JPWO2016152812A1 - 標的核酸の高感度検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド;及び
(ii)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
を試料と接触させる工程を含む方法に関する。
(1)前記第一の発明の方法で試料中の非標的核酸を切断する工程;及び
(2)標的核酸を増幅する工程、に関する。
(1)前記第二の発明の方法で標的核酸を選択的に増幅する工程;及び
(2)上記工程(1)と同時に又は工程(1)の後で、標的核酸を検出する工程、に関する。
(a)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド;
(b)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;
(c)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(d)DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有する組成物、に関する。
(a)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド;
(b)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;
(c)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(d)DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有するキット、に関する。
(i)酸性高分子物質;
(ii)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(iii)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法、に関する。
本発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中において、非標的核酸のみを選択的に切断する方法を提供する。ここで、「標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸」とは、非標的核酸の塩基配列中に、標的核酸の塩基配列の少なくとも一部と相同性のある塩基配列が含まれていることを意味する。例えば、標的核酸が有している塩基配列に1以上の塩基置換を生じた塩基配列を有している非標的核酸、標的核酸が有している塩基配列に1以上の塩基の挿入がなされた塩基配列を有している非標的核酸、標的核酸が有している塩基配列に1以上の塩基の欠失が生じた塩基配列を有している非標的核酸などが挙げられる。相同な配列における塩基置換、挿入、又は欠失の数は、特に限定されない。しかしながら本発明では標的核酸と非標的核酸の塩基配列で少なくとも1塩基の違いがあれば当該核酸を区別することができる。さらに相違する塩基数が増加するにつれて、標的核酸と非標的核酸の識別精度も向上させることができる。
本発明の核酸の選択的な増幅方法は、類似した塩基配列の領域を有する2種の核酸(標的核酸及び非標的核酸)が存在する試料において、前記核酸のうちの一方(標的核酸)を選択的に増幅する方法であって、(1)本発明の非標的核酸の選択的切断方法で試料中の非標的核酸を切断する工程、及び(2)標的核酸を増幅する工程、を含むことを特徴とする。前記の2つの工程は、それぞれを段階的に行っても良いし、両工程を同時に行ってもよい。即ち、後者では核酸増幅反応中に非標的核酸の切断が生じていればよい。
本発明の標的核酸の選択的検出方法は、(1)本発明の標的核酸の選択的増幅方法で標的核酸を増幅する工程、及び(2)上記工程(1)と同時又は工程(1)の後で、標的核酸を検出する工程、を含むことを特徴とする。当該検出方法を多量の非標的核酸と微量の標的核酸とを含有する試料に適用した場合には、出発試料中の非標的核酸と標的核酸の存在比率と検出工程での存在比率は逆転する。言い換えれば、非標的核酸の増幅を抑制しつつ標的核酸を増幅することにより、標的核酸を感度よく検出することが可能となる。本発明の検出方法は、工程(1)の後に工程(2)を実施してもよく、両工程を同時に実施することもできる。工程(2)の検出方法は、増幅物の検出や定量を実施する方法でもよく、増幅物をその塩基配列特異的に検出する方法であってもよい。例えばエンドポイント検出では、ダイレクトシーケンス法やインターカーレーターによる高解像度融解曲線解析(HRM:High Resolution Melting Curve Analysis)法を用いることができる。またリアルタイム検出では、配列特異的プローブを使用するサイクリング・プローブ法(例えば国際公開第2003/074696号)やTaqMan(登録商標)アッセイ法(例えば国際公開第92/02638号)と組み合わせることができる。特に好ましくは、PCR法と組み合わせることができるサイクリング・プローブ法による検出である。
本発明の標的核酸の選択的増幅方法及び/又は標的核酸の選択的検出方法のための組成物としては、(a)標非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、(b)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、(c)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、及び(d)DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、を含有する組成物が例示される。
本発明の標的核酸の選択的増幅方法及び/又は標的核酸の選択的検出方法のためのキットとしては、(a)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、(b)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、(c)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、及び(d)DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、を含有するキットが例示される。
本発明の非標的核酸の選択的切断方法の別態様としては、酸性高分子物質存在下で標的核酸と、標的核酸と相同な領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、(i)酸性高分子物質、(ii)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び(iii)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法が例示される。
