CN104031990A - 苯丙酮尿症pah基因检测试剂盒 - Google Patents
苯丙酮尿症pah基因检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种苯丙酮尿症PAH基因检测试剂盒，包括：（1）一个基因芯片，其上带有PAH基因的13个突变位点及其正常对照互补的核苷酸序列探针，其中探针为SEQ ID Nos：1-26或与SEQ ID Nos：1-26互补的序列；（2）各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，引物的DNA序列为SEQ ID Nos：27-40。本发明的PAH基因检测试剂盒提供了检测PAH基因的13个常见突变位点联合检测平台，可实现同步联合检测、提高检测特异性、降低成本、缩短检测时间，对开展苯丙酮尿症人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因领域，具体是用于诊断苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)ＰＡＨ基因的检测试剂盒。
背景技术
苯丙酮尿症是由于苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)代谢途径中酶缺陷所致的常见的常染色体隐性遗传病。98—99％的PKU是由于苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)活性下降或显著缺乏所致，PAH活性下降使Phe不能转化为酪氨酸(tyrosine，Tyr)，导致血液组织中Phe及其旁路代谢产物的堆积及Tyr合成减少。PKU的发病率有种族和地区差异，我国为1／10000至1／16000，推算人群中PAH基因突变的携带率(即杂合子)约为1/53。
PAH基因定位于染色体12q24.1，大约由1.5Mb碱基组成。PAH基因是割裂基因，编码区包含13个外显子和12个内含子。转录1353bp的mRNA，翻译成含451个氨基酸的酶单体，单体聚合成有功能的PAH。PAH通常以具有催化活性的四聚体形式存在，在一定的条件下可以分解成没有活性的二聚体。
PAH基因数据库登记的突变已经有500余种，国内发现的有40余种。PKU是单基因突变疾病，大部分是复合杂合子，主要位于编码区的小的遗传学变化。在PAH基因中只影响一个或几个氨基酸，其对酶活性的影响主要依赖于突变的形式和位置。PAH基因突变类型多样，可分为致病突变和沉默突变。其中有300余种是错义突变占61．93％，其余依次为缺失突变13．45％、剪接位点突变10．89％，沉默突变6．06％，无义突变4．92％等。致病突变影响PAH基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响PAH的活性。沉默突变对PAH的活性无影响。PAH基因突变位置多变，所有的外显子、内含子、上下游的非翻译区均发现突变，致病突变大多位于外显子或内外显子的交接区。发生突变的基因的区域频率亦不同，其中E7占16.10％，E6占13.61％，余依次为E10、E11、E12等。PKU的突变呈现明显的异质性，不同种族和地区人群之间PKU突变部位及分布具有较大的差异。欧洲人PKU患者的常见突变位于外显子12和内含子12，分别为R408Q(31％)和IVSl2nt+lG>A(11％)；东方PKU患者PAH基因突变数较多,涉及13个外显子。常见的突变位于外显子7、12、6、3和11等，主要位点为R413、R243Q、Y240C、R252Q、R111X、Y356X、IVS4nt-1G＞A等。
目前，关于苯丙酮尿症常规的临床诊断方法主要有血苯丙氨酸测定、尿液蝶呤谱分析、血红细胞二氢生物喋啶还原酶活性测定、头颅核磁共振检查等，这些传统方法不仅不能对患者进行早期诊断，而且对于明确鉴别杂合子和正常个体有一定困难。
目前针对引起苯丙酮尿症发病的根本原因—PAH基因的临床检测方法还未建立，在科研研究方面关于检测PAH基因突变的方法主要有变性梯度凝胶电泳 、单链构象多态性（SSCP ）分析变性高效液相色谱分析 (DHPLC) 、DNA测序等。DGGE、SSCP、DHPLC操作均较为费时费力。DNA测序虽然是检测基因突变的金标准，但由于成本较高，不适合PAH基因突变的常规临床检测。
因此研制和开发一种特异性强、敏感性高同时又快速、经济，能同时检验多个位点突变的PAH基因检测方法显得尤为重要，对苯丙酮尿症(PKU)的诊断和治疗起着重要的作用。
发明内容
本发明目的是为了弥补现有化学试验方法对苯丙酮尿症检测的局限性，提供一种苯丙酮尿症ＰＡＨ基因检测试剂盒。
本发明的苯丙酮尿症ＰＡＨ基因检测试剂盒，包括：
（1）一个基因芯片，其上带有PAH基因的13个突变位点及其正常对照互补的核苷酸序列探针（共26条探针），其中探针为SEQ ID Nos：1-26或与SEQ ID Nos：1-26互补的序列，具体序列如下：
名称 序列号 序列
R111X PN SEQ ID No.1 ATGAGCTTTCACGAGATAA
IVS4 PN SEQ ID No.2 CTCTCCGTTCCTTATCTG
Y204C PN SEQ ID No.3 TGCTTGCTATGAGTACAA
F240S PN SEQ ID No.4 ACTGGTTTCCGCCTCCGA
R241C PN SEQ ID No.5 ACTGGTTTCCGCCTCC
R243Q PN SEQ ID No.6 CCTCCGACCTGTRGCT
R252Q PN SEQ ID No.7 TCCTCTCGGGATTTCTT
IVS7 PN SEQ ID No.8 CCGAACCGTGAGTACTG
W326X PN SEQ ID No.9 GATTTACTGGTTTACTGTGG
Y356X PN SEQ ID No.10 CCTACAGTACTGCTTATCAGA
V399V PN SEQ ID No.11 GGAGAAAGTAAGGTGAGGT
R408Q PN SEQ ID No.12 CAATACCTCGGCCCTTCT
R413P PN SEQ ID No.13 CTCAGTTCGCTACGACC
R111X PM SEQ ID No.14 ATGAGCTTTCATGAGATAA
IVS4 PM SEQ ID No.15 CTCTCCGTTCTTTATCTG
Y204C PM SEQ ID No.16 TGCTTGCTATGAGTACAA
F240S PM SEQ ID No.17 ACTGGTTTTCGCCTCCGA
R241C PM SEQ ID No.18 ACTGGTTTCTGCCTCC
R243Q PM SEQ ID No.19 GCCTCCAACCTGTRGCT
R252Q PM SEQ ID No.20 CCTCTCAGGATTTCTTGG
IVS7 PM SEQ ID No.21 CCGAACCGAGAGTACTGT
W326X PM SEQ ID No.22 GATTTACTGATTTACTGTGG
Y356X PM SEQ ID No.23 CCTACAGTAATGCTTATCAGA
