CN106498028A - Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及EGFR的T790M突变的诊断方法及试剂盒。本发明结合了两种高分辨引物，竞争性Block寡聚核苷酸和荧光特异探针技术，检测灵敏度高，且可以更准确和灵敏地检测样本中的T790M突变。
Description
技术领域
本发明属于诊断领域，更具体地，本发明涉及EGFR的T790M突变的诊断方法及试剂盒。
背景技术
肺癌是全世界发病率和死亡率均列第一的恶性肿瘤。由于肺癌发生机制的多样性和治疗监控工具的局限性，大多数患者往往不能得益于临床治疗。比如，化学治疗肺癌的疾病缓解率仅为15％-20％。
大规模的临床试验证实，以表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)为代表的靶向药物，对EGFR突变的非小细胞肺癌患者具有显著疗效，可延长其无疾病进展生存期和总生存期。然而，临床上对于TKI药物有效的患者，在用药后期均会产生耐药性，研究显示，其中50％患者在19外显子缺失或L858R等敏感性突变的基础上，又发生了第20外显子790位密码子的突变(T790M)。最新研究表明，由阿斯利康研发的第三代EGFR抑制剂，对已有EGFR-TKI有抗性并且存在T790M突变的NSCLC患者有较佳的治疗效果。因此在临床用药选择时，除敏感突变外，T790M耐药突变的检测也尤为重要。
用于EGFR基因T790M突变检测的样本主要包括肿瘤组织样本和血液样本。组织样本成份复杂，除了肿瘤组织DNA，也含有部分正常组织DNA，加上肿瘤本身的异质性，其带检测突变在样本中所占的比例往往低于20％。此外，在临床实践中，并非所有患者都能获得组织标本。尤其对于发病即为中晚期的肺癌患者来说，肿瘤组织标本往往经穿刺获得，组织量少，难以满足检测要求。另一方面，肿瘤的生物学特性在经过一系列治疗后会发生改变，再次获取组织标本比较困难。循环肿瘤DNA(CtDNA)是一种无细胞状态的胞外游离DNA，由凋亡的肿瘤细胞释放，存在于肿瘤患者外周血中，具有肿瘤细胞的遗传特征。由于外周血取样的方便和及时性，对于EGFR-TKI耐药的患者，检测外周血中的CtDNA，即可获得T790M的突变信息。但是，血液样本中除了来自于肿瘤组织的含有突变的CtDNA之外，还含有大量来自于正常细胞代谢所产生的野生型DNA，其突变比例往往低于1％。
目前常用的检测EGFR基因T790M突变的方法有测序法和ARMS-PCR法。测序法灵敏度较低约20％，且操作复杂，检测时间较长。ARMS-PCR方法能够达到1％的灵敏度，对于突变比例较高的肿瘤组织样本尚能够满足检测需求，但是对于突变含量低的组织样本，尤其是血液样本，难以有效检测。
本发明人前期研发的EGFR基因突变检测试剂盒，其对T790M位点有较好的检出率。但是，临床应用中仍然发现一些问题，在检测效率方面有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供EGFR的T790M突变的诊断方法及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，所述的试剂盒中包括：
(a)与EGFR基因T790M突变位点及邻近位点的序列互补的前引物，所述的前引物长度为10-25bp，且该前引物的3’末端序列包含“5’-ACTCATCAT-3’”序列或该序列中第2-8位(较佳地第3-7位)中任一碱基由其它碱基替换而形成的序列；
(b)后引物；该后引物和前引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-100bp；和
(c)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
在一个优选例中，所述的前引物的长度为10-20bp；较佳地为12-20bp。
在另一优选例中，所述的该序列中第2-8位(较佳地第3-7位)中任一碱基由其它碱基替换而形成的序列包括：“5’-ACACATCAT-3’”。
在另一优选例中，所述的可检测标记是荧光标记。
在另一优选例中，SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ IDNO:4，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
在另一优选例中，所述的前引物是选自下组所示核苷酸序列的前引物：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：与EGFR基因T790M突变位点及邻近位点的序列互补的前引物b，所述的前引物b长度为10-25bp，且该前引物b的3’末端序列包含“5’-GCTCATCAT-3’”序列或该序列中第2-8位(较佳地第3-7位)中任一碱基由其它碱基替换而形成的序列；较佳地为“5’-GCACATCAT-3’”。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括SEQ ID NO:12所示的前引物。
