CN102154480A - 基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测方法及试剂盒 - Google Patents

基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN102154480A
CN102154480A CN2011100339036A CN201110033903A CN102154480A CN 102154480 A CN102154480 A CN 102154480A CN 2011100339036 A CN2011100339036 A CN 2011100339036A CN 201110033903 A CN201110033903 A CN 201110033903A CN 102154480 A CN102154480 A CN 102154480A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
enrichment
seq
arms
single stage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011100339036A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102154480B (zh
Inventor
陈唯军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu macro micro Pharmaceutical Technology Co., Ltd.
Original Assignee
陈唯军
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 陈唯军 filed Critical 陈唯军
Priority to CN201110033903.6A priority Critical patent/CN102154480B/zh
Publication of CN102154480A publication Critical patent/CN102154480A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102154480B publication Critical patent/CN102154480B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明一种基因突变的一步检测方法，该方法将酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR整合在一起，通过有效的温度和时间控制，一步即可完成酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR反应从而实现突变等位基因的检测。

Description

基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及酶切富集PCR技术和ARMS荧光定量PCR技术。
背景技术
近年来肿瘤的发病率逐年上升，肿瘤成为了人类健康的头号杀手。肿瘤的产生主要原因在于基因突变。大部分肿瘤患者在确诊时都是晚期，绝大多数晚期患者没有手术根治性治疗的机会，化放疗的临床效果也不理想。随着技术的进步，个体化医疗逐渐进入临床实践中。个体化治疗方案的确定，依赖于基因突变检测的结果。目前，一些医院和肺癌中心，已经开始着手组建专门用于肺癌临床诊断的基因突变检测机构，但是目前我国绝大多数医院并不具有基因突变检测的能力，检测的方法仍不成熟。
最新研究表明：B-raf基因突变被发现存在于肺癌、黑色素瘤、大肠癌等多种恶性肿瘤中，结合EGFR、K-ras基因突变的检测信息制定出最为适合病人个体的肿瘤治疗方案。为临床医生用药提供用药科学依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。因此，针对B-raf基因提供一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测方法成为目前临床上迫切的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因突变一步检测方法，本方法整合了酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR技术。
本发明的第一方面提供一种基因突变一步检测方法，在同一反应体系中包括样本DNA、限制性酶、富集引物、ARMS引物、TaqMan探针、聚合酶及缓冲液，控制反应条件依次进行如下反应：
1)限制性内切酶特异性地酶切样本DNA中待测野生型等位基因的要检测部分；
2)在反应1)的基础上，富集引物通过PCR反应富集样本DNA中覆盖待测基因突变位点的要检测部分的片段；
3)在反应2)的基础上，ARMS引物及Taqman探针通过荧光定量PCR反应对所述突变基因进行荧光检测。
在一个实施方案中，所述富集引物的Tm值比所述ARMS引物高5℃。
在另一个实施方案中，所述富集引物扩增片段长度是ARMS引物扩增片段的1.5倍以上。
在另一个实施方案中，所述ARMS引物3’末端碱基与所述突变基因的突变碱基完全互补或相同。
在另一个实施方案中，所述ARMS引物的3’末端第4个碱基引入错配碱基。
在另一个实施方案中，所述聚合酶扩增效率为每分钟约500bp。
