CN108359729A - 用于检测肥胖风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

用于检测肥胖风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测肥胖风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法。本发明的核酸序列组合是针对肥胖5个多态性位点(rs9939609，rs1558902，rs571312，rs17782313和rs9356744)提出的，包括每个位点野生型的上游引物、突变型的上游引物和通用下游引物，应用该核酸序列组合制备的快速检测肥胖风险位点的试剂盒，使用方便，操作简便，自动化程度高，减少了操作过程的污染，检测效果好，具有高灵敏度，高特异性，高准确度，高精确度的特点。本发明的检测方法采用完全闭管操作，方便快捷、通过直接探索PCR过程中荧光信号值的获得检测结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性的技术问题，能有效避免出现非特异性扩增，适合大批量样本检测。

Description

用于检测肥胖风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种用于检测肥胖风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法。
背景技术
肥胖是一种与遗传因素及生活方式密切相关的慢性疾病，不同个体由于遗传体质及生活环境各异，导致其肥胖的高危因子不同，并且进行体重控制的有效形式也存在差异。因此，了解自身遗传状况，不仅可以通过饮食结构和生活方式的调整避免肥胖和超重的发生。
体脂量和肥胖症相关基因(FTO)位于染色体16q12，编码一种去甲基化酶，有研究表明，FTO的不同基因型与肥胖症的发病率紧密相关，FTO rs9939609AT和AA基因型的人比rs9939609TT基因型的人具有显著地肥胖症发病风险，携带FTO基因rs9939609位点风险等位基因使BMI增高0.26kg/m2。对于FTO基因上的另一个多态性位点rs1558902，在青少年研究中发现携带TA/AA基因型者超重肥胖发生风险是携带CC基因型者的1.65倍。
黑素皮质素受体-4(MC4R)是下丘脑腹内侧核分泌的一类肽类物质，为黑素皮质素受体家族5个亚型之一。MC4R具有介导瘦素蛋白的功能，是一个调节能量平衡与能量动态平衡的重要信号分子，从而在控制食欲和体重稳态中起关键作用。根据GWAS数据库分析，MC4R(rs17782313)多态性与肥胖密切相关，参与控制食欲和增加能量消耗，进而调节体重。rs571312位点位于MC4R基因旁边，有报道发现rs571312多态性与青少年肥胖或代谢异常肥胖具有相关性。
CDK5调节亚单位相关蛋白1类似物1(CDKAL1)在保护β细胞功能、降低血糖方面发挥重要的作用。研究发现CDKAL1rs9356744位点多态性虽然在欧洲人中相关性不大，但在东亚人群中与BMI强相关。因此检测rs9356744对预测肥胖风险有重要作用。
目前，检测基因多态性和基因突变的方法主要有sanger测序法、基因芯片杂交法、PCR-RFLP法和荧光定量PCR法。Sanger测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但仪器昂贵，灵敏度低，操作复杂，周期长，容易污染；普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，存在由PCR产物污染导致假阳性的风险；基因芯片技术具有高通量，微型化，自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵，这些缺点限制了这三种方法在实际临床工作中的发展和应用，无法满足快速指导临床评估要求。因此，一种快速、准确且低成本的新型检测方法成为了临床检查的迫切需求。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提出一种用于检测肥胖风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法。为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提出一种用于检测肥胖风险位点的核酸序列组合，所述的核酸序列组合包括：
1)如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的FTO基因rs9939609位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的FTO基因rs9939609位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
2)如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的FTO基因rs1558902位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的FTO基因rs1558902位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
3)如SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的MC4R基因rs17782313位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的MC4R基因rs17782313位点突变型上游引物和如SEQ IDNO：9所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
4)如SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的rs571312位点野生型上游引物、如SEQ IDNO：11所示核苷酸序列的rs571312位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
