CN109136367A - 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提高BRAF基因V600E突变的诊断效率的方法。本发明人优化了检测BRAF基因V600E位点突变的检测试剂，在此基础上提供了检测BRAF基因V600E位点突变的试剂盒、用途及检测方法。
Description
技术领域
本发明属于诊断领域，更具体地，本发明涉及提高BRAF基因V600E突变的诊断效率的方法。
背景技术
BRAF基因又称鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1基因，是人类最重要的原癌基因之一，主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中。
BRAF基因突变绝大多数集中在第15号外显子第1799位碱基(T>A)，导致编码的氨基酸变化(V600E)。该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，驱动肿瘤细胞的生长增殖和侵袭转移。BRAF基因V600E突变检测可用于指导黑色素瘤患者BRAF激酶抑制剂的使用和结直肠癌EGFR抗体的靶向治疗，还可作为结直肠癌和甲状腺癌患者辅助诊断和病情预后的一项重要指标。
目前常用的BRAF V600E突变检测方法有测序法和ARMS-PCR法。测序法灵敏度较低约20％，且操作复杂，检测时间较长。ARMS-PCR法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，需有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3’则导致PCR不能延伸。ARMS-PCR方法能够达到1％的灵敏度，对于突变比例较高的肿瘤组织样本尚能够满足检测需求，但是对于突变含量低的组织样本，尤其是取材方便的液态活检样本，如血液、尿液和唾液样本，难以有效检测。另外，有研究表明，基因敏感突变的比例与靶向药物疗效关系密切，而测序法和ARMS-PCR方法均为定性检测，仅能提供基因有无突变的信息，无法给出肿瘤突变的比例，不足以判断突变弱阳性患者是否能受益于靶向治疗。
因此，本领域需要开发改进的或新的BRAF V600E突变检测方法，来改变上述现有技术中存在的现状。
发明内容
本发明的目的在于提供提高BRAF基因V600E突变的诊断效率的方法。
在本发明的第一方面，提供一种检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)扩增BRAF基因V600E突变位点区域的特异性前引物和后引物，所述的特异性前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～150bp(较佳地为50-100bp；例如55，60bp，70bp，80bp)；所述特异性前引物与突变型基因位点及邻近序列完全互补；较佳地，其3’末端碱基与BRAF基因V600E突变位点碱基互补；或
扩增BRAF基因V600E突变位点区域的前引物和特异性后引物，所述的前引物和特异性后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～150bp(较佳地为50-100bp；例如55，60bp，70bp，80bp)；所述特异性后引物与突变型基因位点及邻近序列完全互补；较佳地，其3’末端碱基与BRAF基因V600E突变位点碱基互补。
(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
在一个优选例中，所述的可检测标记是荧光标记。
在另一优选例中，所述的BRAF基因V600E突变为：BRAF基因的第15号外显子第1799位碱基发生T>A的突变。
在另一优选例中，所述的特异性前引物的长度为10-25bp；较佳地为12-20bp；或所述的特异性后引物的长度为10-25bp；较佳地为12-20bp。
在另一优选例中，所述特异性前引物是选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ IDNO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10；较佳地为选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9。
在另一优选例中，与所述特异性前引物配合的后引物是选自下组的引物：SEQ IDNO:11，SEQ ID NO:12。
在另一优选例中，所述特异性后引物是选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ IDNO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21；较佳地为选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ IDNO:20。
在另一优选例中，与所述特异性后引物配合的前引物是选自下组的引物：SEQ IDNO:22，SEQ ID NO:23。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，说明操作方法的使用说明书。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：(3)靶向点基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸，其与野生型基因完全互补，与突变基因部分互补。