在另一优选例中，所述的后引物具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，且所述的后引物长度为16-25bp；较佳地为16-20bp；如18bp。
在另一优选例中，所述的前引物的核苷酸序列中，还设置一个与EGFR基因模板中相应位点碱基错配的碱基。
在另一优选例中，所述的错配的碱基位于EGFR基因T790M突变待测碱基5’端第6个碱基。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：(d)靶向点基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸，其与野生型基因完全互补，与突变基因部分互补。
在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的Block寡聚核苷酸是硫代修饰的。
在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的竞争性Block寡聚核苷酸包括：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括(但不限于)：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，说明操作方法的使用说明书。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于检测EGFR基因T790M(对应于EGFR第790位氨基酸，其密码子由ACG突变为ATG)突变的试剂盒。
在一个优选例中，所述的用途为非诊断性的用途。例如，仅应用于在实验室中分析EGFR的变异情况。
在本发明的另一方面，提供一种检测EGFR基因T790M突变的方法，所述方法包括：
(i)以待测基因为模板，以所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；
(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中EGFR基因T790M突变类型。
在一个优选例中，所述方法中，若经测定发现，对应于EGFR第790位氨基酸，其密码子由ACG突变为ATG，则判断为发生T790M突变。
在另一优选例中，所述的方法为非诊断性的方法。例如，仅在实验室中应用该方法分析EGFR的变异情况。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人致力于提高EGFR基因突变检测的检测效率，在进行大样本量的检测中发现，EGFR基因中T790M位点前存在的另一单核苷酸多态位点(SNP：G>A；其变异频率为41.83％；后文中称为“前SNP”)是影响T790M突变检测效率的因素。对于含有该SNP变异的样本，仅采用与该位点为野生型等位基因(野生型中为G)的模板完全匹配的引物进行检测时，由于引物中存在不匹配的碱基，会降低检测效率。在此基础上，本发明人进一步优化了检测EGFR基因T790M位点突变的检测试剂。
如本文所用，所述的“前引物”与“正向引物”可互换使用，是指针对EGFR基因的突变位点的引物，所述前引物与突变型模板基本上匹配(例如，存在一个碱基的错配)或完全匹配。
如本文所用，所述的“后引物”与“反向引物”可互换使用。本发明中，所述的“后引物”对应于EGFR基因的非SNP位点。通常，利用该“后引物”与“前引物”进行PCR扩增，获得一个具有合理长度的扩增产物，例如长度为50-150bp；较佳地为50-100bp。
如本文所用，“互补”是指核苷酸的序列之间(如本发明中前引物序列与EGFR基因T790M突变位点及邻近位点的序列之间)可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有80％或90％的核苷酸是互补的。本发明中，两条足够互补的分子之间可以具有1-2个(较佳地为1个)不配对的核苷酸。
如本文所用，碱基的“匹配”、“配对”或“完全互补”是指两条核苷酸序列中相应的碱基构成了键(如氢键)的连接，例如“A”与“T”之间可形成键。两条序列中足够多核苷酸的“配对”可使得两条序列发生互补。
如本文所用，碱基的“基本上匹配”是指两条核苷酸序列中绝大多数的碱基构成了键(如氢键)的连接，存在个别(例如1个)碱基的“错配”。
如本文所用，所述的碱基“错配”是指两条核苷酸序列中，存在位置关系相应的两个碱基，它们之间不构成键(如氢键)的连接。