V399V PM SEQ ID No.24 GGAGAAAGTTAGGTGAGGT
R408Q PM SEQ ID No.25 CAATACCTCAGCCCTTCT
R413P PM SEQ ID No.26 CTCAGTTCCCTACGACC
（2）各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，PAH基因特异性扩增引物的DNA序列为SEQ ID Nos：27-40，具体序列如下：
名称 序列号 序列
E3-F SEQ ID No.27 AACTCTCCATTTTGTTGCGT
E3-R SEQ ID No.28 GAGTGGACATAGGTTGGGGA
IVS4-F SEQ ID No.29 GCGACGTTGAAACTGAATCT
IVS4-R SEQ ID No.30 TGAGAATGAGAGATGTGGCTG
E6-F SEQ ID No.31 CTGCCCTGCTTGAGACAC
E6-R SEQ ID No.32 AGTCCACATCAGGGTCAATG
E7-F SEQ ID No.33 CTATGTCCCTGGGCAGTTAT
E7-R SEQ ID No.34 AGATAGACCAGACTGATTGGAGA
E10-F SEQ ID No.35 CAGGTATCCCTTCATCCAGT
E10-R SEQ ID No.36 CTCCTGTCATCCTTTGGTGA
E11-F SEQ ID No.37 ATGCAGCAGGGAATACTGAT
E11-R SEQ ID No.38 TGACTGGTGCCACTCATCT
E12-F SEQ ID No.39 CTCTAGGGAGGTGTCCGTGT
E12-R SEQ ID No.40 AGCACCTCCATGTAAGCCA
上述的26种探针包括PAH基因常见的13个位点突变（R111X M、IVS4 M、Y204C M、F240S M、R241C M、R243Q M、R252Q M、IVS7 M、W326X M、Y356X M、V399V M、R408Q M、R413P M）及突变的正常对照点（R111X N、IVS4 N、Y204C N、F240S N、R241C N、R243Q N、R252Q N、IVS7 N、W326X N、Y356X N、V399V N、R408Q N、R413P N）。本发明针对各种突变及其正常对照的探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5′或3′端进行胺基化处理。本发明设计的探针有着合理的碱基成分、Tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。
本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
本发明上述的试剂盒，所述引物的5′端标记有生物素。
本发明所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：
（1）DNA探针的制备：合成与常见PAH基因突变互补的5′或3′末端经过胺基化的DNA片段
从PAH基因突变区中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成5′或3′末端经过胺基化的DNA片段；
（2）固定探针：将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上
先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的氨基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固地将探针固定在膜上；
（3）制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。
利用本发明所述的试剂盒检测PAH基因的方法包括以下步骤：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA；对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片表面上结合的DNA。
具体步骤如下：
第一步：扩增样品
将待检样品中提取得DNA通过本发明特异性引物进行PCR扩增，所用引物5′端标记生物素，扩增得到5′端带有生物素标记的DNA产物；
第二步：杂交
使用核酸导流杂交技术平台或者任何形式的核酸水平上的杂交技术，将上述扩增得到的DNA与基因芯片上面分布的核苷酸探针进行反应；
第三步：显色
在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利于NBT/BCIP系统显色，肉眼直接观察结果或者利用相应的仪器读取信号并进行分析。
本发明所述PAH基因检测试剂盒提供了检测PAH基因的13个常见突变位点联合检测平台，可实现同步联合检测、提高检测特异性、降低成本、缩短检测时间，对开展苯丙酮尿症人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。
附图说明
以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。
图1为本发明的基因芯片上探针的具体分布位置的图片，每个位置代表不同的基因突变。
图2.1为R111X M突变纯合子的检测结果图片。
图2.2为IVS4M突变纯合子的检测结果图片。
图2.3为Y204C M突变纯合子的检测结果图片。
图2.4为F240S M突变纯合子的检测结果图片。
图2.5为R241C M突变纯合子的检测结果图片。
图2.6为R243Q M突变纯合子的检测结果图片。
图2.7为R252Q M突变纯合子的检测结果图片。
图2.8为IVS7 M突变纯合子的检测结果图片。
图2.9为W326X M突变纯合子的检测结果图片。
图2.10为Y356X M突变纯合子的检测结果图片。
图2.11为V399V M突变纯合子的检测结果图片。
图2.12为R408Q M突变纯合子的检测结果图片。
图2.13为R413P M突变纯合子的检测结果图片。
图2.14为R111XM/N突变杂合子的检测结果图片。
图2.15为R111X与R413P复合纯合突变型的检测结果图片。
图2.16为R111XM/N与R413PM/N复合突变型杂合子的检测结果图片。
图2.17为R111XM/N突变杂合子与R413PM突变纯合子复合突变型的检测结果图片。
图2.18为阴性的检测结果图片。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行详细的说明。
实施例中，20%的EDAC溶液、0.1% SDS、 0.25%脱脂奶粉、0.05%硫柳汞、0.05% 叠氮钠均是指质量比，0.1% Tween 20 是指体积比。
步骤1 用于检测PAH基因芯片的制备
步骤1-1 探针的设计