在另一优选例中，所述的竞争性Block寡聚核苷酸包括：SEQ ID NO:26或SEQ IDNO:27所示核苷酸序列的寡聚核苷酸；较佳地，所述的竞争性Block寡聚核苷酸是：SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:27所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于检测BRAF基因V600E突变。
在一个优选例中，所述的用途为非诊断性的用途。例如，仅应用于在实验室中分析BRAF的变异情况。
在本发明的另一方面，提供一种检测BRAF基因V600E突变的方法，所述方法包括：
(i)以含有待测基因的样品为模板，以前面任一所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；
(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中BRAF基因V600E突变类型。
在一个优选例中，所述方法中，若经测定发现，对应于BRAF第600位氨基酸相应的核苷酸序列，第15号外显子第1799位碱基发生T>A的突变。
在另一优选例中，所述的方法为非诊断性的方法。例如，仅在实验室中应用该方法分析BRAF的变异情况。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、定量PCR扩增检测的定量标准曲线。
A、BRAF V600E定量标准曲线(F-3)。
B、BRAF V600E定量标准曲线(AR-4)。
C、BRAF基因总拷贝定量标准曲线(TF-1)。
D、BRAF基因总拷贝定量标准曲线(TR-1)。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，优化了检测BRAF基因V600E位点突变的检测试剂，在此基础上，本发明提供了检测BRAF基因V600E位点突变的试剂盒、用途及检测方法。
如本文所用，所述的“BRAF基因V600E突变”是指对应于BRAF多肽的第600位，发生氨基酸由V到E的突变；在核苷酸水平上，也即是：BRAF基因的第15号外显子第1799位碱基发生T>A的突变。
如本文所用，所述的“前引物”与“正向引物”可互换使用；所述的“后引物”与“反向引物”可互换使用
如本文所用，所述的“特异性前引物”是针对BRAF基因V600E突变位点所设计的引物，其与突变型基因位点及邻近序列完全互补，较佳地其3’末端碱基与BRAF基因V600E突变位点碱基互补。与该“特异性前引物”相配合，还存在一后引物，该后引物针对于BRAF基因的核苷酸序列的其它位置，与该“特异性前引物”能够PCR扩增获得合适长度的扩增产物。
如本文所用，所述的“特异性后引物”是针对BRAF基因V600E突变位点所设计的引物，其与突变型基因位点及邻近序列完全互补，较佳地其3’末端碱基与BRAF基因V600E突变位点碱基互补。与该“特异性后引物”相配合，还存在一前引物，该前引物针对于BRAF基因的核苷酸序列的其它位置，与该“特异性后引物”能够PCR扩增获得合适长度的扩增产物。
如本文所用，“互补”是指核苷酸的序列之间可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。
一个方面，本发明提供了一种检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，其包括：(1)扩增BRAF基因V600E突变位点区域的特异性前引物和后引物，所述的特异性前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～150bp(较佳地为50-100bp；例如55，60bp，70bp，80bp)；所述特异性前引物与突变型基因位点及邻近序列完全互补；较佳地其3’末端碱基与BRAF基因V600E突变位点碱基互补；和(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
另一方面，本发明提供了一种检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，其包括：(1)扩增BRAF基因V600E突变位点区域的前引物和特异性后引物，所述的前引物和特异性后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～150bp(较佳地为50-100bp；例如55，60bp，70bp，80bp)；所述特异性后引物与突变型基因位点及邻近序列完全互补；较佳地其3’末端碱基与BRAF基因V600E突变位点碱基互补；和(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
本发明中，所述的特异性前引物或特异性后引物的长度可以是10-25bp。在此基础上，本发明人进一步考察了不同长度的特异性前引物或特异性后引物对于突变基因与野生基因的分辨能力，长度为12-20bp的特异性前引物或特异性后引物是更为理想的。
作为本发明的优选形式，所述特异性前引物是选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10；较佳地为选自下组所示核苷酸序列的特异性前引物：SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9。较佳地，与所述特异性前引物配合的后引物是选自下组的引物：SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12。
作为本发明的优选形式，所述特异性后引物是选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21。较佳地，与所述后引物配合的前引物是选自下组的引物：SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23。