5)如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的CDKAL1基因rs9356744位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的CDKAL1基因rs9356744位点突变型上游引物和如SEQID NO：15示核苷酸序列的二者的通用下游引物。
进一步地，所述的核酸序列组合还包括5个多态性位点的野生型阳性对照和突变型阳性对照，其中FTO基因rs9939609位点野生型阳性对照、FTO基因rs9939609位点突变型阳性对照、FTO基因rs1558902位点野生型阳性对照、FTO基因rs1558902位点突变型阳性对照、MC4R基因rs17782313位点野生型阳性对照、MC4R基因rs17782313位点突变型阳性对照、rs571312位点野生型阳性对照、rs571312位点突变型阳性对照、CDKAL1基因rs9356744位点野生型阳性对照、CDKAL1基因rs9356744位点突变型阳性对照核苷酸序列依次如SEQ IDNO：16～SEQ ID NO：25所示。
更进一步地，每种多态性位点的突变型阳性对照包含对应多态性位点突变型阳性模板序列，所述对应多态性位点突变型阳性模板序列为由对应位点突变型上游引物与对应位点公共下游引物扩增出的PCR产物。
更进一步地，每种多态性位点的野生型阳性对照包含对应多态性位点野生型阳性模板序列，所述对应多态性位点野生型阳性模板序列为由对应位点野生型上游引物与对应位点公共下游引物扩增出的PCR产物。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测肥胖风险位点的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测肥胖风险位点的核酸序列组合，所述核酸序列组合包括：
1)如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的FTO基因rs9939609位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的FTO基因rs9939609位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
2)如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的FTO基因rs1558902位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的FTO基因rs1558902位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
3)如SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的MC4R基因rs17782313位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的MC4R基因rs17782313位点突变型上游引物和如SEQ IDNO：9所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
4)如SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的rs571312位点野生型上游引物、如SEQ IDNO：11所示核苷酸序列的rs571312位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
5)如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的CDKAL1基因rs9356744位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的CDKAL1基因rs9356744位点突变型上游引物和如SEQID NO：15示核苷酸序列的二者的通用下游引物。
进一步地，所述试剂盒还包括从待检测样本中提取DNA的样本处理试剂、PCR缓冲液、DNA聚合酶、阴性对照品、阳性对照品、显色试剂、DEPC水中至少一种试剂。
最后，本发明提供了一种快速检测5个肥胖多态性位点的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取来自人的样本的基因组DNA；
(2)以样本的基因组DNA为模板，利用SYBRGreenⅠ染料法分别进行5个多态性位点的野生型反应体系和突变反应体系的实时荧光PCR扩增，所述5个多态性位点分别为rs9939609，rs1558902，rs571312，rs17782313和rs9356744；
(3)数据采集和分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，通过实时荧光PCR仪收集信号，计算所述野生型反应体系和突变型反应体系的ΔCt值来确定所述样品的DNA的基因型。
进一步地，步骤(2)中包括10组PCR反应液，检测FTO基因rs9939609位点野生型的PCR反应液包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的引物，检测FTO基因rs9939609位点突变型的PCR反应液包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的引物；检测FTO基因rs1558902位点野生型的PCR反应液包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的引物，检测FTO基因rs1558902位点突变型的PCR反应液包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物；检测MC4R基因rs17782313位点野生型的PCR反应液包括SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的引物，检测MC4R基因rs17782313位点突变型的PCR反应液包括SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的引物；检测rs571312位点野生型的PCR反应液包括SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的引物，检测rs571312位点突变型的PCR反应液包括SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的引物；检测CDKAL1基因rs9356744位点野生型的PCR反应液包括SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的引物，检测CDKAL1基因rs9356744位点突变型的PCR反应液包括SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的引物。