在另一个实施方案中，要检测的基因突变是B-raf基因的点突变V600E。优选地，所述限制性内切酶为TspR1；所述富集引物的序列为：上游引物：CATCCTAACACATTTCAAGCCCCA(SEQ IDNO：1)，下游引物：GAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAAC(SEQ ID NO：2)；所述ARMS引物的序列为：上游引物：GGTGATTTTGGTCTAGCTATAGA(SEQ ID NO：3)，下游引物：CACAAAATGGATCCAGACAAC(SEQ ID NO：4)；所述Taqman探针的序列为：ATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGT(SEQ IDNO：5)。更优选地，反应条件为：1)37℃温浴30分钟；2)95℃10分钟；95℃20秒、65℃20秒、72℃60秒，共10个循环；3)95℃5秒、60℃30秒(收集荧光)，共40个循环。
本发明的第二方面提供一种B-raf基因的点突变V600E的一步检测试剂盒，包括：限制性内切酶TspRI；SEQ ID NO：1和2的富集引物；SEQ ID NO：3和4的ARMS引物以及5’端FAM标记的SEQ IDNO：5的Taqman探针。
在一个实施方案中，还包括一种扩增效率为每分钟约500bp的聚合酶及其缓冲液。在一个优选实施方案中，所述聚合酶为包含在Universal Taqman Mix(美国ABI公司)中的Taq酶。
本发明通过将酶切富集PCR和ARMS荧光定量PCR技术整合在一个反应体系中，一步即可实现对突变基因的富集和鉴定，减少了操作步骤，提高了检测灵敏度和特异性。
以B-raf基因的点突变V600E为例进行具体实施说明(B-raf野生型基因序列见Genbank No.NM_004333，V600E突变即该序列中编码B-raf蛋白第600个氨基酸缬氨酸的GTG密码子突变为编码丙氨酸的密码子GAG)。
附图说明
图1是检测的阳性结果。
具体实施方式
在本说明书中，“要检测部分”是指在不被酶切的情况下，可由所述富集引物通过PCR扩增的序列部分。“约500bp”是指500±100bp。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例
实施例1.引物和探针设计
1)富集引物设计
设计可扩增400-500bp片段的引物，相关参数为：Tm值65.0℃-68.0℃，GC值40.0％-65.0％，引物大小23±3bp。所设计的富集引物序列如下：
富集上游引物：CATCCTAACACATTTCAAGCCCCA(SEQ IDNO：1)
富集下游引物：GAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAAC(SEQ ID NO：2)
2)ARMS引物设计
设计可扩增一段80-120bp片段的引物，相关参数为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±3bp。上游ARMS引物的3’末端位于突变位点处，并与突变型基因相匹配，为提高特异性，在其3’末端第4个碱基处再引入一个错配碱基，所设计的ARMS引物序列如下：
ARMS上游引物：GGTGATTTTGGTCTAGCTATAGA(SEQ IDNO：3)
ARMS下游引物：CACAAAATGGATCCAGACAAC(SEQ IDNO：4)
3)探针设计
在ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
探针：ATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGT(SEQ ID NO：5)
上述引物和探针均由上海生工合成。
实施例2.V600E点突变的突变富集ARMS荧光定量PCR一步检测方法
本发明的突变富集ARMS一步检测方法整合了酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR技术，即在一个反应体系中分别独立进行酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR鉴定，具体过程为PCR仪上将25μl包括下表中组分的反应体系(其中样本基因组DNA是从大肠癌组织中提取的基因组DNA)在37℃下温浴30分钟，内切酶TspRI特异性地酶切B-raf野生型等位基因的要检测部分(该部分含有一个TspRI的限制酶切识别位点)，但不能酶切B-raf基因V600E突变型基因的要检测部分(上述位点中的t突变为a，因此不能为TspRI所识别)，从而降低了野生型基因对突变型基因的干扰；然后对包含突变碱基的要检测部分进行富集，在65℃变性温度下，ARMS引物不能进行有效工作，因此只有富集引物进行延伸和扩增；然后运行第二个PCR反应，在60℃延伸30秒，由于所选用的ABI Taq酶(包含在下述Universal Taqman Mix中)每分钟只能延伸约500个碱基，富集引物在30秒内不能进行有效延伸，形成不了循环，因此只进行ARMS引物的荧光PCR反应。
反应条件如下：37℃温浴30分钟；95℃10分钟；95℃20秒，65℃20秒，72℃60sec，共10个循环；95℃5秒，60℃30秒(收集荧光)，共40个循环。所用荧光定量PCR仪为ABI 7300。
实验结果如图1所示，表明突变检测结果为阳性。
Figure ISA00000430709100011
Figure ISA00000430709100021

Claims (11)