(1)検出用テンプレートの準備
GenBank accession No.NC_000007で公開されているHuman EGFR遺伝子のCDS配列情報から、後述のプライマー EGFR_T790M_F及びEGFR_T790M_Rに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域の塩基配列を含有するDNAを人工合成した。この際、EGFR遺伝子における塩基番号2369の塩基CをTに変換した。この塩基置換により、人工合成されたDNA中の、EGFRの790番のアミノ酸に対応するコドンがスレオニン(T)のものからメチオニン(M)のものに置換される。得られた人工合成遺伝子は、EGFR codon790 DNAと命名し、変異型遺伝子として用いた。この変異をEGFR_T790Mと称す。当該事例においては、T790Mの部分でミスマッチ塩基を設定できる。また野生型遺伝子の塩基配列を有するDNAとして、ヒト細胞HL60よりゲノムDNAを調製した。
配列表の配列番号1及び2に示した塩基配列を有する2種のプライマー EGFR_T790M_F及びEGFR_T790M_Rを常法により調製した。次に、EGFR遺伝子の、塩基番号2369の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列表の配列番号3記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを常法により調製した。当該オリゴヌクレオチドは、その3’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、3’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド T790M_NucG−1と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、EGFRの野生型遺伝子のマイナス鎖とハイブリダイズすると塩基番号2369(プラス鎖)のCと相補的なGの位置でG−Gのミスマッチを生じる。一方、塩基番号2369がTに置換された変異型遺伝子のマイナス鎖とハイブリダイズすると当該Tに相補的なAの位置でG−Aのミスマッチを生じる。
EGFR codon790 DNAを特異的に検出するためのプローブとして、EGFR codon790 DNA上の、EGFR遺伝子の塩基番号2369に相当する塩基から3’側方向に1塩基、5’側方向に8塩基伸ばした領域のマイナス鎖の塩基配列を有し、かつ5’側末端から4塩基目のDNAをRNAに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドの5’末端にEclips quencherを、3’末端にFAM色素を結合させた。こうして作製されたキメラオリゴヌクレオチドプローブをT790M_detect−1と命名した。当該T790M_detect−1の塩基配列を配列表の配列番号4に示す。
実施例1-(1)で調製したHL60ゲノムDNAならびにEGFR codon790 DNAを50,000コピー:500コピー(=100:1)、50,000コピー:50コピー(=1000:1)および50,000コピー:5コピー(=10,000:1)で混合したDNAサンプルを調製した。HL60ゲノムDNA50,000コピーのDNA量としては、約185ngになる。また、対照として、HL60ゲノムDNAのみのものも調製した。これらのサンプルを鋳型として使用した。
(1)検出用テンプレートの準備
GenBank accession No.NC_000007で公開されているHuman EGFRのCDS配列情報からプライマー EGFR_L858R_F及びEGFR_L858R_Rに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域の塩基配列を含有するDNAを人工合成した。この際、EGFR遺伝子における塩基番号2573の塩基TをGに変換した。配列を人工合成した。この塩基置換により、人工合成されたDNA中の、EGFRの858番目のアミノ酸に対応するコドンがロイシン(L)のものからアルギニン(R)のものに置換される。得られた人工合成遺伝子は、EGFR codon858 DNAと命名し、変異型遺伝子として用いた。この変異をEGFR_L858Rと称す。当該事例においては、L858Rの部分でミスマッチ塩基を設定できない。また野生型遺伝子は、実施例1で調製したヒト細胞HL60ゲノムDNAを用いた。
配列表の配列番号5及び6に示した塩基配列を有する2種のプライマー EGFR_L858R_F及びEGFR_L858R_Rを常法により調製した。次に、EGFR遺伝子の塩基番号2573を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列番号7記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その3’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、3’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド EGFR_L858R_sup_p3と命名した。当該EGFR_L858R_sup_p3の塩基配列を配列表の配列番号7に示す。前記オリゴヌクレオチドは、EGFRの野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号2575のGの位置でG−Tのミスマッチを生じる。一方、塩基番号2573がGに置換された変異型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズした場合には、当該Gの位置でG−Aのミスマッチを生じ、さらにその3’側2塩基目(塩基番号2575)のGの位置でもG−Tのミスマッチを生じる。
EGFR codon858DNAを特異的に検出するためのプローブとして、当該DNA上の、EGFR遺伝子の塩基番号2573に相当する塩基から3’側方向に1塩基、5’側方向に9塩基伸ばした領域の相補鎖の配列を有し、かつ5’側末端から3塩基目のDNAをRNAに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの5’末端にEclips quencherを、3’末端にFAM色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをEGFR_L858R_P2と命名した。当該EGFR_L858R_P2の塩基配列を配列表の配列番号8に示す。
HL60ゲノムDNAならびにEGFR codon858 DNAを50,000コピー:500コピー(=100:1)、50,000コピー:50コピー(=1000:1)および50,000コピー:5コピー(=10,000:1)で混合したDNAサンプルを調製した。また対照にはHL60ゲノムDNAのみを使用した。HL60ゲノムDNA50,000コピーのDNA量としては、約185ngになる。