本发明以EGFR基因T790M突变为检测对象，兼顾了T790M位点前的“前SNP”的影响，设计两种前引物，分别与T790M突变位点以及上述“前SNP”的两种等位基因型完全互补，以提高检测的灵敏度。
在此基础上，本发明提供了一种检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，其包括：(a)与EGFR基因T790M突变位点及邻近位点的序列互补的前引物，所述的前引物长度为10-25bp，且该前引物的3’末端序列包含“5’-ACTCATCAT-3’”；(b)后引物；该后引物和前引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-100bp；和(c)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
所述的前引物的长度可以是10-25bp，较佳地可以是10-20bp。在此基础上，本发明人进一步考察了不同长度的前引物对于突变基因与野生基因的分辨能力，长度为12-20bp的引物长度是更为理想的。
作为本发明的优选形式，所述的前引物是选自下组所示核苷酸序列的前引物：SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5或SEQID NO:6。
组织和血液样本中，除了突变型DNA，还含有大量野生型DNA，对于检测的特异性造成了干扰。因此，作为本发明的优选方式，针对EGFR基因T790M突变位点以及上述“前SNP”的两种等位基因型，还应用竞争性Block寡聚核苷酸来排除野生型DNA的干扰，以进一步提高检测的特异性。Block寡聚核苷酸与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补，在有野生型基因存在的情况下，Block寡聚核苷酸能够封闭野生型基因，防止野生型基因扩增造成的假阳性。更为优选地，所述的竞争性Block寡聚核苷酸包括：SEQID NO:18和SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。
作为本发明的优选方式，所述的前引物的核苷酸序列中，还设置一个与EGFR基因模板中相应位点碱基错配的碱基。该错配的碱基设置于EGFR基因T790M突变位点以及“前SNP”位点以外的区域上。错配碱基的设置有利于进一步提高检测的特异性。更优选地，包含错配碱基的前引物序列具有“5’-ACTCATCAT-3’”中第2-8位中任一碱基由其它碱基替换而形成的序列。更为优选地，所述的前引物是选自下组所示核苷酸序列的前引物：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11，这些前引物中均引入了错配的碱基，检测特异性更好。
所述的特异性针对扩增产物的探针可对扩增产物进行特异性检测。较佳地，所述的探针是带有可检测标记的探针，如荧光探针。例如，所述的探针是Taqman MGB探针，从而便于实时荧光检测。TaqMan探针法的核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。TaqMan MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团。例如，可以选择FAM荧光信号或ROX荧光信号。
本发明所述试剂盒中还包括(但不限于)：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，镁离子等。以及还可包括说明操作方法的使用说明书，从而有利于本领域技术人员方便地实施检测。
本发明还提供了一种检测EGFR基因T790M突变的方法，所述方法包括：(i)以待测基因为模板，以所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中EGFR基因T790M突变类型。若经测定发现，对应于EGFR第790位氨基酸，其密码子由ACG突变为ATG，则判断为发生T790M突变。
本发明所述的方法，可以是临床诊断方法，也可以是非诊断性的方法。例如，仅在实验室中应用该方法分析EGFR的变异情况，进行研究分析，这种实施方式不面对患者，不给出诊断结果，属于非诊断性的方法。
由于每个样本的SNP位点是突变还是野生型是未知的，所以在实际样本检测时，分别采用两种前引物和相应的BLOCK寡核苷酸单独检测，只要任何一种引物的检测结果是阳性，则该样本为T790M突变阳性。这样，不论SNP位点为野生或突变型，均有相匹配的引物，因而检出率高于以往只用一种引物(通常是只与野生型SNP配对)的情况。