1.一种基因突变一步检测方法，在同一反应体系中包括样本DNA、限制性酶、富集引物、ARMS引物、TaqMan探针、聚合酶及缓冲液，控制反应条件依次进行如下反应：
1)限制性内切酶特异性地酶切样本DNA中待测野生型等位基因的要检测部分；
2)在反应1)的基础上，富集引物通过PCR反应富集样本DNA中覆盖待测基因突变位点的要检测部分的片段；
3)在反应2)的基础上，ARMS引物及5’端FAM标记的Taqman探针通过荧光定量PCR反应对所述突变基因进行荧光检测。
2.如权利要求1所述的一步法，其特征在于：所述富集引物的Tm值比所述ARMS引物高5℃。
3.如权利要求1或2所述的一步法，其特征在于：所述富集引物扩增片段长度是ARMS引物扩增片段的1.5倍以上。
4.如权利要求1-3任一项所述的一步法，其特征在于：所述ARMS引物3’末端碱基与所述突变基因的突变碱基完全互补或相同。
5.如权利要求1-4任一项所述的一步法，其特征在于：所述ARMS引物的3’末端第4个碱基引入错配碱基。
6.如权利要求1-5所述的一步法，其特征在于：所述聚合酶扩增效率为每分钟约500bp。
7.如权利要求1-6任一项所述的一步法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应的反应时间不足以使富集引物完成扩增反应。
8.如权利要求1-7所述的一步法，其特征在于：要检测的基因突变是B-raf基因的点突变V600E。
9.如权利要求8所述的一步法，其中：
所述限制性内切酶为TspR1；
所述富集引物的序列为：
上游引物：CATCCTAACACATTTCAAGCCCCA(SEQ ID NO：1)
下游引物：GAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAAC(SEQ IDNO：2)；
所述ARMS引物的序列为：
上游引物：GGTGATTTTGGTCTAGCTATAGA(SEQ ID NO：3)
下游引物：CACAAAATGGATCCAGACAAC(SEQ ID NO：4)；
所述Taqman探针的序列为：
ATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGT(SEQ ID NO：5)。
10.如权利要求9所述的一步法，其反应条件为：
1)37℃温浴30分钟；
2)95℃10分钟；95℃20秒、65℃20秒、72℃60秒，共10个循环；
3)95℃5秒、60℃30秒(收集荧光)，共40个循环。
11.B-raf基因的点突变V600E的检测试剂盒，包括：
限制性内切酶TspRI；
SEQ ID NO：1和2的富集引物；
SEQ ID NO：3和4的ARMS引物；
5′端FAM标记的SEQ ID NO：5的Taqman探针；
以及一种如权利要求6所述的聚合酶及其缓冲液。
CN201110033903.6A 2011-01-28 2011-01-28 基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测试剂盒 Active CN102154480B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110033903.6A CN102154480B (zh) 2011-01-28 2011-01-28 基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110033903.6A CN102154480B (zh) 2011-01-28 2011-01-28 基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102154480A true CN102154480A (zh) 2011-08-17
CN102154480B CN102154480B (zh) 2014-11-05

