CN108048565A - 一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用，所述引物为能够扩增ApoE基因的rs429358位点及rs7412位点的通用性引物，并结合带有不同荧光基团的特异性探针，辅佐以内参系统提高稳定性，使用多个荧光通道检测，实现一管同时检测两个位点基因多态性的目标，操作简单，节约成本，可适用于EDTA、枸橼酸钠抗凝全血的直接检测或提取的DNA的检测，具有广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用。
背景技术
人ApoE的基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q132)上，基因全长为3.7kb，含有4个外显子和3个内含子，其cDNA长为1.163kb。ApoE蛋白前体由317个氨基酸组成，含有18个氨基酸信号肽，成熟的ApoE蛋白由299个氨基酸组成。ApoE基因的两个功能性SNPrs429358(c.388T>C，Cys130Arg)和rs7412(c.526C>T，Arg176Cys)构成3种单倍型，分别是E2(rs429358T-rs7412T)、E3(rs429358T-rs7412C)、E4(rs429358C-rs7412C)，共构成6种不同的基因型：3种纯合型(E2/E2、E3/E3、E4/E4)和三种杂合型(E3/E4、E2/E3、E2/E4)，其基因频率因不同的种族和地区存在差异，在一般人群中，E2约占8％，E3约占78％，E4占14％。
近年来研究发现，ApoE基因多态性与冠心病(coronaryheartdisease，CHD)、高脂血症、脑梗塞、Alzheimer病(AD)、动脉粥样硬化等疾病有着密切的关系。携带有E4/E4，E4/E3基因型的人群患老年痴呆、脑梗塞、冠心病、动脉粥样硬化等疾病的风险大大增加，而E2基因携带者患相应疾病的风险相对较小且降脂效果更好。
目前，ApoE基因多态性检测的方法主要有ARMS-荧光PCR法，芯片杂交法及测序法等方法。ARMS-荧光PCR法检测灵敏度较高，但是其需要多个PCR管进行操作，操作复杂易出错，试剂成本较高。芯片杂交法通量高，成本相对较低，但是由于其方法学的限制，开盖操作很容易造成交叉污染，极易出现假阳性，并且检测时间较长；而测序法本身的灵敏度稍低，检测周期较长，且仪器成本较高。
CN104862402A提供了一种检测ApoE基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括分别检测rs429358位点和rs7412位点的两组引物；第一组引物：rs429358位点的突变型特异性上游引物、rs429358位点的野生型特异性上游引物和rs429358位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第一下游引物；第二组引物：rs7412位点的突变型特异性上游引物、rs7412位点的野生型特异性上游引物和rs7412位点的突变型特异性上游引物与野生型特异性上游引物共用的第二下游引物。CN106011298A提供了一种ApoE试剂盒、引物及其用途，两个SNP位点是否具有已知突变的测定方法。其中，该方法包括：利用第一引物和第二引物对核酸样本进行PCR扩增，并且在PCR扩增体系中加入核酸探针，核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列；检测反应体系的发光，以便确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变，第一引物的近3’端包含与两个预定位点之一已知突变对应的碱基，第二引物的近3’端包含与另一个已知突变对应的碱基，核酸探针具有：发光基团，发光基团形成于核酸探针的5’端，调节基团，调节基团形成于核酸探针的3’端，并且调节基团可以调节发光基团的发光。CN103184266A公开了一种ApoE基因检测试剂盒及扩增方法和检测方法。所述试剂盒对ApoE基因上明显改变其产物活性的两个常见的多态性位点进行分型，包括：rs429358SNP位点和rs7412SNP位点。试剂盒包含野生型2×扩增缓冲液、突变型2×扩增缓冲液、聚合酶，两种缓冲液中分别含有对应SNP野生型和突变型表型的序列特异性引物和内参引物，可在两个多重PCR反应中完成对上述两个SNP位点的分型，从而对ApoE基因进行基因分型，为该基因所表达的酶的活性的预测提供分子生物学依据。但上述现有技术操作复杂，试剂材料等成本高昂，有待进一步提高。
因此，对于现有的检测方法做出改进，提出一种简洁高效的检测体系及试剂盒，提高可操作性，对于基因多态性的检测具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用，通过对ApoE基因的rs429358位点及rs7412位点设计通用性引物，在同一反应管中，使用多个荧光通道，同时进行检测，达到检测两个位点基因多态性的问题，操作简单，节约成本，可适用于EDTA、枸橼酸钠抗凝全血的直接检测或提取的DNA的检测。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测ApoE基因多态性的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
所述通用引物中的上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列如下：
5’-AGTTGAAGGCCTACAAATCG-3’.