进一步地，所述步骤2)中扩增步骤包括：95℃10min；95℃15s,60℃40s，45个循环，60℃收集荧光信号；95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s。
进一步地，所述步骤3)中按照以下判断标准确定所述样品DNA的基因型：
-3≤ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值≤3，判定为杂合型样本；
ΔCt＝突变型Ct值-野生型Ct值＞3，判定为野生型样本；
ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值＞3，判定为突变型样本。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明用于检测肥胖风险位点的核酸序列组合是针对肥胖症相关的5个多态性位点(rs9939609，rs1558902，rs571312，rs17782313和rs9356744)提出的，应用该核酸序列组合制备的快速检测肥胖风险位点的试剂盒，自动化程度高，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，具有高灵敏度，高特异性，高准确度，高精确度的特点，适用于大批量样本的检测。
(2)本发明提供的一种快速检测5个肥胖多态性位点的方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探索PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性的技术问题，能有效避免出现非特异性扩增难题。
附图说明
图1为实施例3的试剂盒中检测5号样本FTO基因rs9939609位点的扩增曲线；
图2为实施例3的试剂盒中检测5号样本FTO基因rs1558902位点的扩增曲线；
图3为实施例3的试剂盒中检测5号样本MC4R基因rs17782313位点的扩增曲线；
图4为实施例3的试剂盒中检测5号样本MC4R基因旁rs571312位点的扩增曲线；
图5为实施例3的试剂盒中检测5号样本CDKAL1基因rs9356744位点的扩增曲线。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品。
实施例1：5个肥胖多态性位点引物和验证模板设计
本发明所选ARMS引物是针对5个肥胖多态性位点(rs9939609，rs1558902，rs571312，rs17782313和rs9356744)设计。所选ARMS引物是从一段序列3’末端及其附近人为的加入错配的突变位点的一套引物组合中，通过筛选出能够区分单个位点等位基因的引物，保证了PCR扩增的高度特异性。
经过试验验证，最终确定5个肥胖多态性位点的特异性检测引物，核苷酸序列如下：
FTO基因rs9939609位点野生型上游引物(PG1-F1)、突变型上游引物(PG1-F2)和公用下游引物(PG1-R1)：
PG1-F1(SEQ ID NO:1)：5`-cttgcgactgctgtgaatgta-3`
PG1-F2(SEQ ID NO:2)：5`-cttgcgactgctgtgaattct-3`
PG1-R1(SEQ ID NO:3)：5`-taccagctatttgcatttcagtttg-3`
FTO基因rs1558902位点野生型上游引物(PG2-F1)、突变型上游引物(PG2-F2)和公用下游引物(PG2-R1)：
PG2-F1(SEQ ID NO:4)：5`-ctagccctgtgggtttacatttga-3`
PG2-F2(SEQ ID NO:5)：5`-ctagccctgtgggtttacatttgt-3`
PG2-R1(SEQ ID NO6)：5`-atgtttaagccattatagactattttgatatg-3`
MC4R基因rs17782313位点野生型上游引物(PG3-F1)、突变型上游引物(PG3-F2)和公用下游引物(PG2-R1)：
PG3-F1(SEQ ID NO:7)：5`-cttttcttgtcatttccagcg-3`
PG3-F2(SEQ ID NO:8)：5`-cttttcttgtcatttccagca-3`
PG3-R1(SEQ ID NO:9)：5`-caagtcaagtgggttactgattttaag-3`
MC4R基因旁rs571312位点野生型上游引物(PG4-F1)、突变型上游引物(PG4-F2)和公用下游引物(PG4-R1)：
PG4-F1(SEQ ID NO:10)：5`-tttacacaaacatcgggtcatagg-3`
PG4-F2(SEQ ID NO:11)：5`-tttacacaaacatcgggtcatatt-3`
PG4-R1(SEQ ID NO:12)：5`-tcgcaataaaaaagaagaaatgaaagg-3`
CDKAL1基因rs9356744位点野生型上游引物(PG5-F1)、突变型上游引物(PG5-F2)和公用下游引物(PG5-R1)：
PG5-F1(SEQ ID NO:13)：5`-aagcaatatgatggtacaaagactg-3`
PG5-F2(SEQ ID NO:14)：5`-gaaagcaatatgatggtacaaagacta-3`
PG5-R1(SEQ ID NO:15)：5`-ttacattgaggtctgagccatttc-3`