(1)酸性高分子物質存在下における変異検出方法の検討
実施例2(4)で調製したものと同じ一連のDNAサンプルを調製した。同様にHL60ゲノムDNAならびにEGFR codon858 DNAを5,000コピー:500コピー(=10:1)、5,000コピー:50コピー(=100:1)および5,000コピー:5コピー(=1,000:1)で混合したDNAサンプルを調製した。さらに、対照として、鋳型DNAを含まないサンプルも調製した。HL60ゲノムDNA5,000コピーのDNA量としては、約18.5ngになる。
リアルタイムPCR検出の結果を図3に示す。即ち、図3は本発明の変異型遺伝子検出方法における酸性高分子物質の効果を示す図であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はPCRサイクル数を示す。蛍光曲線は、鋳型DNAなし(N.C.)と変異型遺伝子のコピー数(5、50及び500コピー)を示す。図3(A−1)、(B−1)、(C−1)及び(D−1)はHL60ゲノムDNAが50,000コピーの場合、図3(A−2)、(B−2)、(C−2)及び(D−2)はHL60ゲノムDNAが5,000コピーの場合を示す。図3(A)がアルギン酸ナトリウム非存在下の場合、(B)は56μg/mlのアルギン酸ナトリウム存在下の場合、(C)は140μg/mlのアルギン酸ナトリウム存在下の場合及び(D)は168μg/mlのアルギン酸ナトリウム存在下の場合での効果を示す。いずれの濃度においてもアルギン酸非存在下の場合に比べて検出効率が増大していることが確認できた。特に、鋳型DNA量が少ない(HLゲノムDNAが5,000コピー)場合に効果が大きいことが確認できた。このことから、本発明の検出方法で酸性高分子物質を組み合わせることにより、検体由来のDNA量が少なくても効率よく変異型遺伝子を検出できることが確認できた。
酸性高分子物質の効果について、さらに検討した。反応液は以下のようにして調製した。即ち、CycleavePCR Reaction Mix(タカラバイオ社製)を使用して5コピー(0.16fg)のEGFR codon790 DNA、112nMのNucSタンパク質、0.2μMのT790M_NucG−1、各0.2μMのEGFR_T790M プライマー対、0.2μMのT790M_detect−1並びに最終濃度140μg/mlのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量25μlの反応液を調製した。本反応液を反応液4とした。さらに、反応液4からNucSタンパク質及びアルギン酸ナトリウムを除いた反応液1、反応液4からNucSタンパク質を除いた反応液2、反応液4からアルギン酸ナトリウムを除いた反応液3を調製した。リアルタイムPCR検出は、実施例1記載の条件で行った。
本発明の方法を用いたEGFR遺伝子エキソン19の欠失変異検出について検討した。本実施例では、標的核酸はEGFR_19_delE746−A750 DNA、非標的核酸はHuman genomic DNA(タカラバイオ社製)になる。
(1)検出用テンプレートの準備
GenBank accession No.NC_000007で公開されているHuman EGFRのCDS配列情報からプライマー EGFR_19_delE746−A750_F及びEGFR_19_delE746−A750_Rに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域で塩基番号の2236番目〜2250番目までが欠失した塩基配列を含有するDNAを人工合成した。この塩基欠失により、人工合成されたDNA中の、EGFRの746番目〜750番目までのアミノ酸が欠失していることになる。得られた人工合成遺伝子は、EGFR_19_delE746−A750 DNAと命名し、変異型遺伝子として用いた。
配列表の配列番号9及び10に示した塩基配列を有する2種のプライマー EGFR_19_delE746−A750_F及びEGFR_19_delE746−A750_Rを常法により調製した。次に、EGFR遺伝子の欠失領域にハイブリダイズ可能な、配列番号11記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その3’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、3’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド EGFR_19_delE746−A750 oligo−7と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、EGFRの野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号2245番目のGの位置でG−Gのミスマッチを生じる。一方、欠失変異型遺伝子のプラス鎖には、ハイブリダイズしない。
EGFR_19_delE746−A750 DNAを特異的に検出するためのプローブとして、当該DNA上の、EGFR遺伝子の塩基番号2228番目〜2235番目並びに2251番目〜2253番目の領域に対する相補鎖を有し、かつ5’側末端から3塩基目のDNAをRNAに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの5’末端にEclips quencherを、3’末端にFAM色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをEGFR_2236−2250delと命名した。当該EGFR_2236−2250delの塩基配列を配列表の配列番号12に示す。
Human genomic DNAならびにEGFR_19_delE746−A750 DNAを50,000コピー:500コピー(=100:1)、50,000コピー:50コピー(=1000:1)および50,000コピー:5コピー(=10,000:1)で混合したDNAサンプルを調製した。また対照にはHuman genomic DNAのみを使用した。Human genomic DNA50,000コピーのDNA量としては、約185ngになる。
本発明の方法を用いたk−ras遺伝子コドン12及びコドン13の点突然変異検出について検討した。本実施例では、標的核酸はk−ras遺伝子コドン12の点突然変異体、及びk−ras遺伝子コドン13の点突然変異体、非標的核酸はHL60ゲノムDNAになる。
(1)検出用テンプレートの準備