本发明结合了两种高分辨引物，竞争性Block寡聚核苷酸和荧光特异探针技术，可以更准确和灵敏地检测样本中的T790M突变，检测灵敏度可达到0.01％，显著高于测序法和传统的ARMS-PCR方法，尤其是在对T790M突变含量低的血液样本的检测上显现了极大的优势，可用于患者耐药情况的跟踪检测，为医生提供更详细的信息，及时做出用药调整。本发明的试剂盒，可以适用于绝大多数的复杂样本，包括血液标本，FFPE样本；并可用于血液样本耐药基因的跟踪检测，及时的做出用药调整。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1、试剂
定量PCR检测试剂Realtime PCR Master Mix购自日本TOYOBO公司。
组织基因组抽提试剂QIAamp DNA FFPE Tissue Kit与全血基因组抽提试剂QIAamp DNA blood Mini Kit均购自QIAGEN China(shanghai)Co.，Ltd.。
血浆游离DNA抽提试剂，核酸提取纯化试剂盒(吸附柱法)购自格诺思博生物科技南通有限公司。
荧光定量PCR扩增仪ABI 7300购自Applied Biosystems公司。
PCR所用引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
Taqman MGB探针购自Life Technologies公司。
其余试剂均购自Sigma Aldrich公司。
2、寡聚核苷酸序列
突变检测所用引物、Taqman MGB探针与Block寡聚核苷酸序列见表1。
表1、突变检测所用引物、探针与Block寡聚核苷酸序列
注：引物名称中，首字母F表示正向引物，首字母R表示反向引物，首字母B表示Block寡聚核苷酸，首字母P表示MGB探针。F-Exon4、R-Exon4、P-Exon4用于检测EGFR基因保守区域4号外显子。
3、质粒构建
取健康人抗凝血200微升，用全血基因组抽提试剂盒(QIAamp DNA bloodMini Kit)抽提得到基因组，用表2中对应的扩增引物(SEQ ID NO:20，SEQ IDNO:21)进行扩增，扩增产物与pMD18-T Vector连接，再将连接产物加入到100微升的DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟，加入500微升SOC培养基，37℃培养箱中，培养60分钟，培养结束后，将培养液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上过夜培养，形成单菌落。挑选白色菌落，进行测序验证，测序结果证明已成功构建“前SNP”与20外显子T790M位点均为野生型的质粒，并命名为T-SNP(wt)-790(wt)。
其它质粒的构建方法如下：以野生型质粒T-SNP(wt)-790(wt)为模板，用表2中对应的扩增引物(SEQ ID NO:22-SEQ ID NO:27)进行扩增，将扩增产物用Dpn I酶消化2小时后，胶回收酶切产物，再将回收产物加入到100微升的DH5α感受态细胞中，与pMD18-T Vector进行连接，后续方法同上，经测序验证正确。构建的质粒及所用引物见表2。
表2、质粒类型及构建所用引物
注：引物名称中，首字母F表示正向引物，首字母R表示反向引物，首字母B表示Block寡聚核苷酸，首字母P表示MGB探针。
4、组织和血浆游离DNA的提取
抽提切片样本的DNA时，使用QIAGEN公司的石蜡组织DNA提取试剂盒。抽提血浆游离DNA时，使用格诺思博生物科技南通有限公司的核酸提取纯化试剂盒(吸附柱法)。
实施例
实施例1、引物的选择
本发明人将检测位点设计于前引物上，即前引物的3’末端碱基与T790M位点突变型完全互补，因此前引物是区分突变型与野生型基因的关键。本发明人发现，由于EGFR基因中在T790M位点相应碱基前存在“前SNP”，对于含有该SNP变异的样本，仅采用与该位点为野生型等位基因的模板完全匹配的引物，进行检测时，由于引物中存在不匹配的碱基，会降低检测效率。因此，本发明人设计了两种前引物，分别与T790M突变位点以及上述“前SNP”的两种等位基因型完全互补。
以“前SNP”为变异型的T790M突变检测为例，将“前SNP”为变异型、T790M位点为突变型质粒[T-SNP(mut)-790(mut)]共20拷贝，掺入到2.0×104拷贝的对应的野生型质粒[T-SNP(mut)-790(wt)]中，进行实时荧光PCR检测，计算两者Ct的差值，△Ct＝Ct野生型-Ct突变型。
本实施例应用的不同长度的前引物序列见表3，后引物是R-790，探针是P-790。
表3、不同长度的前引物序列
扩增反应体系见表4。
表4、扩增反应体系
| 组份 | 用量 |
| Realtime PCR Master Mix | 25μL |
| 扩增引物 | 300nM |
| 探针 | 100nM |
| 扩增模板 | 5μL |
反应程序见表5，在步骤3中61℃退火时检测荧光信号，检测荧光选择FAM与ROX。
表5、扩增反应程序