此外，检测肥胖风险位点的核酸序列组合还包括5个多态性位点的野生型阳性对照和突变型阳性对照，每种多态性位点的突变型阳性对照包含对应多态性位点突变型阳性模板序列，所述对应多态性位点突变型阳性模板序列为由对应位点突变型上游引物与对应位点公共下游引物扩增出的PCR产物；每种多态性位点的野生型阳性对照包含对应多态性位点野生型阳性模板序列，所述对应多态性位点野生型阳性模板序列为由对应位点野生型上游引物与对应位点公共下游引物扩增出的PCR产物。各位点阳性对照序列如下：
FTO基因rs9939609位点野生型阳性对照模板(SEQ ID NO：16)和突变型阳性对照模板(SEQ ID NO：17)
PG1(SEQ ID NO：16):
5`-ttccttgcgactgctgtgaatttagtgatgcacttggatagtctctgttactctaaagttttaataggtaacagtcagaaatggagtgggagagcataaaagcaaactgaaatgcaaatagctggtacc-3`
PG2(SEQ ID NO：17):
5`-ttccttgcgactgctgtgaattttgtgatgcacttggatagtctctgttactctaaagttttaataggtaacagtcagaaatggagtgggagagcataaaagcaaactgaaatgcaaatagctggtacc-3`
FTO基因rs1558902位点野生型阳性对照模板(SEQ ID NO：18)和突变型阳性对照模板(SEQ ID NO：19)
PG3(SEQ ID NO：18):
5`-ctagccctgtgggtttacattagatagggtaggttattgctgcaacgtaccctaacttgatatgatttttgctgcaaaaatcatatcaaaatagtctataatggcttaaacat-3`
PG4(SEQ ID NO：19):
5`-ctagccctgtgggtttacattagttagggtaggttattgctgcaacgtaccctaacttgatatgatttttgctgcaaaaatcatatcaaaatagtctataatggcttaaacat-3`
MC4R基因rs17782313位点野生型阳性对照模板(SEQ ID NO：20)和突变型阳性对照模板(SEQ ID NO：21)
PG5(SEQ ID NO：20):
5`-caagtcaagtgggttactgattttaagggcataagcaagttctacctaccatgttcttggaagcaggaaaaccagaatatatgtgagcatctttaatgactacaacattatagaagtttaaagcaggagagattgtatcccgatggaaatgacaagaaaagc-3`
PG6(SEQ ID NO：21):
5`-caagtcaagtgggttactgattttaagggcataagcaagttctacctaccatgttcttggaagcaggaaaaccagaatatatgtgagcatctttaatgactacaacattatagaagtttaaagcaggagagattgtatcctgatggaaatgacaagaaaagc-3`
MC4R基因旁rs571312位点野生型阳性对照模板(SEQ ID NO：22)和突变型阳性对照模板(SEQ ID NO：23)
PG7(SEQ ID NO：22):
5`-tttacacaaacatcgggtcataggtcacttaaagctgcaactcaaatttcagacttttaacttgatcattttgaacttataaaatagactttattttttaaaacagtcctttcatttcttcttttttattgcga-3`
PG8(SEQ ID NO：23):
5`-tttacacaaacatcgggtcatagttcacttaaagctgcaactcaaatttcagacttttaacttgatcattttgaacttataaaatagactttattttttaaaacagtcctttcatttcttcttttttattgcga-3`
CDKAL1基因rs9356744位点野生型阳性对照模板(SEQ ID NO：24)和突变型阳性对照模板(SEQ ID NO：25)
PG9(SEQ ID NO：24):
5`-ttacattgaggtctgagccatttcgatctaatttttgtcaagaatgtaaggtctgtgtttagatttgtttttttagcatgtggatgtccagttgttctaccaccgttttttgaagacggtctttgtaccatcatattgctt-3`
PG10(SEQ ID NO：25):
5`-ttacattgaggtctgagccatttcgatctaatttttgtcaagaatgtaaggtctgtgtttagatttgtttttttagcatgtggatgtccagttgttctaccaccgttttttgaagatggtctttgtaccatcatattgctt-3`
实施例2：用于检测5个肥胖多态性位点的试剂盒的制备
分别针对5个多态性位点，采用实施例1中设计的野生型上游引物，突变型上游引物和公用的下游引物进行合成，同时选用SYBR GreenⅠ染料进行染色，该染料是一种结合于dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR GreenⅠ发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，因此SYBR GreenⅠ的荧光强度与双链DNA的数量相关，因此可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
用于检测肥胖风险位点的试剂盒，内部包括10种PCR反应液、阳性对照、阴性对照品、显色试剂。
本发明中有10种PCR反应液，每种反应液分别为：
(1)检测FTO基因rs9939609位点野生型反应液1-1：含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3的引物，dNTP，Taq酶，Fast masterpremix和DEPC水。突变型反应液1-2：含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的引物，dNTP，Taq酶，Fast masterpremix和DEPC水。