根据PAH基因常见的13个突变位点（R111X、IVS4、Y204C、F240S、R241C、R243Q、R252Q、IVS7、W326X、Y356X、V399V、R408Q、R413P）,共设计了26条DNA探针（SEQ ID Nos：1-26），探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5′或3′端进行胺基化处理。
步骤1-2 DNA探针的点样和固定
1）探针的点样和排列
在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用探针稀释液（pH8.4的0.5M Na2CO3和0.5M NaHCO3的溶液）混合，进行点样。完成DNA探针的合成之后，启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
2）DNA探针的固定方法
对尼龙膜进行处理，首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200mL的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，转入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。
通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述的尼龙膜上，每滴0.4μL。点膜结束后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。
步骤2 用于扩增待检样品中DNA的特异性引物的设计及检测方法
步骤2-1 用于待检样品中DNA的特异性PCR引物的设计及PCR扩增
根据PAH基因突变的序列资料设计了7对引物用于检测。分两个PCR反应体系进行扩增，每30μL反应体系包括了27.5μl PCR MIX 、0.5μl PAH基因DNA酶聚合酶、2μl处理好的样品DNA。反应条件为：95°C 10min，95°C变性30 s、57°C退火30s、72°C延伸30s，共40个循环，最后一步72°C延伸7min。获得待检测DNA样品。
步骤2-2 利用DNA芯片进行检测
将步骤2-1中获得的待检测DNA样品在步骤1中制备的基因芯片进行检测，DNA样品和基因芯片中尼龙膜上的探针反应，最后根据显色情况进行判断。
将获得的PAH基因的两管扩增产物在95°C下变性5分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到预先温浴到45°C的0.8 mL杂交液（2×SSC/0.1%SDS）中，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于步骤1制得的基因芯片，45°C杂交20分钟，然后用溶液WB1（0.5×SSC/0.1%SDS，42°C温浴）清洗3遍。加入0.5mL封阻液（0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞），25°C封闭5分钟。抽干后加入0.5mL的酶标液（TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶），酶标5分钟。用0.8mL溶液A（TBS，0.1% Tween20及0.05%叠氮钠）清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液（NBT/BCIP），避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。
序列表
<110> 潮州凯普生物化学有限公司
<120> 苯丙酮尿症ＰＡＨ基因检测试剂盒
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gcgacgttga aactgaatct 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IVS4-R
<400> 30
tgagaatgag agatgtggct g 21
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E6-F
<400> 31
ctgccctgct tgagacac 18
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E6-R
<400> 32
agtccacatc agggtcaatg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E7-F
<400> 33
ctatgtccct gggcagttat 20
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E7-R
<400> 34
agatagacca gactgattgg aga 23
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E10-F
<400> 35
caggtatccc ttcatccagt 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E10-R
<400> 36
ctcctgtcat cctttggtga 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E11-F
<400> 37
atgcagcagg gaatactgat 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E11-R
<400> 38
tgactggtgc cactcatct 19
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E12-F
<400> 39
ctctagggag gtgtccgtgt 20
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E12-R
<400> 40
agcacctcca tgtaagcca 19
Claims (4)
1.苯丙酮尿症ＰＡＨ基因检测试剂盒，包括：
（1）一个基因芯片，其上带有PAH基因的13个突变位点及其正常对照互补的核苷酸序列探针，其中探针为SEQ ID Nos：1-26或与SEQ ID Nos：1-26互补的序列；
（2）各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，引物的DNA序列为SEQ ID Nos：27-40。
2. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
3. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。
4. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5′端标记有生物素。
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