待测样本中，除了突变型DNA，还含有大量野生型DNA，对于检测的特异性造成了干扰。本发明人经过研究、筛选和反复试验，针对BRAF基因V600E突变位点，选择到合适的竞争性Block寡聚核苷酸来排除野生型DNA的干扰，以进一步提高检测的特异性。Block寡聚核苷酸与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补，在有野生型基因存在的情况下，Block寡聚核苷酸能够封闭野生型基因，防止野生型基因扩增造成的假阳性。更为优选地，所述的竞争性Block寡聚核苷酸是SEQ ID NO:26和27所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。
所述的特异性针对扩增产物的探针可对扩增产物进行特异性检测。较佳地，所述的探针是带有可检测标记的探针，如荧光探针。例如，所述的探针是Taqman MGB探针，从而便于实时荧光检测。TaqMan探针法的核心是利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。TaqMan MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-FluorescentQuencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团。例如，可以选择FAM荧光信号或ROX荧光信号。
本发明所述试剂盒中还包括(但不限于)：DNA扩增试剂，PCR扩增缓冲液，镁离子等。以及还可包括说明操作方法的使用说明书，从而有利于本领域技术人员方便地实施检测。
本发明还提供了一种检测BRAF基因V600E突变的方法，所述方法包括：(i)以待测基因为模板，以所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中BRAF基因V600E突变类型。若经测定发现，对应于BRAF第15号外显子，其第1799位碱基发生T>A的突变，则判断为发生V600E突变。
本发明所述的方法，可以是临床诊断方法，也可以是非诊断性的方法。例如，仅在实验室中应用该方法分析BRAF的变异情况，进行研究分析，这种实施方式不面对患者，不给出诊断结果，属于非诊断性的方法。
本发明的试剂盒或方法，结合了高分辨引物、竞争性Block寡聚核苷酸和荧光特异探针技术，可以更准确和灵敏地检测样本中的V600E突变，检测灵敏度可达到0.01％，显著高于测序法和传统的ARMS-PCR方法，尤其是在对V600E突变含量低的液态活检样本的检测上显现了极大的优势。可以适用于绝大多数的复杂样本，包括FFPE、血液、尿液和唾液样本。
并且本发明的试剂盒使用校准曲线对BRAF突变和基因的拷贝数进行绝对定量检测，计算突变基因所占比例，可以为医生提供更详细的信息，从而作出更准确的用药指导。
本发明通过采用高分辨的特异性引物、竞争性Block寡聚核苷酸和对扩增条件的优化，达到的出乎意料的技术效果主要在于：
(1)检测灵敏度可达到0.01％，显著高于测序法和传统的ARMS-PCR方法(传统的ARMS-PCR方法的检测灵敏度大约为1％)，因此对于V600E突变含量低的液态活检样本(如血液、尿液和唾液样本)的检测显现了极大的优势。
(2)使用校准曲线对BRAF突变和基因的拷贝数进行绝对定量检测，计算突变基因所占比例，可以为医生提供更详细的信息，从而作出更准确的用药指导。
(3)与ddPCR检测突变的方法相比，成本更低、操作更简便、实验周期更短。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1、试剂
定量PCR检测试剂Realtime PCR Master Mix，KOD Plus Mμtagenesis Kit购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。
PCR所用引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
Taqman MGB探针购自Life Technologies公司。
感受态大肠杆菌DH5α、Universal DNA纯化回收试剂盒和无内毒素质粒中量提取试剂盒购自天根生化(北京)有限公司。
pMD18-T载体质粒购自宝生物工程(大连)有限公司。
组织基因组抽提试剂QIAamp DNA FFPE Tissue Kit、全血基因组抽提试剂QIAampDNA blood Mini Kit与尿液游离DNA提取试剂QIAamp Circulating Nucleik Acid Kit，均购自QIAGEN China(shanghai)Co.，Ltd.。
血浆游离DNA提取纯化试剂盒(吸附柱法)购自格诺思博生物科技南通有限公司。
其他试剂购自Sigma Aldrich公司。
2、质粒构建
取健康人抗凝血200微升，用全血基因组抽提试剂盒(QIAamp DNA blood MiniKit)抽提得到基因组，用表1中对应的扩增引物(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2)进行扩增，扩增产物与pMD18-T Vector连接，再将连接产物加入到100微升的DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟，加入500微升SOC培养基，37℃培养箱中，培养60分钟，培养结束后，将培养液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上过夜培养，形成单菌落。挑选白色菌落，进行测序验证，测序结果证明已成功构建V600E位点为野生型的质粒，并命名为pWT-V600E。
