CN106811537A - 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物及其应用,属于分子病理诊断领域,包括SEQ ID NO:1~2所示的扩增引物、SEQ ID NO:3所示的测序引物、所示的扩增阻滞引物,所述扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’末端前两个碱基序列相同;其中,SEQ ID NO:2其5’端标记生物素;SEQ ID NO:4其3’端磷酸化处理;以上核酸序列在一次检测中共同使用。本发明提高了检测灵敏度高,可检测低至0.1%的突变,而且结果直观,判读更加简单、准确、快速,大大降低检测结果的假阴性率,避免临床上对患者无益或有益的靶向药物选择,为患者节省宝贵的治疗时间,提高患者生活质量。
Description
技术领域
本发明属分子病理诊断领域,具体涉及一种用于准确定性检测与肺癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的引物及其应用。
背景技术
肺癌危害性大且致死率高,目前是全世界癌症死因的第一名,1995年全世界有60万人死于肺癌,而且每年人数都在上升,2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年,发病率是120万/年,肺癌中75%~80%为非小细胞肺癌。晚期肺癌病人采用放、化疗等治疗手段不仅降低了生存质量,且疗效不佳。易瑞沙(Iressa,即吉非替尼Gefitinib)是目前临床使用最为成功的晚期肺癌靶向治疗药物,为EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TyrosineKinase inhibitors,TKI),临床试验证实对东方人(亚洲人为主)、女性、非吸烟者、肺泡细胞癌或腺癌患者的疗效较好。进一步的研究表明,非小细胞肺癌患者EGFR基因上携带20外显子上T790M突变型患者则对易瑞沙耐受,而对AZD9291靶向药物敏感。
目前,测序方法仍然是检测核酸序列突变的金标准,但是该方法对于所取样本中的肿瘤细胞的比例要求较高,一般大于50%,并且突变率低于20%的核苷酸突变,不能有效检测和判读,因此会造成假阴性。相比于测序技术,其它分子生物学检测方法,如荧光定量PCR,高效液相色谱技术等,存在结果不能准确定量等问题,因此会导致假阳性或假阴性。
Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术,被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳,DNA片段也无须特殊的荧光标记,操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应,在每一轮测序反应中,只加入一种dNTP,若该dNTP与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号,并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP,继续DNA链的合成。相比传统测序技术和荧光定量PCR检测方法,降低了样本取材的要求(只需较少的肿瘤组织,低肿瘤细胞含量仍可检测),具有更高的灵敏度,可定量检测低至1-5%的突变,准确性高,更适合于高通量分析,结果直观,判读更加简单、准确、快速,具有无可比拟的优势。但是针对临床上一些特殊标本,如血浆、胸腹水等来源的标本,5%的检测灵敏度远远不够。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变试剂盒,以解决现有技术中表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变检测结果准确率低的缺点。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的如下技术方案:
一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物,包括:
SEQ ID NO:1~2所示的扩增引物、SEQ ID NO:3所示的测序引物、SEQ ID NO:4所示的扩增阻滞引物,所述扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’末端前两个碱基序列相同;
其中,SEQ ID NO:2其5’端标记生物素;SEQ ID NO:4其3’端磷酸化处理;以上核酸序列在一次检测中共同使用。
其中,所述扩增阻滞引物的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明中,通过引入扩增阻滞引物,降低了野生型序列的扩增,相对增加了突变基因型的扩增,结合焦磷酸测序技术大大提高了检出灵敏度。相比于现在临床上普遍采用的ARMS检测EGFR T790M的方法(1%灵敏度),检测灵敏度提高至0.1%,提高了临床标本的阳性检出率,可以为更多的患者提供了准确的用药参考。
一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒,包括权利要求1~4所示的引物以及如下试剂:
(1)DNA提取试剂;
(2)生物素标记亲和磁珠;
(2)反应液:PCR缓冲液,2mM MgCl2,0.2mM dNTPs,2U/μL Taq DNA聚合酶;
(3)单链纯化试剂:75%(v/v)乙醇溶液,0.2M NaOH,10mM pH 7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液,结合缓冲液,退火缓冲液;
(4)测序试剂:DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶,三磷酸腺苷双磷酸酶,底物APS,荧光素和dNTP。
其中,所述PCR缓冲液包括:0.1%(v/v)NP-40,0.02%(v/v)明胶,0.06%(w/v)g/mL BSA,0.1%(v/v)吐温-20,0.06M pH8.9Tricine。
其中,所述的缓冲液包括:10mM Tris-HCl,2M NaCl,1mM EDTA,0.1%(v/v)吐温-20。
其中,所述的退火缓冲液包括:20mM pH 7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐,2mM醋酸镁。
一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的方法,包括如下步骤:
(1)提取石蜡活检标本组织中的基因组DNA;
(2)以步骤(1)中所得DNA为模板,PCR扩增EGFR T790M位点核酸序列片段;
