂盒
CN107058541A (zh) * 2017-04-21 2017-08-18 上海杰傲奉生医学检验所有限公司 苯丙酮尿症相关基因拷贝数变异检测试剂盒
CN107723358B (zh) * 2017-10-26 2021-03-19 国家卫生健康委科学技术研究所 苯丙酮尿症检测试剂盒
CN107828883B (zh) * 2017-12-08 2020-12-25 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种苯丙酮尿症的检测引物组、试剂盒及基因突变检测方法
CN111100908B (zh) * 2018-10-26 2022-07-12 厦门大学 一种检测核苷酸片段缺失的方法和试剂盒
CN111394446B (zh) * 2019-01-02 2022-11-01 北京迈基诺基因科技股份有限公司 一种用于检测苯丙酮尿症相关致病基因的试剂盒及其专用捕获探针组
CN109554478B (zh) * 2019-01-17 2021-11-23 苏州市立医院 检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物
CN110484611B (zh) * 2019-05-22 2020-11-17 浙江大学 一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒
CN112143788A (zh) * 2020-09-10 2020-12-29 长沙金域医学检验实验室有限公司 一种鉴定pah基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436616A (zh) * 2013-08-23 2013-12-11 苏州市立医院 中国人群苯丙酮尿症pah基因筛查试剂盒
CN104031990A (zh) * 2014-05-19 2014-09-10 潮州凯普生物化学有限公司 苯丙酮尿症pah基因检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436616A (zh) * 2013-08-23 2013-12-11 苏州市立医院 中国人群苯丙酮尿症pah基因筛查试剂盒
CN104031990A (zh) * 2014-05-19 2014-09-10 潮州凯普生物化学有限公司 苯丙酮尿症pah基因检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
目标序列捕获二代测序技术在苯丙酮尿症基因诊断中的应用;陈瑛等;《复旦学报（医学版）》;20150531;第42卷(第3期);403-408

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