(2)检测FTO基因rs1558902位点野生型反应液2-1：含有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6的引物，dNTP，Taq酶，Fast masterpremix和DEPC水。突变型反应液2-2：含有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的引物，dNTP，Taq酶，Fast masterpremix和DEPC水。
(3)检测MC4R基因rs17782313位点野生型反应液3-1：含有SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9的引物，dNTP，Taq酶，Fast masterpremix和DEPC水。突变型反应液3-2：含有SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9的引物，dNTP，Taq酶，Fastmasterpremix和DEPC水。
(4)检测MC4R基因旁rs571312位点野生型反应液4-1：含有SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12的引物，dNTP，Taq酶，Fast masterpremix和DEPC水。突变型反应液4-2：含有SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12的引物，dNTP，Taq酶，Fastmasterpremix和DEPC水。
(5)检测CDKAL1基因rs9356744位点野生型反应液5-1：含有SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15的引物，dNTP，Taq酶，Fast masterpremix和DEPC水。突变型反应液5-2：含有SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15的引物，dNTP,Taq酶，Fastmasterpremix和DEPC水。
应用本发明设计的野生型引物对和突变型引物对，对检测样品的DNA模板进行荧光定量PCR扩增检测，采用野生型反应体系和突变型反应体系，每种PCR反应液的均由对应上下游引物、dNTP、Taq酶、Fast masterpremix和DEPC水形成25μL反应体系，每种PCR反应液的配置如表1所示。
表1 PCR反应液配置
试剂 用量
Fastmasterpremix(ABI) 5μL
Taq酶(TAKARA) 1U
各条引物 各0.5μmol
dNTPs(TAKARA) 0.5mmol
补DEPC水至 22μL
样品DNA模板 2μL
总体积 25μL
本实施例的试剂盒中还包括一种阳性对照和一种阴性对照。阳性对照是阳性质控，用于检测体系中成分是否有效。阳性对照由分别含有SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：25序列的10种重组质粒(由上海生工合成)组成，如由具有SEQ ID NO：16序列的阳性对照模板和载体pUC57构成FTO基因rs9939609位点野生型阳性对照质粒，由具有SEQ ID NO：17序列的阳性对照模板和载体pUC57构成FTO基因rs9939609位点突变型阳性对照质粒。10种质粒以1：1混合，各自终浓度1×103copies/μL；阴性对照是阴性质控，用于检测体系是否被污染，阴性对照是ddH2O。
实施例3：用本发明制备的试剂盒检测5个肥胖多态性位点
为了测定基因组DNA，可以使用含有基因组DNA的几乎任何生物样品(如不纯的红细胞)。例如，但并非限制，基因组DNA可以方便地获自血液、精液、唾液、泪液、尿液、排泄物、汗液、口腔细胞、皮肤或毛发。为了利用DNA测定，靶核酸必须获自表达该靶序列的细胞或组织。
本实施例的待检样品是从武汉良培基因生物科技有限公司收集的10例口腔拭子中提取DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。提取DNA的主要操作步骤参考天跟公司的口腔拭子DNA提取试剂盒，提取样本基因组DNA。提取的基因组DNA经紫外分光光度计计算其纯度和浓度定量，本实施例中10例DNA样本稀释到5ng/μL。
检测方法如下：
(1)将10例基因组DNA样本稀释至5ng/μL置于冰上待用；
(2)从试剂盒中取出阳性对照、阴性对照物、10种PCR反应液，解冻后震荡混匀，离心30s，置于冰上待用。
(3)按照每个PCR反应体积23μL，乘以(所需反应管数+1)，计算试剂的量，加入无菌离心管中，振荡混匀后分装至八连管中，每孔23μL。
(4)将阴性对照、待测样本、阳性对照分别加入10种PCR反应液中，每孔模板DNA2μL。
(5)PCR反应程序：95℃10min；95℃15s，60℃40s，45个循环，60℃收集荧光信号；95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s。
(6)结果分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增曲线上，再根据荧光定量PCR仪，得到阳性对照、阴性对照和样本的突变Ct值和野生型Ct值。按照以下步骤进行判断：
①首先判断阴性对照和阳性对照的Ct值，阴性对照的突变型Ct和野生型Ct值均≥40，表明操作过程中无污染，否则需要重新进行实验；阳性对照的突变型Ct和野生型Ct值均≤35，表明本发明试剂盒有效，否则需要重新购买试剂盒进行验证。
②满足步骤①后才能进行本步骤判断样本的ΔCt值，按照以下公式进行计算：
-3≤ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值≤3，判定为杂合型样本；
ΔCt＝突变型Ct值-野生型Ct值＞3，判定为野生型样本；
ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值＞3，判定为突变型样本。
利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的野生型和突变型sybrgreen信号的强弱差异来判断结果。样本检测结果判定见表2。
表2 5个肥胖多态性位点检测结果判定