| 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 |
| 1 | 1 | 95℃ | 2min |
| 2 | 50 | 95℃ | 10sec |
| 3 | 50 | 61℃ | 30sec |
结果见表6。
表6、引物的选择
以上结果显示，前引物长度对于T790M突变检测分辨能力有一定的影响，较佳的前引物长度为12-20bp。在前引物中引入一个错配碱基，可进一步提高检测的特异性。
实施例2、竞争性Block寡聚核苷酸的作用
本发明人针对EGFR基因T790M突变位点以及上述“前SNP”的两种等位基因型，分别设计了竞争性Block寡聚核苷酸。Block寡聚核苷酸与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补，在有野生型基因存在的情况下，Block寡聚核苷酸能够封闭野生型基因，防止野生型基因的扩增造成假阳性，因此可以提高检测的特异性。
以“前SNP”为变异型的T790M突变检测为例，将“前SNP”为变异型、T790M位点为突变型质粒[T-SNP(mut)-790(mut)]共20拷贝，掺入到2.0×104拷贝的对应的野生型质粒[T-SNP(mut)-790(wt)]中，在加入或不加竞争性Block寡聚核苷酸的条件下，进行实时荧光PCR检测，计算两者CT的差值，以考察Block寡聚核苷酸的作用。
本实施例应用的前引物是F-SNP(mut)-9，后引物是R-790，探针是P-790，Block寡聚核苷酸是B-SNP(mut)。扩增反应体系和反应程序同实施例1。结果见表7。
表7、Block效果
以上结果显示，针对“前SNP”为变异型的T790M的突变检测，在加入竞争性Block寡聚核苷酸后，△CT由4.7增加到6.6。由此可见，在有野生型背景存在的情况下，加入竞争性Block寡聚核苷酸能够提高突变检测的特异性。
实施例3、扩增效率比较
将“前SNP”为变异型或野生型，T790M位点为突变型的两种质粒[T-SNP(mut)-790(mut)，T-SNP(wt)-790(mut)]，经紫外定量，分别稀释至4000、400、40、4和0.4拷贝/uL，作为模板，向PCR反应体系中加入5μL模板(则每个反应的模板数分别为20000、2000、200、20和2拷贝/反应)，进行实时荧光PCR检测，比较Ct值和扩增效率的差异。
本实施例应用的两种质粒模板及对应的前引物和Block寡聚核苷酸见表8，后引物是R-790，探针是P-790。扩增反应体系和反应程序同实施例1。结果见表9。
表8、模板质粒及对应的前引物和Block寡聚核苷酸
| 应用模板质粒 | 前引物 | Block寡聚核苷酸 |
| T-SNP(mut)-790(mut) | F-SNP(mut)-9 | B-SNP(mut) |
| T-SNP(wt)-790(mut) | F-SNP(wt) | B-SNP(wt) |
表9、扩增效率比较结果
以上结果显示，分别用与两种质粒模板完全配对(除引入的一个错配碱基外)的引物进行扩增时，各浓度梯度的模板Ct值和扩增效率一致。
实施例4、灵敏度
将“前SNP”为变异型、T790M位点为突变型质粒[T-SNP(mut)-790(mut)]梯度掺入到2.0×104拷贝的对应的野生型质粒[T-SNP(mut)-790(wt)]中，掺入比例见表10，进行实时荧光PCR检测，考察两种引物对于“前SNP”为变异型的T790M突变检测的灵敏度。
本实施例应用的两种前引物分别是F-SNP(mut)-9和F-SNP(wt)，后引物是R-790，探针是P-790，Block寡聚核苷酸分别是B-SNP(mut)和B-SNP(wt)。结果见表10。
表10、灵敏度比较结果
以上结果显示，当采用与突变型质粒[T-SNP(mut)-790(mut)]完全配对(除引入的一个错配碱基外)的引物[F-SNP(mut)-9]进行扩增时，突变比例在0.01％时与野生型质粒[T-SNP(mut)-790(wt)]仍有较好的区分度；当采用“前SNP”错配的引物[F-SNP(wt)]进行扩增时，突变比例在0.01％和0.1％时与野生型质粒的区分度不佳，检测能力仅为1％。
实施例5、对血浆样本的检出能力
获取150例临床肺癌组织样本及对应的血浆样本，对组织样本一一进行测序，确定这些样本的“前SNP”和T790M位点的突变情况。提取对应血浆样本的基因组DNA，作为模板，分别向PCR反应体系中加入5μL模板，进行实时荧光PCR检测，考察两种引物对于“前SNP”为变异型的临床肺癌血浆样本T790M突变的检出能力。同时对EGFR基因第4外显子的保守区域进行检测，作为对所提取的DNA模板的质量和用量进行质控。通过计算△Ct(突变Ct值与Exon4质控Ct值的差值)进行判断，△Ct<9，样本为T790M突变阳性，否则为阴性或低于试剂盒的检测下限。结果见表11。