突变型质粒的构建方法如下：以野生型质粒pWT-V600E为模板，用表2中对应的扩增引物(SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4)进行扩增，将扩增产物用Dpn I酶消化2小时后，胶回收酶切产物，再将回收产物加入到100微升的DH5α感受态细胞中，后续方法同上，经测序验证正确。并命名为突变型质粒pMUT-V600E。
构建的质粒及所用引物见表1。
表1、质粒构建所用引物
3、组织和血浆游离DNA的提取
抽提切片样本的DNA时，使用QIAGEN公司的石蜡组织DNA提取试剂盒。抽提血浆与唾液游离DNA时，使用格诺思博生物科技南通有限公司的核酸提取纯化试剂盒(吸附柱法)。抽提尿液游离DNA时，使用QIAGEN公司的循环核酸提取试剂盒。
实施例1、引物的选择
本发明人将待检测的突变位点设计于前引物或后引物上，包含待检测位点的引物(含有与突变位点互补的碱基)即为特异性引物，其3’末端碱基与V600E位点突变型完全互补，是区分突变型与野生型基因的关键。本实施例考察了不同长度的特异性引物对于突变基因与野生基因的分辨能力。
将V600E位点为突变型质粒pMUT-V600E共20拷贝，掺入到2.0×104拷贝的对应的野生型质粒pWT-V600E中，进行实时荧光PCR检测，计算两者Ct的差值，△Ct＝Ct野生型-Ct突变型。
本实施例应用的不同长度的特异性引物、及对应的另一侧扩增引物和探针序列见表2与表3。
表2、将前引物作为特异性引物
表3、将后引物作为特异性引物
扩增反应体系见表4。
表4、扩增反应体系
| 组份 | 用量 |
| Realtime PCR Master Mix | 25μL |
| 扩增引物 | 300nM |
| 探针 | 100nM |
| 扩增模板 | 5μL |
反应程序见表5，在步骤3中60℃退火时检测荧光信号，检测荧光选择FAM与ROX。
表5、扩增反应程序
| 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 |
| 1 | 1 | 95℃ | 2min |
| 2 | 50 | 95℃ | 10sec |
| 3 | 50 | 60℃ | 30sec |
结果见表6。
表6、引物的选择
以上结果显示，特异性引物的长度对于V600E突变检测分辨能力有一定的影响，较佳的特异性引物长度为12-20bp。
实施例2、竞争性Block寡聚核苷酸的作用
考虑到组织和血液样本中，除了突变型DNA，还含有大量野生型DNA，为了进一步提高检测的特异性，本发明人针对BRAF基因V600E突变位点及邻近序列的特点，经过分析比较结合实验验证，找到了合适的竞争性Block寡聚核苷酸。Block寡聚核苷酸与野生型基因完全互补，而与突变基因部分互补，在有野生型基因存在的情况下，Block寡聚核苷酸能够封闭野生型基因，防止野生型基因的扩增造成假阳性。
将V600E位点为突变型质粒(pMUT-V600E)共20拷贝，掺入到2.0×104拷贝的对应的野生型质粒(pWT-V600E)中，进行实时荧光PCR检测，计算两者Ct的差值，以考察Block寡聚核苷酸的作用。
本实施例应用的引物和探针分别是F-3(SEQ ID NO:7)、R-1(SEQ ID NO:11)和P-3(SEQ ID NO:15)，或AR-4(SEQ ID NO:19)、AF-2(SEQ ID NO:23)和AP-1(SEQ ID NO:24)，Block寡聚核苷酸是B-1或B-2(SEQ IDNO:26～SEQ ID NO:27)，序列见表7。扩增反应体系和反应程序同实施例1。结果见表8。
表7、Block寡聚核苷酸序列
| 引物名称 | SEQ ID NO: | 序列(5’-3’) |
| B-1 | 26 | TAGCTACAGTGAAATC |
| B-2 | 27 | GAGATTTCACTGTAGCT |
表8、Block效果
以上结果显示，在加入竞争性Block寡聚核苷酸后，△Ct由4.11或3.83增加到6.21或6.32。
由此可见，在有野生型背景存在的情况下，加入本发明人设计的竞争性Block寡聚核苷酸能够极为显著地提高突变检测的特异性。
实施例3、灵敏度
将V600E位点为突变型质粒(pMUT-V600E)共20拷贝，掺入到2.0×104拷贝的对应的野生型质粒(pWT-V600E)中，掺入比例见表9，进行实时荧光PCR检测，考察突变检测体系的灵敏度。
本实施例应用的特异性引物、Block寡聚核苷酸、另一侧扩增引物、探针序列、扩增反应体系和反应程序同实施例2。结果见表9。
表9、灵敏度分析结果
以上结果显示，采用本发明的突变检测体系，V600E位点突变比例在0.01％时，与野生型质粒仍有较好的区分度。
实施例4、定量曲线
将模板质粒(pMUT-V600E)转化大肠杆菌DH5α，构建BRAF基因V600E突变位点的克隆，提取质粒，经紫外定量，分别稀释至4.0*104、4.0*103、4.0*102、4.0*101、4.0拷贝/μL，作为定量检测的校准品，向PCR反应体系中加入5μL校准品，按上述反应程序，进行定量PCR扩增检测，以考察定量曲线的性能。定量曲线的R2大于0.99，显示了良好的定量线形关系，证明了定量范围在20-200000拷贝。
本实施例应用的检测V600E突变的特异性引物、Block寡聚核苷酸、另一侧扩增引物、探针序列、扩增反应体系和反应程序同实施例2。检测BRAF基因总拷贝数的引物见表10。结果见图1。
表10、BRAF基因总拷贝数检测引物
| 引物名称 | SEQ ID NO： | 序列(5’-3’) |
| TF-1 | 28 | GATTTTGGTCTAGCTACA |