GenBank accession No.NC_000012.12で公開されているHuman K−ras遺伝子情報から配列表の配列番号13及び14記載の塩基配列を有するk−rasG12_F及びk−rasG12_Rプライマーを化学合成した。また、前記プライマーの塩基配列に挟まれた領域の塩基配列を有するDNAであって、コドン12の点突然変異により当該コドンのアミノ酸がグリシンからセリン、グリシンからシステイン、グリシンからアルギニン、グリシンからアスパラギン酸、グリシンからバリン並びにグリシンからアラニンになったものも人工合成した。これらの人工合成DNAは、それぞれT−Vector pMD20(タカラバイオ社製)のT−cloning site部位に常法により挿入した。このようにして調製したプラスミドは、k−rasG12S DNA、k−rasG12C DNA、k−rasG12R DNA、k−rasG12D DNA、k−rasG12V DNA並びにk−rasG12A DNAと命名し、それぞれ変異型遺伝子として用いた。
k−ras遺伝子コドン12及びコドン13を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列番号15記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その3’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、3’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド k−rasG12/13_S1と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号16記載の塩基配列を有するk−ras コドン12の野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号35番目のGの位置でG−Gのミスマッチを生じる。一方、k−rasG12S DNAのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号35番目のGの位置でG−Gのミスマッチが生じ、さらに塩基番号34番目のAの位置でA−Cのミスマッチを生じる。k−rasG12C DNAのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号35番目のGの位置でG−Gのミスマッチが生じ、さらに塩基番号34番目のTの位置でT−Cのミスマッチを生じる。k−rasG12R DNAのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号35番目のGの位置でG−Gのミスマッチが生じ、さらに塩基番号34番目のCの位置でC−Cのミスマッチを生じる。k−rasG12D DNAのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号35番目のAの位置でA−Gのミスマッチが生じる。k−rasG12V DNAのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号35番目のTの位置でT−Gのミスマッチが生じる。k−rasG12A DNAのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、ミスマッチが生じない。
Human genomic DNAならびにk−rasG12C DNAを50,000コピー:50コピー(=1000:1)で混合したDNAサンプルを調製した。また対照にはHuman genomic DNAのみを使用した。Human genomic DNA50,000コピーのDNA量としては、約185ngになる。
実施例2のL858R変異を有するEGFR遺伝子の特異的検出方法をモデルとして、酸性高分子物質の効果についてさらに検討した。本実施例では、酸性高分子物質として、糖鎖骨格を有するコンドロイチン硫酸Bの塩及び糖鎖骨格を有さないポリアクリル酸について検討した。
(1)酸性高分子物質の影響-1
CycleavePCR Reaction Mixを用いて、実施例3(1)で調製したDNAサンプル、125nMのNucSタンパク質、0.2μMのEGFR_L858R_sup_p3及び各0.2μMのEGFR_L858R プライマー対、0.2μMのEGFR_L858R_sup_P2、ならびに終濃度30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml並びに60μg/mlのコンドロイチン硫酸Bナトリウム(シグマ-アルドリッチ社製)を含む最終容量25μlの反応液を調製した。比較のため、同じ組成でコンドロイチン硫酸Bナトリウムを含まない反応液も調製した。
次に糖鎖骨格を有さない酸性高分子物質として、ポリアクリル酸5000(和光純薬社製)を使用した場合について検討した。反応液は、上記(1)の組成で、コンドロイチン硫酸Bナトリウムの代わりに、終濃度1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml並びに5μg/mlのポリアクリル酸5000を含む最終容量25μlの反応液を調製した。比較のため、同じ組成でポリアクリル酸5000を含まない反応液も調製した。
本発明の方法を用いた標的核酸の定量方法について検討した。標的核酸は、EGFR_L858Rとした。EGFR遺伝子の別の領域を陽性対照核酸とした。即ち、配列表の配列番号17及び18記載の塩基配列を有するEGFRL858R_IC2_F及びEGFRL858R_IC2_Rプライマー対を常法により合成した。また、当該陽性対照核酸を特異的に検出するためのプローブとして、配列表の配列番号19記載の塩基配列を有し、かつ5’側末端から3塩基目のDNAをRNAに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの5’末端にEclips quencherを、3’末端にFAM色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをEGFRL858R_IC2_P2と命名した。
本発明の方法におけるPCNAの効果について検討した。反応液組成は、陽性対照核酸検出用として配列表の配列番号20記載の塩基配列を有し、かつ5’側末端から3塩基目のDNAをRNAに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブのEGFRL858R_IC2_P3、100μg/mlのコンドロイチン硫酸Bナトリウム、国際公開WO2007/004654号パンフレット 実施例記載の方法で調製した8μg/mlのPufPCNA D143R変異体(PCNA13)並びに375nMのNucS蛋白質を含む以外は、実施例8記載のものと同様にした。また、リアルタイムPCR検出は、実施例3の条件と同じにした。
SEQ ID NO: 2: EFGR_T790M_R primer
SEQ ID NO: 3: T790M_NucG-1. 3'-end is modified by amino linker (NH2).