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化;
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序;
(5)测序得到SNP突变频率。
上述检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的方法,步骤(2)中,
PCR扩增体系为:10×PCR buffer 5μL,SEQ ID NO:1 0.5μL,SEQ ID NO:2 0.5μL,SEQ ID NO.:4 5uL,Template DNA 3μl,0.2mΜ dNTPs,2mM MgCl2,Taq DNA聚合酶2U,加无菌水补足至50μL;
PCR扩增条件为:94℃5min;50个循环,94℃40s,60℃40s,72℃40s;72℃3min,16℃终止反应。
有益效果:本发明的一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变检测方法和试剂盒,应用焦磷酸测序技术可以准确检测突变该位点的突变,可用于临床启动EGFR-TKI用于治疗非小细胞肺癌前的靶标位点EGFR T790M突变检测,筛选药物敏感和耐药的患者。本发明方法操作简单,敏感性高,降低了样本取材要求,结果易于判读,大大降低了检测结果的假阳性或者假阴性率,为患者避免无效有害的治疗,节省宝贵的治疗时间。
本发明通过对EGFR基因型序列分析,设计了特异的生物素标记引物,利用PCR和焦磷酸测序技术,准确检测与肺癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变。该方法可快速准确的检测低至0.1%的EGFR T790M突变。其重要意义在于:(1)指导肺癌患者有针对性用药,避免无效用药;(2)改善预后;(3)避免获得耐药;(4)降低对样本组织的取材要求;(5)减少医疗费用。
附图说明
图示1为突变频率为20%的标准品,经本方法检测后突变频率变为82.5%。
图示2为突变频率为2%的标准品,经本方法检测后突变频率变为10.1%。
图示3为突变频率为0.2%的标准品,经本方法检测后,突变频率变为4.5%。
图示4为一例石蜡组织标本检测结果。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:试剂。
(1)DNA提取试剂:
购自QIAGEN公司。
(2)反应液:
PCR Buffer:购自美国Fermentas公司;
引物SEQ ID NO:1~4,由上海英俊生物科技有限公司合成;
MgCl2:购自美国Fermentas公司;
0.2mM dNTPs:购自美国Fermentas公司;
2U/μL Taq DNA聚合酶:购自美国Fermentas公司。
(3)单链纯化试剂:
75%(v/v)乙醇溶液:购于杭州长征化学试剂有限公司;
0.2M NaOH:购于上海试四赫维化工有限公司;
10mM Tris-Acetate(pH 7.6):Tris-base购于美国Sigma公司,无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司;
结合缓冲液:由10mM Tris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司,盐酸购于杭州化学试剂有限公司),2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司),1mM EDTA(购于杭州化学试剂有限公司),0.1%(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司)组成;
退火缓冲液:由20mM Tris-Acetate(pH 7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司,无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司),2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成;
亲和素标记的磁珠(购于GE healthcare Bioscience AB)。
(4)测序试剂:
DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶:购于QIAGEN公司;
底物APS和荧光素:购于QIAGEN公司;
四种dNTP(dATP S,dTTP,dCTP,dGTP):购于QIAGEN公司。
实施例2:检测方法。
仪器:Bio-Rad S1000PCR仪,Beckman Microfuge 22R台式微量冷冻离心机,北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统,QIAGEN PyroMark Q96ID测序仪。
(1)提取石蜡标本组织DNA,具体步骤如下:将石蜡标本置于二甲苯中,去除石蜡;加入裂解缓冲液和蛋白酶K,在变性条件下消化组织,裂解细胞;置于90℃孵育,逆转福尔马林交联;将裂解液通过硅胶膜使DNA吸附到硅胶膜上,加入漂洗液洗涤杂质,最后将高纯、浓缩的DNA从硅胶膜上洗脱,得到基因组DNA收集液。
(2)以步骤(1)所得DNA为模板,利用EGFR特异性引物进行PCR扩增;
其中,所述的PCR扩增体系为:10×PCR buffer 5μL,SEQ ID NO:1 0.5μL,SEQ IDNO:2 0.5μL,SEQ ID NO:4 5uL,Template DNA 3μl,0.2mΜ dNTPs,2mM MgCl2,Taq DNA聚合酶2U,加无菌水补足至50μL;PCR扩增条件为:94℃5min;50个循环,94℃40s,60℃40s,72℃40s;72℃3min,16℃终止反应。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化:
(a)在使用前,保证所有溶液都达到室温;
(b)在PSQ 96板中加入45μl annealing buffer,然后每孔加入SEQ ID NO:3测序引物(10uM)1uL;
(c)使用Vertex混匀Sepharose beads,将需要使用的sepharoe beads总量(每样本3μL)转移到一个Eppendorf管中,在sepharose bead中加入binding buffer,使得平均每个样品约有50μL的体积,将混合物混匀;
(d)将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中,每样本50μL,将PCR产物在常温下混匀10分钟,使得beads与生物素结合;