| TF-2 | 29 | TTTTGGTCTAGCTACA |
| TR-1 | 30 | ACCCACTCCATCGAGAT |
| TR-2 | 31 | CCACTCCATCGAGATT |
实施例5、配对组织、血浆、尿液与唾液样本的检测
获取14例临床甲状腺癌组织样本及对应的血浆、尿液与唾液样本，提取组织基因组DNA，及对应的血浆、尿液与唾液样本游离DNA。组织样本DNA用紫外定量并稀释至试剂盒要求的浓度范围内，血浆样本DNA无需稀释。分别向PCR反应体系中加入5μL模板，进行实时荧光PCR检测，考察本发明试剂盒的突变检测体系对临床甲状腺癌样本V600E突变的检出能力。同时对BRAF基因V600E突变邻近的保守区域进行检测，作为对所提取的DNA模板的质量和用量进行质控。通过计算突变基因所占比例进行判断，突变比例≤0.025％，样本为V600E突变阳性，否则为阴性或低于试剂盒的检测下限。分别计算配对组织与血浆、尿液和唾液样本的符合率。
本实施例对于V600E突变检测应用的特异性引物是F-3(SEQ ID NO:7)，另一侧扩增引物和探针序列分别是R-1(SEQ ID NO:11)和P-3(SEQ ID NO:15)，Block寡聚核苷酸是B-1，对于保守区域检测应用的引物是TF-1。扩增反应体系和反应程序同实施例1。结果见表11～13。
表11、组织与血浆配对检测
表12、组织与尿液配对检测
表13、组织与唾液配对检测
以上结果显示，本发明的试剂盒对于组织与相配对的血浆、尿液和唾液样本检测的符合率分别为71.4％、64.3％，57.1％，经配对卡方检验，P值均大于0.05。说明本发明的试剂盒对于血浆、尿液和唾液样本有较高的检测灵敏度和准确性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 格诺思博生物科技南通有限公司;上海格诺生物科技有限公司
<120> 提高BRAF基因V600E突变的诊断效率的方法
<130> 172534
<160> 31
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
ctacacctca gatatatttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
tgatttttgt gaatactggg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 3
ctagctacag agaaatctcg a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
tcgagatttc tctgtagcta g 21
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
tagctacaga 10
<210> 6
<211> 12
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<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
tctagctaca ga 12
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<220>
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<223> 引物
<400> 8
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 10
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 12
gcctcaattc ttaccatcca 20
<210> 13
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<212> DNA
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<220>
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<223> 探针
<400> 13
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<213> 人工序列
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<223> 探针
<400> 14
ggagtgggtc ccatcag 17
<210> 15
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> 探针
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<223> 引物
<400> 16
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<211> 12
<212> DNA
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<220>
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<223> 引物
<400> 17
atcgagattt ct 12
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
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<400> 18