利用本发明方法对10例样本基因组DNA检测，其检测结果如下表3、表4和表5，样本的扩增曲线此处不再全部列出，仅列出具有代表性的1个样品的扩增曲线图，具体如图1、图2、图3、图4、图5所示，同时将10例样本基因组DNA采用Sanger金标准进行测序检测，将两者的检测能力进行比较，两者检测结果一致，试剂盒准确度高，适用样本性广。
表3 10例口腔拭子荧光定量检测和sanger测序结果(rs9939609、rs1558902)
表4 10例口腔拭子荧光定量检测和sanger测序结果(rs17782313、rs571312)
表5 10例口腔拭子荧光定量检测和sanger测序结果(rs9356744)
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 良培基因生物科技（武汉）有限公司
<120> 用于检测肥胖风险位点的核酸序列、试剂盒及其检测方法
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttgcgactg ctgtgaatgt a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttgcgactg ctgtgaattc t 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccagctat ttgcatttca gtttg 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctagccctgt gggtttacat ttga 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctagccctgt gggtttacat ttgt 24
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgtttaagc cattatagac tattttgata tg 32
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttttcttgt catttccagc g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttttcttgt catttccagc a 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caagtcaagt gggttactga ttttaag 27
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttacacaaa catcgggtca tagg 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tttacacaaa catcgggtca tatt 24
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgcaataaa aaagaagaaa tgaaagg 27
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagcaatatg atggtacaaa gactg 25
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaagcaata tgatggtaca aagacta 27
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttacattgag gtctgagcca tttc 24
<210> 16
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttccttgcga ctgctgtgaa tttagtgatg cacttggata gtctctgtta ctctaaagtt 60
ttaataggta acagtcagaa atggagtggg agagcataaa agcaaactga aatgcaaata 120
gctggtacc 129
<210> 17
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttccttgcga ctgctgtgaa ttttgtgatg cacttggata gtctctgtta ctctaaagtt 60
ttaataggta acagtcagaa atggagtggg agagcataaa agcaaactga aatgcaaata 120
gctggtacc 129
<210> 18
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctagccctgt gggtttacat tagatagggt aggttattgc tgcaacgtac cctaacttga 60
tatgattttt gctgcaaaaa tcatatcaaa atagtctata atggcttaaa cat 113
<210> 19
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctagccctgt gggtttacat tagttagggt aggttattgc tgcaacgtac cctaacttga 60
tatgattttt gctgcaaaaa tcatatcaaa atagtctata atggcttaaa cat 113
<210> 20
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagtcaagt gggttactga ttttaagggc ataagcaagt tctacctacc atgttcttgg 60
aagcaggaaa accagaatat atgtgagcat ctttaatgac tacaacatta tagaagttta 120
aagcaggaga gattgtatcc cgatggaaat gacaagaaaa gc 162
<210> 21