(e)在Vacuum prep workstation中,四个样品板中依次加入180mL高纯水、70%乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer;
(f)打开vacuum prep workstation的泵,将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒,然后将vacuum prep tool移到PCR板中,抓取sepharose beads,将vacuum prep tool放入70%乙醇中5秒,然后移到denatureation buffer中5秒,再移到washing buffer中清洗10秒,把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方,不要接触液面,关掉泵,将vacuum preptool放入含有测序引物的板中,摇动,释放sepharose beads;
(g)使用高纯水清洗vacuum prep tool。
将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟,再冷却到室温后放入测序仪中。
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序;
(5)读取测序结果。
标准品的检测结果如图1~3所示,图示1为突变频率为20%的标准品,经本方法检测后突变频率变为82.5%,图示2为突变频率为2%的标准品,经本方法检测后突变频率变为10.1%,图示3为突变频率为0.2%的标准品,经本方法检测后,突变频率变为4.5%。
将本发明方法用于1例临床石蜡组织标本的检测,测序结果如图4所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司
<120> 一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变引物及其应用
<130> SG20161208001
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游扩增引物
<400> 1
ctcacctcca ccgtgcagc 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
gtctttgtgt tcccggacat agtc 24
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 测序引物
<400> 3
accgtgcagc tcatca 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增阻滞引物
<400> 4
gctcatcatg cagctcatgc c 21
Claims (8)
1.一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物,其特征在于,包括:
SEQ ID NO:1~2所示的扩增引物、SEQ ID NO:3所示的测序引物、所示的扩增阻滞引物,所述扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’末端前两个碱基序列相同;
其中,SEQ ID NO:2其5’端标记生物素;SEQ ID NO:4其3’端磷酸化处理;以上核酸序列在一次检测中共同使用。
2.一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物,其特征在于,所述扩增阻滞引物的序列如SEQ ID NO:4所示。
3.一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~4所示的引物以及如下试剂:
(1)DNA提取试剂;
(2)生物素标记亲和磁珠;
(2)反应液:PCR缓冲液;引物SEQ ID NO:1~4 10μM;2mM MgCl2,0.2mM dNTPs,2U/μLTaq DNA聚合酶;
(3)单链纯化试剂:75%(v/v)乙醇溶液,0.2M NaOH,10mM pH 7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液,结合缓冲液,退火缓冲液;
(4)测序试剂:DNA聚合酶,ATP硫酸化酶,荧光素酶,三磷酸腺苷双磷酸酶,底物APS,荧光素和dNTP。
4.根据权利要求3所述的检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒,其特征在于,所述PCR缓冲液包括:0.1%(v/v)NP-40,0.02%(v/v)明胶,0.06%(w/v)g/mL BSA,0.1%(v/v)吐温-20,0.06M pH8.9Tricine。
5.根据权利要求3所述的检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒,其特征在于,所述的缓冲液包括:10mM Tris-HCl,2M NaCl,1mM EDTA,0.1%(v/v)吐温-20。
6.根据权利要求3所述的检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒,其特征在于,所述的退火缓冲液包括:20mM pH 7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐,2mM醋酸镁。
7.一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)提取石蜡活检标本组织中的基因组DNA;
(2)以步骤(1)中所得DNA为模板,PCR扩增EGFR T790M位点核酸序列片段;
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化;
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序;
(5)测序得到SNP突变频率。
8.根据权利要求7所述的检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的方法,其特征在于,步骤(2)中,
PCR扩增体系为:10×PCR buffer 5μL,SEQ ID NO:1 0.5μL,SEQ ID NO:2 0.5μL,SEQID NO.:4 5uL,Template DNA 3μl,0.2mΜdNTPs,2mM MgCl2,Taq DNA聚合酶2U,加无菌水补足至50μL;
PCR扩增条件为:94℃5min;50个循环,94℃40s,60℃40s,72℃40s;72℃3min,16℃终止反应。
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