所述通用引物中的下游引物如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2的核苷酸序列如下：
5’-GCTGCCCATCTCCTCCATC-3’.
在本发明中，发明人在检测ApoE基因多态性的过程中，结合荧光定量PCR的反应过程及特性，发现ApoE基因的rs429358位点及rs7412位点距离较近，相隔约130个碱基序列，为化简操作步骤，解决传统方法需要多个PCR管进行操作，操作复杂易出错，试剂成本较高的缺点，发明人设计一对通用性引物进行PCR扩增，通过一步反应即可实现对两个检测位点的扩增。
第二方面，本发明提供一种检测ApoE基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的引物。
优选地，所述试剂盒还包括依据ApoE基因的rs429358位点设计的两条特异性荧光探针及依据rs7412位点设计的两条特异性荧光探针。
优选地，所述试剂盒中的特异性荧光探针的5’端带有不同的荧光基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、ROX、CY3、CY5、VIC、NFQ-MGB、TAMRA或BHQ中的任意一种。
优选地，所述特异性荧光探针的3’端带有荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-6所示。
所述特异性探针中，针对388位点野生型的探针如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ IDNO.3的核苷酸序列如下：5’-AGGACGTGTGCGGCC-3’.
所述特异性探针中，针对388位点突变型的探针如SEQ ID NO.4所示，所述SEQ IDNO.4的核苷酸序列如下：5’-AGGACGTGCGCGGCC-3’.
所述特异性探针中，针对526位点野生型的探针如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ IDNO.5的核苷酸序列如下：5’-TGCAGAAGCGCCTGGC-3’.
所述的特异性探针中，针对526位点突变型的探针如SEQ ID NO.6所示，所述SEQID NO.6的核苷酸序列如下：5’-TGCAGAAGTGCCTGGC-3’.
优选地，所述试剂盒还包括一组内参系统。
优选地，所述内参系统包括两条内参引物和一条内参探针。
本发明中，所述内参系统是使用人基因组内的一段保守序列设计的引物和探针，旨在质控整个扩增反应及样本的好坏。
优选地，所述内参探针的5’端带有与第二方面所述试剂盒中的探针不同的荧光基团，3’端带有荧光淬灭基团。
优选地，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
所述内参基因的上游引物如SEQ ID NO.7所示，所述SEQ ID NO.7的核苷酸序列如下：5’-CTACCCCCCAGGATGCAA-3’.
所述内参基因的下游引物如SEQ ID NO.8所示，所述SEQ ID NO.8的核苷酸序列如下5’-CAGGTGGCTGGCTTTCACT-3’.
所述内参探针如SEQ ID NO.9所示，所述SEQ ID NO.9的核苷酸序列如下：5’-CTATTGCCCCTGGCACACCA-3’.