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caagtcaagt gggttactga ttttaagggc ataagcaagt tctacctacc atgttcttgg 60
aagcaggaaa accagaatat atgtgagcat ctttaatgac tacaacatta tagaagttta 120
aagcaggaga gattgtatcc tgatggaaat gacaagaaaa gc 162
<210> 22
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tttacacaaa catcgggtca taggtcactt aaagctgcaa ctcaaatttc agacttttaa 60
cttgatcatt ttgaacttat aaaatagact ttatttttta aaacagtcct ttcatttctt 120
cttttttatt gcga 134
<210> 23
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tttacacaaa catcgggtca tagttcactt aaagctgcaa ctcaaatttc agacttttaa 60
cttgatcatt ttgaacttat aaaatagact ttatttttta aaacagtcct ttcatttctt 120
cttttttatt gcga 134
<210> 24
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttacattgag gtctgagcca tttcgatcta atttttgtca agaatgtaag gtctgtgttt 60
agatttgttt ttttagcatg tggatgtcca gttgttctac caccgttttt tgaagacggt 120
ctttgtacca tcatattgct t 141
<210> 25
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttacattgag gtctgagcca tttcgatcta atttttgtca agaatgtaag gtctgtgttt 60
agatttgttt ttttagcatg tggatgtcca gttgttctac caccgttttt tgaagatggt 120
ctttgtacca tcatattgct t 141

Claims (10)

1.一种用于检测肥胖风险位点的核酸序列组合，其特征在于，所述的核酸序列组合包括：
1)如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的FTO基因rs9939609位点野生型上游引物、如SEQID NO：2所示核苷酸序列的FTO基因rs9939609位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
2)如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的FTO基因rs1558902位点野生型上游引物、如SEQID NO：5所示核苷酸序列的FTO基因rs1558902位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
3)如SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的MC4R基因rs17782313位点野生型上游引物、如SEQID NO：8所示核苷酸序列的MC4R基因rs17782313位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
4)如SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的rs571312位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的rs571312位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
5)如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的CDKAL1基因rs9356744位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的CDKAL1基因rs9356744位点突变型上游引物和如SEQ IDNO：15示核苷酸序列的二者的通用下游引物。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测肥胖风险位点的核酸序列组合，其特征在于，所述的核酸序列组合还包括5个多态性位点的野生型阳性对照和突变型阳性对照，其中FTO基因rs9939609位点野生型阳性对照、FTO基因rs9939609位点突变型阳性对照、FTO基因rs1558902位点野生型阳性对照、FTO基因rs1558902位点突变型阳性对照、MC4R基因rs17782313位点野生型阳性对照、MC4R基因rs17782313位点突变型阳性对照、rs571312位点野生型阳性对照、rs571312位点突变型阳性对照、CDKAL1基因rs9356744位点野生型阳性对照、CDKAL1基因rs9356744位点突变型阳性对照核苷酸序列依次如SEQ ID NO：16～SEQID NO：25所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测肥胖风险位点的核酸序列组合，其特征在于，每种多态性位点的突变型阳性对照包含对应多态性位点突变型阳性模板序列，所述对应多态性位点突变型阳性模板序列为由对应位点突变型上游引物与对应位点公共下游引物扩增出的PCR产物。
4.根据权利要求2所述的一种用于检测肥胖风险位点的核酸序列组合，其特征在于，每种多态性位点的野生型阳性对照包含对应多态性位点野生型阳性模板序列，所述对应多态性位点野生型阳性模板序列为由对应位点野生型上游引物与对应位点公共下游引物扩增出的PCR产物。