Family

ID=44436149

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110033903.6A Active CN102154480B (zh) 2011-01-28 2011-01-28 基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102154480B (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102660641A (zh) * 2012-04-18 2012-09-12 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和snp位点的试剂盒及方法
CN105063177A (zh) * 2015-05-14 2015-11-18 广州和实生物技术有限公司 Braf基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒
CN105861726A (zh) * 2016-06-08 2016-08-17 广东凯普生物科技股份有限公司 Braf基因突变检测试剂盒
CN107400716A (zh) * 2017-08-24 2017-11-28 上海生物芯片有限公司 人braf基因v600e突变的pcr检测方法、引物、探针及试剂盒
CN107419018A (zh) * 2012-02-16 2017-12-01 江苏宏微特斯医药科技有限公司 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CN108048569A (zh) * 2017-12-27 2018-05-18 广州誉嘉生物科技有限公司 Braf基因突变检测的引物和探针及应用
CN108070653A (zh) * 2016-11-15 2018-05-25 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 用于人braf基因突变检测的试剂盒及其应用
EP3212791A4 (en) * 2014-10-31 2018-10-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of detecting braf in cancer
CN109136367A (zh) * 2017-06-19 2019-01-04 格诺思博生物科技南通有限公司 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法
CN109628560A (zh) * 2019-01-30 2019-04-16 杭州瑞普基因科技有限公司 用于富集低频dna突变的dna探针及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANNE JARRY ET AL.: "Real-time allele-specific amplification for sensitive detection of the BRAF mutation V600E", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *
NEIL J. GIBSON: "The use of real-time PCR methods in DNA sequence variation analysis", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *
RE BOARD ET AL.: "Detection of BRAF mutations in the tumour and serum of patients enrolled in the AZD6244 (ARRY-142886) advanced melanoma phase II study", 《BRITISH JOURNAL OF CANCER》 *
郑薇薇: "ARMS 实时PCR 基因分型特异性的研究", 《厦门大学学报(自然科学版)》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107419018A (zh) * 2012-02-16 2017-12-01 江苏宏微特斯医药科技有限公司 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CN107419018B (zh) * 2012-02-16 2020-09-04 江苏宏微特斯医药科技有限公司 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CN102660641A (zh) * 2012-04-18 2012-09-12 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和snp位点的试剂盒及方法
CN102660641B (zh) * 2012-04-18 2014-11-19 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和snp位点的试剂盒及方法
US10947597B2 (en) 2014-10-31 2021-03-16 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for detecting BRAF in cancer
EP3212791A4 (en) * 2014-10-31 2018-10-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of detecting braf in cancer
CN105063177A (zh) * 2015-05-14 2015-11-18 广州和实生物技术有限公司 Braf基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒
CN105861726A (zh) * 2016-06-08 2016-08-17 广东凯普生物科技股份有限公司 Braf基因突变检测试剂盒
CN108070653A (zh) * 2016-11-15 2018-05-25 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 用于人braf基因突变检测的试剂盒及其应用
CN109136367A (zh) * 2017-06-19 2019-01-04 格诺思博生物科技南通有限公司 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法
CN109136367B (zh) * 2017-06-19 2022-03-18 格诺思博生物科技南通有限公司 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法
CN107400716A (zh) * 2017-08-24 2017-11-28 上海生物芯片有限公司 人braf基因v600e突变的pcr检测方法、引物、探针及试剂盒
CN108048569A (zh) * 2017-12-27 2018-05-18 广州誉嘉生物科技有限公司 Braf基因突变检测的引物和探针及应用
CN109628560A (zh) * 2019-01-30 2019-04-16 杭州瑞普基因科技有限公司 用于富集低频dna突变的dna探针及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102154480B (zh) 2014-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102154480B (zh) 基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测试剂盒
CN103255201B (zh) 一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒
CN102367478B (zh) 用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法
JP5719593B2 (ja) ポリヌクレオチドプライマー
CN101646783A (zh) 新型癌症标记物
CN104611427A (zh) 一种as-pcr技术引物设计方法、基因突变检测方法及试剂盒
CN109661477B (zh) 与乳腺癌相关的染色体相互作用的检测
CN106148498B (zh) Kras基因突变检测试剂盒及其应用
CN102220413B (zh) 检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变和外显子21点突变的方法
JPWO2016152812A1 (ja) 標的核酸の高感度検出方法
CN106148497A (zh) Braf基因突变检测试剂盒及其应用
CN105177118B (zh) 检测人egfr基因突变的引物和探针体系及试剂盒
CN109913482A (zh) Pik3ca-i874r突变基因及其在乳腺癌辅助诊断中的应用
CN111621583B (zh) 一种利什曼原虫的种群分型和基因溯源的方法
WO2016019633A1 (zh) 基因多态性变异位点早期评估乳腺癌风险的诊断试剂盒
US20140295431A1 (en) Method of allele-specific amplification
Linjawi et al. Tetra-primer ARMS PCR as an efficient alternative for SNPs detection in molecular diagnostic: A comparison study
CN107354197B (zh) 一种检测人类nras基因突变的试剂盒
CN111587292A (zh) 用于检测癌症相关突变的试剂盒和方法
CN111154883B (zh) 一种乳腺癌相关基因PIK3CA位点g.179220986A＞T突变体及其应用
CN110964833A (zh) 一种一管检测血浆游离dna中kras和braf基因突变的试剂盒
CN107312833B (zh) 用于检测人类brca1基因突变的lsp引物及试剂盒
EP1531184B1 (en) Method for genetic testing of bladder cancer
CN110055258A (zh) 一种乳腺癌相关基因ERBB2位点g.39717320G>A突变体及其应用
KR102616916B1 (ko) 발암성 돌연변이 유전자 검출용 가이드 rna 내지 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20160627

Address after: 226400, Zhujianglu Road County, Rudong province Jiangsu Port Street No. 888

Patentee after: Jiangsu macro micro Pharmaceutical Technology Co., Ltd.

Address before: 101300, B6, Shunyi District Airport Industrial District, Beijing

Patentee before: Chen Weijun