示例性的，所述探针序列的修饰有：388位点野生型探针的5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；388位点突变型探针的5’端修饰VIC，3’端修饰NFQ-MGB；526位点野生型探针的5’端修饰CY3，3’端修饰NFQ-MGB；526位点突变型探针的5’端修饰CY5，3’端修饰NFQ-MGB；内参基因探针5’端修饰ROX，3’端修饰NFQ-MGB；其中使用的荧光可以是市面上已有的任意一种荧光，如FAM、ROX、CY3、CY5、VIC、NFQ-MGB、TAMRA或BHQ等等，各基因型所使用的荧光标记不仅限于上述所写的。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液。
优选地，所述PCR反应液包括Taq酶、UNG酶和dNTP的预混液。
本发明使用的PCR反应液为能够直接扩增全血等样本的Taq酶预混液，可直接用于EDTA抗凝、枸橼酸钠抗凝全血、淋巴液、组织液的检测，直接用于全血或其他样本扩增的PCR反应液可以换成普通只用于DNA扩增的反应液，但此时应结合相应的DNA提取试剂盒进行DNA的提取工作。
第三方面，本发明提供一种检测ApoE基因多态性的方法，包括如下步骤：
(1)配置反应体系：将第一方面所述的引物、第二方面所述试剂盒中的探针和第二方面所述试剂盒中的内参系统与PCR反应液在同一管内混合，加入待测样品，混匀后瞬时离心；
(2)进行荧光定量PCR扩增；
(3)于每个循环的60℃结束后收集荧光，进行结果分析。
其中，步骤(1)的反应体系中的引物、探针、内参系统本领域技术人员可根据实际应用调整浓度，本发明中的反应体系如下：
2×PCR反应液12.5μL，通用引物各1μL(浓度为10μM)，4个特异性探针各0.5μL(浓度为10μM)，内参引物各1μL(浓度为10μM)，内参探针0.5μL(浓度为10μM)，加水5μL。
优选地，步骤(1)所述样品用量≤1μL。
优选地，步骤(2)所述PCR扩增的步骤为：50℃，2min，95℃，5min；98℃，10s，60℃，40s，45个循环；25℃1min。
检测结果的分析如下：内参所在的ROX荧光通道的扩增曲线正常(即CT值<45)的前提下，FAM、VIC、CY3、CY5中扩增曲线的CT值<45，则其对应通道所代表的基因型别为阳性，其中每一次检测中，FAM及VIC通道应至少有一个的CT值<45，CY3及CY5通道应至少有一个的CT值<45。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物和/或第二方面所述的试剂盒用于检测ApoE基因多态性。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物和/或第二方面所述的试剂盒用于制备冠心病、高脂血症、脑梗塞、阿兹海默病或动脉粥样硬化中的任一种疾病或至少两种疾病的组合的药物或试剂的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的引物能够通过直接扩增出ApoE基因的rs429358位点及rs7412位点两个位点，与带有不同荧光基团的探针、内参引物和PCR反应液组装成试剂盒，能够在单管同时检测两个位点的多态性，只需配制一管扩增体系即可完成两个位点的检测，节省了试剂和耗材的使用，可操作性强，减少试剂配制出错的几率，节约成本，测灵敏度高，特异性强；加有内参系统，可质控样本质量和操作的准确性，结果判读简便易懂，只需依据是否有对应扩增曲线来判定具体位点的多态性情况。
附图说明
图1为本发明的E3/E3扩增曲线图，其中，1为FAM通道(388野生)，2为VIC通道(388突变)，3为CY3通道(526野生)，4为CY5通道(526突变)，5为ROX通道(内参基因)；
图2为本发明的E2/E2扩增曲线图，其中，1为FAM通道(388野生)，2为VIC通道(388突变)，3为CY3通道(526野生)，4为CY5通道(526突变)，5为ROX通道(内参基因)；
图3为本发明的E4/E4扩增曲线图，其中，1为FAM通道(388野生)，2为VIC通道(388突变)，3为CY3通道(526野生)，4为CY5通道(526突变)，5为ROX通道(内参基因)；
图4为本发明的E2/E4扩增曲线图，其中，1为FAM通道(388野生)，2为VIC通道(388突变)，3为CY3通道(526野生)，4为CY5通道(526突变)，5为ROX通道(内参基因)；
图5为本发明的E3/E4扩增曲线图，其中，1为FAM通道(388野生)，2为VIC通道(388突变)，3为CY3通道(526野生)，4为CY5通道(526突变)，5为ROX通道(内参基因)；
图6为本发明的E2/E3扩增曲线图，其中，1为FAM通道(388野生)，2为VIC通道(388突变)，3为CY3通道(526野生)，4为CY5通道(526突变)，5为ROX通道(内参基因)。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品，检测的可用机型包括：ABI 7500，ABI 7300，罗氏480，宏石，MX3000P等。
实施例1引物探针的设计和试剂盒的组装
依据ApoE基因的388位点及526位点设计特异性探针及同时扩增两个位点的通用引物；选取人基因组的一段保守序列进行内参基因引物探针的设计，引物探针的合成纯化在上海生工生物进行，具体的引物探针序列如下：
通用引物的上游引物的核苷酸序列为F：SEQ ID NO.1，所述SEQ ID NO.1的序列如下：5’-AGTTGAAGGCCTACAAATCG-3’；