5.一种用于检测肥胖风险位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测肥胖风险位点的核酸序列组合，所述核酸序列组合包括：
1)如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的FTO基因rs9939609位点野生型上游引物、如SEQID NO：2所示核苷酸序列的FTO基因rs9939609位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
2)如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的FTO基因rs1558902位点野生型上游引物、如SEQID NO：5所示核苷酸序列的FTO基因rs1558902位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
3)如SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的MC4R基因rs17782313位点野生型上游引物、如SEQID NO：8所示核苷酸序列的MC4R基因rs17782313位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
4)如SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的rs571312位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的rs571312位点突变型上游引物和如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的二者的通用下游引物；
5)如SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的CDKAL1基因rs9356744位点野生型上游引物、如SEQ ID NO：14所示核苷酸序列的CDKAL1基因rs9356744位点突变型上游引物和如SEQ IDNO：15示核苷酸序列的二者的通用下游引物。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测肥胖风险位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括从待检测样本中提取DNA的样本处理试剂、PCR缓冲液、DNA聚合酶、阴性对照品、阳性对照品、显色试剂、DEPC水中至少一种试剂。
7.一种快速检测5个肥胖多态性位点的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)提取来自人的样本的基因组DNA；
(2)以样本的基因组DNA为模板，利用SYBRGreenⅠ染料法分别进行5个多态性位点的野生型反应体系和突变反应体系的实时荧光PCR扩增，所述5个多态性位点分别为rs9939609，rs1558902，rs571312，rs17782313和rs9356744；
(3)数据采集和分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，通过实时荧光PCR仪收集信号，计算所述野生型反应体系和突变型反应体系的ΔCt值来确定所述样品的DNA的基因型。
8.根据权利要求7所述的一种快速检测5个肥胖多态性位点的方法，其特征在于，步骤(2)中包括10组PCR反应液，检测FTO基因rs9939609位点野生型的PCR反应液包括SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3的引物，检测FTO基因rs9939609位点突变型的PCR反应液包括SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3的引物；检测FTO基因rs1558902位点野生型的PCR反应液包括SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6的引物，检测FTO基因rs1558902位点突变型的PCR反应液包括SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6的引物；检测MC4R基因rs17782313位点野生型的PCR反应液包括SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：9的引物，检测MC4R基因rs17782313位点突变型的PCR反应液包括SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9的引物；检测rs571312位点野生型的PCR反应液包括SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12的引物，检测rs571312位点突变型的PCR反应液包括SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12的引物；检测CDKAL1基因rs9356744位点野生型的PCR反应液包括SEQ ID NO：13和SEQID NO：15的引物，检测CDKAL1基因rs9356744位点突变型的PCR反应液包括SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的引物。
9.根据权利要求7所述的一种快速检测5个肥胖多态性位点的方法，其特征在于，所述步骤2)中扩增步骤包括：95℃10min；95℃15s,60℃40s，45个循环，60℃收集荧光信号；95℃15s.60℃1min，95℃30s，60℃15s。
10.根据权利要求7所述的一种快速检测5个肥胖多态性位点的方法，其特征在于，所述步骤3)中按照以下判断标准确定所述样品DNA的基因型：
-3≤ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值≤3，判定为杂合型样本；
ΔCt＝突变型Ct值-野生型Ct值＞3，判定为野生型样本；
ΔCt＝野生型Ct值-突变型Ct值＞3，判定为突变型样本。
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