tccatcgaga tttct 15
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 19
cactccatcg agatttct 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 20
cccactccat cgagatttct 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 21
tgggacccac tccatcgaga tttct 25
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 22
acttactaca cctcagat 18
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 23
atgaagacct cacagta 17
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 探针
<400> 24
gtagctagac caaaatca 18
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 探针
<400> 25
agaccaaaat caccta 16
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 26
tagctacagt gaaatc 16
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 27
gagatttcac tgtagct 17
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 28
gattttggtc tagctaca 18
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 29
ttttggtcta gctaca 16
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 30
acccactcca tcgagat 17
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 31
ccactccatc gagatt 16
Claims (10)
1.一种检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1)扩增BRAF基因V600E突变位点区域的特异性前引物和后引物，所述的特异性前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～150bp；所述特异性前引物与突变型基因位点及邻近序列完全互补；或
扩增BRAF基因V600E突变位点区域的前引物和特异性后引物，所述的前引物和特异性后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～150bp；所述特异性后引物与突变型基因位点及邻近序列完全互补；
(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性前引物的长度为10-25bp；较佳地为12-20bp；或
所述的特异性后引物的长度为10-25bp；较佳地为12-20bp。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性前引物是选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ IDNO:10；较佳地为选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，与所述特异性前引物配合的后引物是选自下组的引物：SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性后引物是选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21；较佳地为选自下组所示核苷酸序列的引物：SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，与所述特异性后引物配合的前引物是选自下组的引物：SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：
(3)靶向点基因突变位点对应的野生型位点的竞争性Block寡聚核苷酸，其与野生型基因完全互补，与突变基因部分互补。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的竞争性Block寡聚核苷酸包括：SEQID NO:26或SEQ ID NO:27所示核苷酸序列的寡聚核苷酸；较佳地，所述的竞争性Block寡聚核苷酸是：SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示核苷酸序列的寡聚核苷酸。
9.权利要求1-8任一所述的试剂盒的用途，用于检测BRAF基因V600E突变。
10.一种检测BRAF基因V600E突变的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)以含有待测基因的样品为模板，以权利要求1-8任一所述的试剂盒中的试剂进行PCR扩增；
(ii)分析PCR扩增产物，确定待测样品中BRAF基因V600E突变类型。
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