通用引物的下游引物的核苷酸序列为R：SEQ ID NO.2，所述SEQ ID NO.2的序列如下：5’-GCTGCCCATCTCCTCCATC-3’；
388位点野生型探针的核苷酸序列为P1：SEQ ID NO.3，所述SEQ ID NO.3的序列如下：5’-AGGACGTGTGCGGCC-3’，其中5’端修饰FAM，3’端修饰NFQ-MGB；
388位点突变型探针的核苷酸序列为P2：SEQ ID NO.4
所述SEQ ID NO.4的序列如下：5’-AGGACGTGCGCGGCC-3’，其中5’端修饰VIC，3’端修饰NFQ-MGB；
526位点野生型探针的核苷酸序列为P3：SEQ ID NO.5
所述SEQ ID NO.5的序列如下：5’-TGCAGAAGCGCCTGGC-3’，其中5’端修饰CY3，3’端修饰NFQ-MGB；
526位点突变型探针的核苷酸序列为P4：SEQ ID NO.6
所述SEQ ID NO.6的序列如下：5’-TGCAGAAGTGCCTGGC-3’，其中5’端修饰CY5，3’端修饰NFQ-MGB；
内参基因的上游引物的核苷酸序列为F1：SEQ ID NO.7
所述SEQ ID NO.7的序列如下：5’-CTACCCCCCAGGATGCAA-3’；
内参基因的下游引物的核苷酸序列为R1：SEQ ID NO.8
所述SEQ ID NO.8的序列如下：5’-CAGGTGGCTGGCTTTCACT-3’；
内参基因的下游引特异性探针的核苷酸序列为P5：SEQ ID NO.9
所述SEQ ID NO.9的序列如下：5’-CTATTGCCCCTGGCACACCA-3’，其中5’端修饰ROX，3’端修饰NFQ-MGB；
将上述探针、引物、PCR反应液(包括Taq酶、UNG酶、dNTP的预混液或仅包含适用于DNA扩增的反应液)、说明书和其他常规试剂组装成试剂盒。
实施例2
1、获取样品；
从患者体内获取全血样品，样本类型包括EDTA抗凝或枸橼酸钠抗凝全血等。
2、采用实施例1组装的包括Taq酶和UNG酶的预混液的试剂盒检测样品中ApoE基因的多态性；
3、配置反应体系：按表1所述配方配置反应体系；
表1
PCR反应程序：
第一步：50℃2分钟；第二步：95℃5分钟；第三步：95℃10秒，60℃45秒，45个循环(同时在每个循环的60℃结束后都进行荧光收集)；第四步：25℃1分钟；
实施例3
1、获取样品
提取全血样品的DNA，提取步骤如下：
(1)取200μL新鲜或冷冻的抗凝血液，加入20μL蛋白酶K；
(2)加入200μL缓冲液缓冲液GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴10分钟；
(3)短暂离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心；
(4)上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin ColumnsDM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入，12000rpm(～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(5)向吸附柱中加入500μL缓冲液GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(7)12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
(8)将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μL缓冲液GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
2、采用实施例1组装的仅包含适用于DNA扩增的反应液的试剂盒检测样品中ApoE基因的多态性，其他步骤与实施例2相同。
实施例4结果分析
反应结束后自动保存结果，对样品的扩增曲线分别进行分析：
首先，所有样本中内参的扩增曲线均应该为阳性，在此基础上进行目的基因的结果分析，否则结果不可靠；
扩增可能出现的结果的类型(共6种类型)：
(1)E3/E3，即388位点纯合野生型526纯合野生：388位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针无扩增曲线，526位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针无扩增曲线，具体扩增曲线情况如图1；
(2)E4/E4，即388位点纯合突变型526纯合野生：388位点野生型探针无扩增曲线，突变型探针有扩增曲线，526位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针无扩增曲线，具体扩增曲线情况如图2；
(3)E2/E2，即388位点纯合野生型526纯合突变：388位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针无扩增曲线，526位点野生型探针无扩增曲线，突变型探针有扩增曲线，具体扩增曲线情况如图3；
(4)E2/E4，即388位点杂合型526杂合型：388位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针有扩增曲线，526位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针有扩增曲线，具体扩增曲线情况如图4；