SEQ ID NO: 4: T790M_detect-1. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 4 is RNA.
SEQ ID NO: 5: EGFR_L858R_F primer
SEQ ID NO: 6: EGFR_L858R_R primer
SEQ ID NO: 7: EGFR_L858R_ sup_p3. 3'-end is modified by amino linker (NH2).
SEQ ID NO: 8: EGFR_L858R_P2. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 9: EGFR_19_delE746-A750_F primer
SEQ ID NO: 10: EGFR_19_delE746-A750_R primer
SEQ ID NO: 11: EGFR_19_delE746-A750 oligo-7. 3'-end is modified by amino linker (NH2)
SEQ ID NO: 12: EGFR_2236-2250del. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 13: k-rasG12_F primer
SEQ ID NO: 14: k-rasG12_R primer
SEQ ID NO: 15: k-rasG12/13_s1. 3'-end is modified by amino linker (NH2)
SEQ ID NO: 16: SEQ IDDNA fragment containing k-ras codon 12 and codon 13 regions
SEQ ID NO: 17: EGFRL858R_IC2_F primer
SEQ ID NO: 18: EGFRL858R_IC2_R primer
SEQ ID NO: 19: EGFRL858R_IC2_P2. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 20: EGFRL858R_IC2_P3. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
Claims (16)
- 標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
(i)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド;及び
(ii)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
を試料と接触させる工程を含む方法。 - 非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基置換を生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズした際に前記ミスマッチに相当するミスマッチと少なくとももう1つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 非標的核酸とハイブリダイズさせた際に1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記ミスマッチに相当するミスマッチともう1つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする請求項2記載の方法。
- 標的核酸とオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた際に生じる2つのミスマッチが、隣接するか又は5塩基までの間隔で位置していることを特徴とする請求項3記載の方法。
- 非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の挿入がなされた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該挿入がなされた塩基配列を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも1つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の欠失が生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該欠失が生じた部位を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも1つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項1記載の方法。
- ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが耐熱性菌由来のポリペプチドもしくはその変異体である請求項1〜6いずれか1項に記載の方法。
- 酸性高分子物質存在下で行われることを特徴とする請求項1〜7いずれか1項に記載の方法。
- 標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に増幅する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法;
(1)請求項1〜8いずれか1項に記載の方法で試料中の非標的核酸を切断する工程;及び
(2)標的核酸を増幅する工程。 - 標的核酸の増幅がPCRによって行われることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法;
(1)請求項9又は10記載の方法で標的核酸を選択的に増幅する工程;及び
(2)上記工程(1)と同時に又は工程(1)の後で、標的核酸を検出する工程。 - 標的核酸の検出がサイクリング・プローブ法又はTaqMan法で行われることを特徴とする請求項11記載の方法。
- 請求項9〜12いずれか1項に記載の方法のための組成物であって、
(a)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド;
(b)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;
(c)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(d)DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有する組成物。 - 請求項9〜12いずれか1項に記載の方法のためのキットであって、
(a)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド;
(b)少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー;
(c)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(d)DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有するキット。 - さらに酸性高分子物質を含むことを特徴とする請求項13記載の組成物又は請求項14記載のキット。
- 酸性高分子物質存在下で標的核酸と、標的核酸と少なくとも1塩基が相違する塩基配列を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
(i)酸性高分子物質;
(ii)ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド;及び
(iii)非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも1つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法。
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