本实施例对于T790M突变检测应用的两种前引物分别是F-SNP(mut)-9和F-SNP(wt)，后引物是R-790，探针是P-790，Block寡聚核苷酸分别是B-SNP(mut)和B-SNP(wt)；对于保守区域检测应用的前引物是F-Exon4，后引物是R-Exon4，探针是P-Exon4。
表11、对血浆样本检出能力的比较结果
以上结果显示，150例组织样本经测序，发现39例T790M突变阳性，其中21例为“前SNP”野生型，18例为“前SNP”变异型。仅采用单一引物[F-SNP(wt)]进行检测时，对于“前SNP”为野生型的样本，检出21例T790M突变阳性。但是对于“前SNP”为变异型的样本，仅检出7例T790M突变阳性，其余11例为阴性，与对应组织样本测序结果的总体符合率为71.8％，说明“前SNP”错配的引物对于T790M突变含量低的样本检出能力低。而分别采用两种前引物[F-SNP(mut)-9、F-SNP(wt)]进行检测，分别与“前SNP”突变型或野生型模板完全配对(除引入的一个错配碱基外)，扩增效率较高，共检出39例T790M突变阳性，与测序符合率为100％，极大提高了对于血浆样本检测的灵敏度和准确性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：
(a)与EGFR基因T790M突变位点及邻近位点的序列互补的前引物，所述的前引物长度为10-25bp，且该前引物的3’末端序列包含“5’-ACTCATCAT-3’”序列或该序列中第2-8位中任一碱基由其它碱基替换而形成的序列；
(b)后引物；该后引物和前引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-100bp；和
(c)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的前引物的长度为10-20bp；较佳地为12-20bp。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的该序列中第2-8位中任一碱基由其它碱基替换而形成的序列包括：“5’-ACACATCAT-3’”。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：
(d)靶向点基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸，其与野生型基因完全互补，与突变基因部分互补。
5.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的竞争性Block寡聚核苷酸包括：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的前引物是选自下组所示核苷酸序列的前引物：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6；或
所述的前引物是选自下组所示核苷酸序列的前引物：SEQ ID NO:7，SEQID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11；或
所述的后引物具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，且所述的后引物长度为16-25bp。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：与EGFR基因T790M突变位点及邻近位点的序列互补的前引物b，所述的前引物b长度为10-25bp，且该前引物b的3’末端序列包含“5’-GCTCATCAT-3’”序列或该序列中第2-8位中任一碱基由其它碱基替换而形成的序列；较佳地为包含“5’-GCACATCAT-3’”；更佳地该前引物b的序列如SEQ ID NO:12所示。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，说明操作方法的使用说明书。
9.权利要求1-8任一所述的试剂盒的用途，用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒。
10.一种检测EGFR基因T790M突变的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)以待测基因为模板，以权利要求1-8任一所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；
(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中EGFR基因T790M突变类型。
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