(5)E3/E4，即388位点杂合型526野生型：388位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针有扩增曲线，526位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针无扩增曲线，具体扩增曲线情况如图5；
(6)E2/E3，即388位点野生型526杂合型：388位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针无扩增曲线，526位点野生型探针有扩增曲线，突变型探针有扩增曲线，具体扩增曲线情况如图6。
综上所述，本发明通过设计针对ApoE基因的rs429358位点及rs7412位点的通用性引物，实现一步扩增检测位点，并结合带有不同荧光基团的特异性探针，辅佐以内参系统提高稳定性，使用多个荧光通道检测，实现一管同时检测两个位点基因多态性的目标，操作简单，节约成本，可适用于EDTA、枸橼酸钠抗凝全血的直接检测或提取的DNA的检测。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 北京爱普益医学检验中心有限公司
<120> 一种检测ApoE基因多态性的引物及其检测方法和应用
<130> 2018
<141> 2018-02-09
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 1
agttgaaggc ctacaaatcg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 2
gctgcccatc tcctccatc 19
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 3
aggacgtgtg cggcc 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 4
aggacgtgcg cggcc 15
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 5
tgcagaagcg cctggc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 6
tgcagaagtg cctggc 16
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 7
ctacccccca ggatgcaa 18
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 8
caggtggctg gctttcact 19
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 9
ctattgcccc tggcacacca 20

Claims (10)

1.一种检测ApoE基因多态性的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。
2.一种检测ApoE基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括依据ApoE基因的rs429358位点设计的两条特异性荧光探针和依据rs7412位点设计的两条特异性荧光探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性荧光探针的5’端带有不同的荧光基团；
优选地，所述荧光基团包括FAM、ROX、CY3、CY5、VIC、NFQ-MGB、TAMRA或BHQ中的任意一种；
优选地，所述特异性荧光探针的3’端带有荧光淬灭基团。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQID NO.3-6所示。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括一组内参系统；
优选地，所述内参系统包括两条内参引物和一条内参探针；
优选地，所述内参探针的5’端带有与权利要求3所述试剂盒中特异性荧光探针不同的荧光基团，所述内参探针的3’端带有荧光淬灭基团。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括PCR反应液；
优选地，所述PCR反应液包括Taq酶、UNG酶和dNTP的预混液。
9.一种检测ApoE基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配置反应体系：将权利要求1所述的引物、权利要求3所述的探针和权利要求4所述试剂盒中的内参系统与PCR反应液在同一管内混合，加入待测样品，混匀后离心；
(2)进行荧光定量PCR扩增；
(3)于每个循环的60℃结束后收集荧光，进行结果分析；
优选地，步骤(1)所述样品用量≤1μL；
优选地，步骤(2)所述PCR扩增的步骤为：50℃，2min，95℃，5min；98℃，10s，60℃，40s，45个循环；25℃1min。
10.一种如权利要求1所述的引物和/或权利要求2-8所述的试剂盒用于检测ApoE基因多态性；
优选地，如权利要求1所述的引物和/或权利要求2-8所述的试剂盒用于制备冠心病、高脂血症、脑梗塞、阿兹海默病或动脉粥样硬化中的任一种疾病或至少两种疾病的组合的药物和/或试剂的用途。
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